CN114112870A - 测定方法、测定装置及含可执行测定程序的存储介质 - Google Patents

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Abstract

本发明的技术问题在于提供一种获取不使用荧光染料制备的测定试样中含有的脂质粒子的相关信息的测定方法、测定装置及含可执行测定程序的存储介质。本发明通过一种测定不使用荧光染料制备的测定试样中的粒子数的测定方法解决技术问题，所述测定方法包括如下内容：基于通过流式细胞仪从所述测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。

Description

测定方法、测定装置及含可执行测定程序的存储介质
技术领域
本说明书记载一种测定方法、测定装置及含可执行测定程序的存储介质。
背景技术
专利文献1中记载了如下内容：在自动血细胞分析装置中通过流式细胞仪对血细胞进行计算时，用荧光染料对会产生荧光强度的差异的血细胞进行染色，利用散射光和荧光的强度差分别对骨髓有核细胞（Bone marrow nucleated cell）、成红细胞类细胞及白细胞类（White Blood Cells）细胞进行分类并计算。此外，专利文献1中记载，即使测定试样中含有脂质粒子，由于脂质粒子不会被荧光染料染色，所以能利用荧光强度的差异来区分脂质粒子和骨髓有核细胞、成红细胞类细胞及白细胞类细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-223791号。
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，在不使用荧光染料的测定模式中，测定试样中含有脂质粒子的话，有核细胞的计算结果有时会受到脂质粒子的影响。
本发明的技术问题在于提供一种在不使用荧光染料制备的测定试样中含有脂质粒子的情况下，也能提供测定试样中含有的粒子数的准确的测定结果的测定方法、测定装置及测定程序。
解决技术问题的技术手段
本发明的一实施方式涉及一种测定不使用荧光染料制备的测定试样中的粒子数的测定方法。如图2所示，所述测定方法包括如下内容：基于由流式细胞仪从所述测定试样中含有的各个粒子获取的、各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
本发明的一实施方式涉及一种测定不使用荧光染料制备的测定试样中的粒子数的测定装置（200）。如图7所示，测定装置（200）具备流式细胞仪（230）和处理部（201）。处理部（201）基于由流式细胞仪（230）从所述测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
本发明的一实施方式涉及一种测定不使用荧光染料制备的测定试样中的粒子数的测定程序。如图2所示，在使计算机执行时，所述测定程序执行如下步骤：基于由流式细胞仪从所述测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
通过上述实施方式能从由流式细胞仪获取的各粒子的与散射光相关的数个测定值获取测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
发明效果
根据本发明，基于与光散射相关的特征值来获取测定试样中含有的脂质粒子的相关信息，由此，即使在通过不使用荧光染料的测定模式对含有脂质颗粒的测定试样进行测定的情况下，也能提供准确的粒子数的测定结果。
附图说明
图1为散点图示例图；（A）示出侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）和前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图；（B）为通过前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）和前向散射光信号的脉冲峰（FSC）表示的散点图；（C）示出脂质粒子点得到识别的散点图；
图2为脂质粒子的相关信息的获取方法的示例图；（A）示出以x轴方向作为前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW），以y轴方向作为前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图；（B）示出变换后的二维点阵图；（C）示出将（B）投影于第1主成分方向上所得到的柱状图；
