CN114107535A - 鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记及其应用 - Google Patents

鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记与鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对。本发明所提供的分子标记，为以中国南瓜砧木的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第200位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第214位下游特异结合的单链DNA。实验证明，可以利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对A1和中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记鉴定中国南瓜砧木的去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的情况。

Description

鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记及 其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记及其应用。
背景技术
黄瓜、西瓜等瓜类作物生产中通常利用砧木嫁接来克服连作障碍，降低枯萎病、病毒病、线虫等病虫危害(李海真等，2011)。嫁接栽培已成为我国瓜类作物生产普遍而重要的栽培措施。其中，多数优良的瓜类嫁接用砧木品种来源于南瓜。
优良的南瓜砧木除了具有嫁接亲和性好、抗病虫害能力强、可增加黄瓜产量外，有些中国南瓜培育的优良砧木还具有去除黄瓜果实表面蜡粉层，提高黄瓜果实外观品质的优点，嫁接后的黄瓜果实更为油亮翠绿，商品性与出售价格得到提高。因此，选育具有去除黄瓜果实蜡粉性状的中国南瓜砧木具有重要的生产与经济价值。但是，由于中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状是由一对隐性基因控制(Cmo w)，因此在该性状的砧木选育中，每一代均需要自交获得具有纯合去蜡粉基因(Cmo w/Cmo w)的子代单株，再利用黄瓜嫁接试验来测试每代选择的育种材料是否携带有去蜡粉基因。选育工作繁琐，费时费工，周期长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定中国南瓜砧木具有去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记。
本发明所提供的中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记，为以中国南瓜砧木的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第200位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第214位下游特异结合的单链DNA。
上述分子标记的多态性可为中国南瓜砧木基因组中对应于SEQ ID No.1第201-213位为SEQ ID No.1第201-213位或缺失SEQ ID No.1第201-213位。
上述分子标记中，所述P1可为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2可为与SEQ ID No.1的第371-393位反向互补的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定中国南瓜砧木基因型的方法。
本发明所提供的鉴定中国南瓜砧木基因型的方法，所述基因型为TT基因型、TN基因型和NN基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1)和K2)：
K1)以待测中国南瓜砧木基因组DNA为模板，采用所述引物对A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定中国南瓜砧木基因型：
所述PCR产物为DNA片段1的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型，所述DNA片段1是一条含有SEQ ID No.1的第201-213位的DNA片段；所述PCR产物为所述DNA片段1和所述DNA片段2的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型，所述DNA片段2是一条不含有SEQ ID No.1的第201-213位的DNA片段；所述PCR产物为所述DNA片段2的所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型；
Ⅱ、包括如下L1)和L2)：
L1)以待测中国南瓜砧木基因组DNA为模板，采用P1和P2组成的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；所述P1为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ IDNo.1的第371-393位反向互补的单链DNA；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定中国南瓜砧木基因型：
所述PCR产物含有393bp和380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型；所述PCR产物含有393bp的DNA片段、不含有380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型；所述PCR产物不含有393bp的DNA片段、含有380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型；
所述PCR产物为393bp和380bp的这两种DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型；所述PCR产物为393bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型；所述PCR产物为380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定中国南瓜砧木基因型：
所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ IDNo.2所示的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型；所述PCR产物含有SEQID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型。
上述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法中，进行所述PCR扩增的体系可含有：10×buffer，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs，Taq DNA聚合酶，所述P1，所述P2，待测中国南瓜砧木基因组DNA。所述体系中dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均可为0.05mM，SEQID No.1和2所示单链DNA的终浓度均可为0.2μM，待测中国南瓜砧木基因组DNA的浓度可为30ng/μL。
进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火25s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。
上述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法中，所述TT基因型中国南瓜砧木具有去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状，所述TN基因型与NN基因型中国南瓜砧木均不具有去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的方法，为如下1)或2)：
1)按照上述的方法鉴定待测中国南瓜砧木的基因型；
2)根据基因型确定待测中国南瓜砧木的去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状：TT基因型的待测中国南瓜砧木为或候选去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木，TN基因型的待测中国南瓜砧木为或候选为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木，NN基因型的待测中国南瓜砧木为或候选为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木。
上述鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木的方法，为如下I或II：
I、包括如下M1)和M2)：
M1)以待测中国南瓜砧木基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQ ID No.1的第201-213位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木为或候选为去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木；
II、包括如下N1)和N2)：
N1)以待测中国南瓜砧木基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有393bp的DNA片段、不含380bp的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木为或候选为去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木为或候选为去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木。
上述鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对，为所述引物对A1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为所述引物对A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、Taq DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述Taq DNA聚合酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
上述系统中，所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂均可独立包装。所述A1中的各引物对的两条单链DNA可独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的系统也可为仅含有所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H10中任一应用：
H1、所述中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记在鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中的应用；
H2、所述中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记在鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木中的应用；
H3、述中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记在中国南瓜砧木育种中的应用；
H4、所述方法在鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木中的应用；
H5、所述方法在中国南瓜砧木育种中的应用；
H6、所述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法在鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中的应用；
H7、所述引物对或所述系统在制备鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、所述引物对或所述系统在鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中的