图3（A）为从含有脂质粒子的测定试样得到的柱状图的示例图；（B）为从不含有脂质粒子的测定试样得到的柱状图的示例图；
图4为改变抽取出的脂质粒子点群的颜色（对照）并进行显示的示例图；
图5（A）示出有核细胞数多的样本中的侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图；（B）示出有核细胞数多的样本中的前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图；（C）示出对（B）的散点图进行旋转并投影所得到的柱状图；
图6示出测定系统100的外观；
图7示出测定系统100的硬件结构；
图8示出FCM检测部230的结构；
图9示出测定程序的处理的流程；
图10示出测定程序的解析处理的流程；
图11示出脂质粒子区域的设定及脂质粒子点的抽取处理的流程；
图12（A）示出各样本的最大极大值、极大值、分部分离位置；（B）示出含有脂质粒子的4样本的对策实施前和对策实施后的侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图；
图13（A）示出各数据组中脂质粒子阳性样本的频率；（B）示出脂质粒子阳性样本中，脂质粒子含量最少的样本（#6）与脂质粒子含量最多的样本（#7）的侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图、以及前向散射光信号的脉冲宽度-前向散射光信号的脉冲峰的散点图；
图14示出针对外周血样本，在DIFF模式下测定到的白细胞数（WBC-D）、在一般的CBC模式下测定到的白细胞数（WBC-C修正前）、以及用本实施方式的测定方法修正后的血细胞数（WBC-C修正后）。
具体实施方式
1．测定方法
（1）测定方法概要
本发明的一实施方式涉及一种测定测定试样中的粒子数的测定方法。本实施方式的粒子数的测定使用测定系统100进行，其是具备后述图8所示的流式细胞仪（FCM）检测部230的全自动血细胞分析装置。在本实施方式中，在全自动血细胞分析装置中的CBC测定模式下进行粒子数的测定，此时作为计算对象的粒子是白细胞。后述图7所示的测定系统100能够通过用户从包括CBC测定模式以及白细胞分类（DIFF）测定模式在内的数种测定模式之中选择的一种或数种测定模式来对样本中含有的血细胞进行计算。在测定系统100中，测定装置200所具备的试样制备部220与测定模式相对应地使用不同的试剂制备测定试样。在DIFF测定模式中制备的测定试样含有用于染色粒子的荧光染料，具体来说含有荧光染色（polymethine）类染料，而在CBC测定模式中制备的白细胞测定用测定试样不含有荧光染料。在本实施方式中，就如下例子进行说明：测定系统100在CBC测定模式中通过试样制备部220制备不含有荧光染料的白细胞测定用测定试样，在不使用荧光参数的情况下对测定试样中含有的白细胞和脂质粒子进行分部分离。
在本测定方法中，使用后述图8所示的FCM检测部230，对在流动室230j流动的测定试样中的粒子照射激光并检测从粒子产生的光散射，对测定试样中的粒子的数量进行计算。有数个与光散射相关的参数。参数包括比如前向散射光、侧向散射光等以散射方向来定义的参数。前向散射光指光照射于粒子时相对于照射光的行进方向向前方散射的光。侧向散射光指光照射于粒子时相对于照射光的行进方向向侧方散射的光。此外，其他的光散射相关参数有轴向光损失。轴向光损失指对粒子横穿激光时的光散射所造成的光接收部侧的光接收量的减少进行量化的参数。针对各光散射参数，获取体现信号的随时间变化的波形并解析各个粒子所对应的脉冲的形状，从而得到脉冲峰（也称峰高）以及脉冲宽度（也称分布宽度）等数值作为特征值。前向散射光信号的脉冲峰主要是体现粒子大小的特征值。侧向散射光信号的脉冲峰是体现粒子内部结构的复杂程度的特征值。前向散射光信号的脉冲宽度是示出粒子穿过流动室内有光照射的区域的时间的特征值，反应粒子的长度。
比如，通过散点图（二维点阵图）示出针对各粒子获取的光散射的特征值。图1（A）示出了将在CBC测定模式下制备的白细胞测定用试样作为测定试样供至FCM检测部230，并在CBC测定模式下测定到的粒子群的侧向散光信号的脉冲峰（SSC）和前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图。即，各点示出了以x轴方向作为侧向散射光信号的脉冲峰（SSC），以y轴方向作为前向散射光信号的脉冲峰（FSC）时的各粒子的坐标。图1（A）所示被点虚线围起的区域内所包含的点以浅色示出，在CBC测定模式下作为“白细胞数”计数。以下有时将被点虚线围起的区域称为“计数区域”。图1（B）是通过前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）和前向散射光信号的脉冲峰（FSC）示出的散点图。即，各点示出了以X轴方向作为前向散射光信号的脉冲峰（FSCW），以Y轴方向作为前向散射光信号的脉冲峰（FSC）时各粒子的坐标。
图1（A）中虚线X所围起的区域内的点全部以浅色示出。如图1（C）所示，本发明人发现，包括原本应该被分类为脂质粒子的、以深色示出的点（称为脂质粒子点）在内的区域与白细胞计数区域重合。在图1（A）中，脂质粒子点与白细胞计数区域重合未能进行区分。因此脂质粒子点也有可能被作为白细胞数计数。此外，在图1（B）中，以点虚线Y示出的虚线X内的白细胞点的分布区域中，脂质粒子点与白细胞点也是重合的。
为了检测出与白细胞点的分布区域重合的脂质粒子点，在本测定方法中，从测定试样中含有的各个粒子获取上述与光散射相关的数个特征值后，基于获取的与光散射相关的数个特征值获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
参照图2，对脂质粒子的相关信息的获取方法的例子进行说明。为方便起见，利用前向散射光信号的脉冲宽度的测定值和前向散射光信号的脉冲峰的测定值说明脂质粒子的相关信息的获取方法。
图2（A）是以x轴方向作为前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW），以y轴方向作为前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图。图2（A）所示的各点的坐标以（x，y）＝（前向散射光信号的脉冲宽度的测定值，前向散射光信号的脉冲峰的测定值）来体现。
作为第1步骤，通过旋转矩阵变换各点的二维坐标（x，y），得到二维坐标（x’，y’）作为变换后的坐标。
变换式如下所示：
【数1】
Figure DEST_PATH_IMAGE001
在此，θ表示旋转矩阵的旋转角度。
变换后的二维坐标（x’，y’）的二维点阵图为图2（B）所示的图表。
设定旋转角度θ使得变换后的坐标群（coordinate group）的方差最大。更具体来说，θ由维度变换，优选由主成分分析（principal component analysis）来决定。通过主成分分析进行维度变换时，x’轴方向表示第1主成分（PCA1），y’轴方向为第2主成分（PCA2）。
此外，在变换前的二维点阵图中，各轴的标尺（scale）例如以从0至255的数值段表示，变换后的x’轴的标尺例如把从0至255的数值段的显示范围限制为从0到50的数值段。
可以针对各测定试样决定旋转角度θ，也可以提前设定旋转角度θ，针对所有测定试样适用同样的旋转角度。提前设定旋转角度θ时能设定为10.2°至10.5°左右。旋转方向在旋转角度θ为正值时意指向逆时针方向旋转，旋转角度θ为负值时意指向顺时针方向旋转。
通过进行上述变换本发明人发现，在图2（B）所示的变换后的二维坐标（x’，y’）的二维点阵图上划x’轴上的边界线A，由此能够将在图2（A）中与白细胞计数区域重合的脂质粒子点分离为相对于边界线A位于x’轴高值侧的白细胞计数区域和相对于边界线A位于x’轴低值侧（原点侧）的脂质粒子点的区域。
作为第2步骤，将变换后的二维点阵图投影于第1主成分方向。投影于第1主成分方向意指使变换后的二维坐标（x’，y’）中所有的点的y’为“0”。由此得到图2（C）所示的柱状图。在图2（C）的柱状图划边界线A，由此能分离位于x’轴高值侧的白细胞计数区域和相对于边界线A位于x’轴低值侧的脂质粒子点的区域，与图2（B）所示的二维点阵图相比能更清晰地进行分辨。并且，图2（B）所示的边界线A和图2（C）所示的边界线A作为白细胞计数区域与脂质粒子点的区域的边界线，以相同的虚线示出。
作为第3步骤，利用在第2步骤得到的柱状图判定脂质粒子群是否存在。利用图3说明第3步骤的例子。图3（A）是从含有脂质粒子的测定试样得到的柱状图的例子，图3（B）是从不含有脂质粒子的测定试样得到的柱状图的例子。
比如，在图3（A）和图3（B）的柱状图的右端侧对在第2步骤得到的柱状图进行峰（a）的解析。图3（A）和图3（B）中所示的▼示出通过峰解析获取的峰位置。
接着，就图3（A）和图3（B）的柱状图的左端（数值段0）所示的（b）确定检测出的峰的峰位置之中的最高峰位置。最高峰位置是来自于作为原本的目标的细胞群的峰。接下来，从柱状图的左端（数值段0）寻找至最高峰位置之间是否有另外的峰Q。在图3（A）中，从数值段0至最高峰位置的数值段之间有另外的峰Q，因此能判定为有脂质粒子群。此外，在图3（B）中，从数值段0至最高峰位置的数值段之间没有另外的峰Q，因此能判定为没有脂质粒子群。
进一步地，就图3（A）和（B）的柱状图的左端（数值段0）所示的（b）判定为有脂质粒子群时，就图3（A）的柱状图的左端（数值段0）和右端之间所示的（c）寻找用于分部分离细胞群和脂质粒子群的底（极小值）。优选在最高峰位置的数值段、和图3（A）的柱状图的左端（数值段0）所示的（b）的寻找中检测出的另外的峰Q的位置的数值段之间寻找底（极小值）。以底（极小值）作为分部分离位置，由此能从变换前的二维点阵图抽取脂质粒子点群。
在第4步骤中，针对在第3步骤抽取的脂质粒子点群生成脂质粒子的相关信息。图4中示出在侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）和前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的二维点阵图中变更抽取的脂质粒子点群的颜色深浅后进行显示的例子。与白细胞数计数区域重合的脂质粒子点群以深色示出且能够得到识别。通过对该被识别出的脂质粒子点进行计数从而生成脂质粒子的相关信息。脂质粒子的相关信息包括测定的粒子群中脂质粒子的有无、或含量等所相关的定性、半定量或定量信息。优选脂质粒子的相关信息是测定的粒子群中的脂质粒子的存在比率或脂质粒子的数量。
在第5步骤中，基于脂质粒子的相关信息生成基于脂质粒子是否存在的判定结果的信息、或从白细胞数计数中去掉脂质粒子点群的计数后的白细胞数计数的修正值。
基于脂质粒子是否存在的判定结果的信息是关于白细胞数的测定值的可靠性的信息。关于白细胞数的测定值的可靠性的信息是表示白细胞数的测定值中是否包含了脂质粒子的计数的标签。此外，关于白细胞数的测定值的可靠性的信息可以是半定量或定量表示被计算的白细胞中含有的脂质粒子的量的标签。半定量比如能以脂质粒子含量“多”或“少”等来进行体现。或者，关于白细胞数的测定值的可靠性的信息可以是与脂质粒子的相关信息相对应的白细胞数的测定值的可靠度。比如，未检测出脂质粒子时或脂质粒子少时能示出表示“可靠度高”的标签。此外，脂质粒子为中等程度至高时能示出表示“可靠度低”的标签。
在提前设定的一定值，比如所述脂质粒子的存在比率为检测出的所有粒子的3%以上时，或所述脂质粒子的数量为白细胞数的一定比例比如为3%以上时输出关于白细胞数的测定值的可靠性的信息。优选在脂质粒子的数量为50以上，且所述脂质粒子的存在比率为所有粒子数的3%以上时，或在脂质粒子的数量为50以上，且所述脂质粒子的数量为白细胞数的3%以上时输出关于白细胞数的测定值的可靠性的信息。
（2）变形例
如图5（A）和图5（B）所示，在进行上述第3步骤所示的脂质粒子群的检测时，测定试样中含有的有核细胞数多的情况下尤其是淋巴细胞数多的情况下，有时难以对淋巴细胞计数区域的峰和脂质粒子的峰加以区分（参照图5（C））。此时，优选寻找脂质粒子的峰时将寻找范围限定在提前设定的范围内，并生成脂质粒子的相关信息。脂质粒子的峰多出现于相较于淋巴细胞的峰显现的区域的PCA1轴低值侧，因此可以将脂质粒子的峰的寻找范围限定为淋巴细胞的极大值出现区域的低值侧进行寻找。
并且，在前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）与前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的二维点阵图中，有时脂质粒子点出现的区域会出现感染了疟原虫的红细胞。在侧向散射光信号的脉冲峰（FSC）与前向散射光信号的脉冲峰（SSC）的二维点阵图中，感染了疟原虫的红细胞能与其他粒子进行辨别且能计数，所以能从脂质粒子的计数中减去感染了疟原虫的红细胞的计数，从而获取脂质粒子的相关信息。
2.测定系统
2-1.测定系统的结构
本发明的一实施方式涉及测定含有血细胞的测定试样中的细胞数的测定系统100（以下称为“测定系统100”）。在图6示出本实施方式的测定系统100的外观。测定系统100具备测定装置200和触摸屏式的显示器300。在图7示出测定系统100的硬件结构。测定系统100与包括输入部311和输出部312的显示器300连接。
（2）测定装置200的硬件结构
在测定装置200中，样本吸移部210、试样制备部220、FCM检测部230、处理部201、存储部202、输入接口（I/F）206以及输出接口（I/F）207通过总线209互相连接且能通信。存储部202存储包括所述测定值、旋转矩阵的旋转角度θ、用于算出旋转角度θ的算法、峰解析程序在内的测定程序202b。
样本吸移部210介由喷嘴从收容有样本的样本容器吸移样本，并分装至试样制备部220所具备的反应槽。试样制备部220向反应槽供给试剂并混合样本和试剂来制备测定试样。试样制备部220使用的试剂根据测定模式而不同。试样制备部220在CBC测定模式中为了制备用于计算白细胞的测定试样，将稀释液和溶血剂作为试剂与样本混合。试样制备部220在DIFF测定模式中为了制备用于分类计算白细胞的测定试样，将稀释液、溶血剂、荧光染料作为试剂与样本混合。在CBC测定模式中制备的测定试样不含有荧光染料。
处理部201是测定装置200的CPU。处理部201也可以与GPU协同作业。处理部201与存储在存储部202的运行系统（OS）202a协同作业执行测定程序202b，并对获取的数据进行处理。
存储部202由硬盘构成。存储部202记录有由处理部201执行的测定程序202b及用于此的数据。ROM在测定装置200启动时存储由处理部201执行的启动程序、与测定装置200的硬件的作业相关的程序以及设定。
输入I/F206由串行接口、并行接口及模拟接口等构成。输入I/F206从输入部311受理文字输入、点击、语音输入等。受理的输入内容存储至存储部202。
输入部311由触摸屏、键盘、鼠标、手写平板、麦克风等构成，对测定装置200进行文字输入或语音输入。输入部311可以从测定装置200的外部进行连接，也可以与测定装置200呈一体。
输出I/F207比如由与输入I/F206相同的接口构成。输出I/F207将处理部201生成的信息输出至输出部312。输出I/F207将处理部201生成并存储在存储部202的信息输出至输出部312。
输出部312比如由显示器、打印机等构成，显示自FCM检测部230发送的检测结果以及测定装置200中的各种操作窗口、分析结果等。
存储部202中比如安装有美国微软公司制造销售的Windows（注册商标）等提供图形用户界面环境的运行系统。本实施方式所涉及的应用程序在所述操作系统上进行作业。即，测定装置200可以是个人计算机等。
也可以设计为：构成测定系统100的测定装置200的FCM检测部230配置在别处，这些构件通过网络连接。
（3）FCM检测部
图8示出FCM检测部230的硬件结构。在本说明书中，有时将FCM检测部230称为流式细胞仪230。
如图8所示，FCM检测部230具备流动室230j、检测部230a、照射光学系统230e、光接收光学系统230k、信号处理电路230p。
流动室230j供试样制备部220制备的测定试样流动。从激光二极管230i射出的激光照射在流动室230j流动的测定试样。激光照射测定试样时，从测定试样中的粒子产生光。检测部230a的光检测器230b～230d分别接收从测定试样中的粒子产生的前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及侧向荧光（SFL），由此从被照射了激光的测定试样中的粒子获取光学信息。
照射光学系统230e具备准直透镜230f和聚光镜230g。准直透镜230f将从激光二极管230i射出的激光变换为平行光。聚光镜230g对变换为平行光的激光进行聚光并照射流动室230j。如此，照射光学系统230e使从激光二极管230i射出的激光照射在流动室230j流动的测定试样。激光照射测定试样时，从测定试样中的粒子产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
光接收光学系统230k具备束霖止器230I、聚光镜230m、分色镜230n以及分光滤光器230o。束霖止器230I遮断照射流动室230j的激光之中没有照射粒子而在流动室230j中透射的激光。光检测器230b是光电二极管。光检测器230b接收前向散射光（FSC）并输出与前向散射光（FSC）的强度相对应的电信号。
聚光镜230m对侧向散射光（SSC）进行聚光。分色镜230n反射侧向散射光（SSC）。光检测器230c是光电二极管。光检测器230c接收侧向散射光（SSC）并输出与侧向散射光（SSC）的强度相对应的电信号。光检测器230d是雪崩光电二极管。如此，光接收光学系统230k把从测定试样产生的光引导至检测部230a的光检测器230b～230d。在此，也可以将光检测器230b～230d设定为光电倍增管（photomultiplier tube）。
信号处理电路230p对从光检测器230b～230d输出的电信号实施一定的信号处理，由此分别获取与前向散射光（FSC）信号和侧向散射光（SSC）信号对应的特征值，即脉冲峰和脉冲宽度。具体来说，信号处理电路230p对从检测器230b随时间经过输出的前向散射光信号进行A/D转换,由此生成在第一轴取光接收强度、在第二轴取时间经过的数字值的信号波形，并从生成的数字信号波形剪取与各个粒子对应的脉冲波形。信号处理电路230p将剪取的脉冲波形的峰高作为前向散射光（FSC）信号的脉冲峰值，将脉冲波形之中超过阈值的部分的宽度作为前向散射光（FSC）信号的脉冲宽度分别进行输出。同样地，信号处理电路230p基于从光检测器230c随时间经过输出的侧向散射光（SSC）信号输出各个粒子的侧向散射光（SSC）的脉冲峰值。
3.测定程序
本发明的一实施方式涉及用于测定含有血细胞的测定试样中的细胞数的测定程序202b。利用图9～图11说明测定程序202b的处理的流程。
在图9所示的步骤S1中，图7所示的测定装置200的处理部201控制试样制备部220（参照图7）使其混合样本和不含有荧光染料的试剂从而制备测定试样。接着，在图9所示的步骤S2中，处理部201控制FCM检测部230（参照图7）使其向在流动室230j（参照图8）流动的测定试样照射激光。接下来，在步骤S3中，处理部201基于从被照射了激光的测定试样中的粒子获取的光学信息进行解析处理。
利用图10对步骤S3的处理进行更详细的说明。
在步骤S10中，处理部201从FCM检测部230针对每个粒子获取与散射光相关的数个参数的测定值。操作者从输入部311输入处置开始要求，处理部201受理该输入，从而开始该处理。
在步骤S11中，处理部201把在步骤S10获取的每个粒子的与光散射相关的特征值存储至存储部202。
在步骤S12中，处理部201基于在步骤S11中生成的特征值生成散点图。
在步骤S13中，从散点图分部分离白细胞数计数区域和其他区域，计算存在于白细胞数计数区域内的粒子数。
在步骤S14中，处理部201设定脂质区域并进行脂质粒子点的抽取。
利用图11对步骤S14的处理进行更详细的说明。
在步骤S141中，处理部201从散点图中抽取作为解析对象的、区域中包含的粒子的点群。
在步骤S142中，处理部201针对抽取的点群适用旋转矩阵来变换散点图上的坐标，进而将各点的坐标投影于与第1主成分对应的轴方向。该处理对应在上述1.中说明的第1步骤及第2步骤。
在步骤S143中，处理部201在通过步骤S142得到的柱状图中寻找是否存在数个峰，存在数个峰时决定用于抽取脂质粒子群的分部分离位置。该处理对应在上述1.中说明的第3步骤的前段。
在步骤S144中，处理部201基于相对于步骤S143中决定的提取位置而言的左方的区域的峰决定脂质粒子群。该处理对应在上述1.中说明的第3步骤的后段。
回到图10，进一步说明测定程序202b的处理。在步骤S15中，处理部201判定脂质粒子是否干涉了白细胞区域。在步骤S14中，在一定的范围内检测出脂质粒子群时，能认定为脂质粒子干涉了白细胞区域。用于判断为在一定的范围内检测出脂质粒子群的条件与在上述1.中输出与白细胞数的测定值的可靠性相关的信息时的条件相同。
在步骤S15中,判定结果为“否”时，处理部201进入步骤S19，在输出部312输出白细胞数并结束处理。
在步骤S15中,判定结果为“是”时，处理部201进入步骤S16，在输出部312输出辅助信息，即输出基于脂质粒子是否存在的判定结果的信息。该步骤对应在上述1.中说明的第4步骤。
接着，处理部201进入步骤S17，对在步骤S14中判定为脂质粒子的粒子的数量进行计数并生成脂质粒子的相关信息。
进而，处理部201进入步骤S18，处理部201生成从白细胞数计数中去掉脂质粒子点群的计数后的白细胞数计数的修正值。该步骤对应上述1.所示的第5步骤。
处理部201进入步骤S19，从输出部312输出白细胞数的修正值。
4.记录有计算机程序的存储媒介
执行步骤S10到步骤S19及步骤S141到步骤S144的处理的计算机程序可作为存储媒介等程序产品提供。所述计算机程序存储于硬盘、闪速存储器等半导体存储元件、光盘等存储媒介。关于程序在所述存储媒介的存储形式，只要所述控制部能读取所述程序就没有限制。
在图12示出在外周血样本#1、#2、#3、#4及#5适用本实施方式的测定方法后的结果。#5是未含有脂质粒子的样本，除此之外均是含有脂质粒子的样本。在图12（A）示出各样本的最大极大值（表示白细胞的峰）、极大值（表示脂质粒子的峰）、分部分离位置（最小极小值）。在5样本中最大极大值均为数值段14。此外，在含有脂质粒子的4样本中，极大值为数值段10或9。在含有脂质粒子的4样本中，分部分离位置均为数值段11。图12（B）示出含有脂质粒子的4样本的对策前和对策后的侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图。对策后，与白细胞分部分离重合的脂质粒子点得到识别并进行显示。
图13（A）示出各数据组中的脂质粒子阳性样本的频率。图13（B）示出脂质粒子阳性样本中脂质粒子的含量最少的样本（#6）与脂质粒子的含量最多的样本（#7）的侧向散射光信号的脉冲峰（SSC）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图、以及前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）-前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图。#6的脂质粒子含有比率为1.4%，脂质粒子的数量为53。#7的脂质粒子含有比率为14.3%，脂质粒子的数量为2295。由此，只要脂质粒子的数量至少为50就能输出辅助信息，即能输出基于脂质粒子是否存在的判定结果的信息。此外，由于白细胞计数的再现性不足3%，所以将输出辅助信息的脂质含量的阈值设为3%是没有问题的。
图14示出针对外周血样本#1、#2、#3及#4在进行荧光染色的DIFF模式下测定到的白细胞数（WBC-D）、在一般的CBC模式下测定到的白细胞数（WBC-C修正前）以及用本实施方式的测定方法修正后的白细胞数（WBC-C修正后）。在除了#1之外的样本中，WBC-C修正前的值与作为参照值的WBC-D的值偏差很大，但WBC-C修正后的值与WBC-D的值近似。WBC-C修正后的值的增加率为WBC-D的值的0.3%至2.5%，考虑到WBC的再现性的上限值为3%，所述WBC-C修正后的值的增加率是能充分容许的范围。
以上，根据本实施方式，能在不使用荧光染料的情况下分部分离白细胞和脂质粒子。由此，能不通过使用荧光染料的DIFF测定模式而仅通过不使用荧光染料的CBC测定模式准确计算含有脂质粒子的患者样本的白细胞数，或能在测定结果中附加样本中含有脂质粒子的的通知，能够控制检查成本并提供关于含有脂质粒子的样本的准确的检查结果。
在本说明书中测定方法没有限制。比如可以设计为：利用图1（B）示出的通过前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）与前向散射光信号的脉冲峰（FSC）表示的散点图来获取测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。此时，对在图1（B）中虚线内的脂质粒子点以点虚线示出的区域进行设门并计算出现在门内的粒子，从而能获取脂质粒子的相关信息。
作为其他例子，可以设计为：从通过旋转矩阵对图2（A）示出的前向散射光信号的脉冲宽度（FSCW）与前向散射光信号的脉冲峰（FSC）的散点图进行变换后的二维坐标的二维点阵图，获取测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。此时，能通过在作为二维坐标（x’，y’）的二维点阵图的图2（B）划边界线A，从而分离相对于边界线A位于x’轴高值侧的白细胞计数区域和相对于边界线A位于x’轴低值侧的脂质粒子点的区域。
在本说明书中，不限于通过用户从包括CBC测定模式和DIFF测定模式在内的数种测定模式选择的一种或数种测定模式来计算样本中含有的血细胞的例子。比如可以设计为仅通过CBC测定模式来计算样本中含有的血细胞。
在本说明书中，旋转角度θ没有限制。比如可以为8°到12°左右，优选为9°到11°左右，更优选为9.5°到10.8°左右，进一步优选为10.0°到10.6°左右。
在本说明书中，测定试样没有限制。比如可包括血液（外周血、动脉血、静脉血等）、体液（骨髄液、脑脊髓液、滑液等）的样本的原液或所述样本的稀释液。优选在有抗凝剂的存在下采取血液。
在本说明书中，粒子没有限制。比如，粒子中可包括细胞和非细胞性粒子。细胞意指来自采取了测定试样的受检者的细胞。细胞可包括红细胞、白细胞、血小板、幼稚红细胞（Immature red cell）、幼稚白细胞（Immature Leukocyte）、幼稚淋巴细胞（Immaturelymphoid cell）、微巨核细胞、肿瘤细胞（比如白血病细胞（leukemic cell）、恶性淋巴瘤细胞（malignant lymphoma cell）、多发性骨髓瘤等）、疟疾感染红细胞（Malaria-InfectedRed Blood Cell）等。非细胞性粒子可包括脂质粒子、细菌、真菌（比如酵母）等。
在本说明书中，与光散射相关的数个特征值的“数个”没有限制。比如“数个”只要是2以上则没有限制。
在本说明书中示出执行测定程序202b的处理部201搭载于测定装置200的例子来对实施方式进行了说明。但也可以设计为：在未搭载流式细胞仪230的另外的计算机执行测定程序202b。比如，可介由云端等网络，另外的计算机从流式细胞仪230针对每个粒子获取与散射光相关的数个参数的测定值，另外的计算机的处理部执行测定程序202b。
编号说明
201　处理部
202　存储部
230j　流动室
311　输入部
312　输出部
230a　检测部
230b～230d　光检测器
230e　照射光学系统
230k　光接收光学系统
230p　信号处理电路
220　试样制备部
230　FCM检测部（流式细胞仪）
100　测定系统
200　测定装置
300　显示器

Claims (17)

1.一种测定方法，其测定不使用荧光染料制备的测定试样中的粒子数，其特征在于包括：
基于通过流式细胞仪从所述测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
所述与光散射相关的数个特征值是各粒子所对应的前向散射光信号的脉冲波形的宽度和前向散射光信号的脉冲波形的峰高。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：
基于向所述各个粒子照射光而产生的散射光，计算所述测定试样中的有核细胞数。
4.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：
还包括：基于所述脂质粒子的相关信息判定脂质粒子对粒子数的测定值的影响的有无，并输出基于判定结果的信息。
5.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：
所述脂质粒子的相关信息是与白细胞数的测定值的可靠性相关的信息。
6.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：
基于所述脂质粒子的相关信息修正粒子数的测定值，并输出修正后的值作为白细胞数的测定值。
7.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于：
从通过旋转矩阵对从所述各个粒子获取的所述前向散射光信号的脉冲波形的宽度和前向散射光信号的脉冲波形的峰高所示出的坐标进行变换所得到的变换后的坐标抽取表示脂质粒子的坐标，由此生成所述脂质粒子的相关信息。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：
所述脂质粒子的相关信息通过柱状图的峰解析生成，所述柱状图是经所述旋转矩阵变换所得到的变换后的坐标在第1主成分所对应的轴方向上投影所得到的。
9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于：
在所述柱状图的峰解析中修正峰值，生成所述脂质粒子的相关信息。
10.根据权利要求8或9所述的测定方法，其特征在于：
在所述柱状图的峰解析中限定峰的寻找范围，生成所述脂质粒子的相关信息。
11.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：
所述脂质粒子的相关信息是粒子群中的脂质粒子的存在比率或脂质粒子的数量。
12.根据权利要求11所述的测定方法，其特征在于：
在所述脂质粒子的存在比率为提前设定的一定值以上时，或
所述脂质粒子的数量相对于粒子数的测定值为一定值以上时，
输出所述与白细胞数的测定值的可靠性相关的信息。
13.根据权利要求7至9其中任意1项所述的测定方法，其特征在于：
从表示所述脂质粒子的坐标去除疟疾感染细胞所对应的粒子的坐标，获取所述脂质粒子的相关信息。
14.一种测定装置，其测定不使用荧光染料制备的测定试样中的细胞数，其特征在于：
所述测定装置具备流式细胞仪和处理部，其中
所述处理部基于通过所述流式细胞仪从所述测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
15.一种含可执行测定程序的存储介质，其特征在于：
在使计算机执行所述程序时，
执行如下步骤：基于通过流式细胞仪从不使用荧光染料制备的测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息；测定所述测定试样中的细胞数。
16.一种测定方法，其对测定试样中的粒子数进行测定，其特征在于包括如下内容：
基于通过流式细胞仪从所述测定试样中含有的各个粒子获取的各粒子的与光散射相关的数个特征值，获取所述测定试样中含有的脂质粒子的相关信息。
17.根据权利要求16所述的测定方法，其是一种血细胞计算测定，其特征在于：
不使用与荧光相关的特征值，基于向所述各个粒子照射光而产生的散射光对测定试样中的粒子数进行测定。
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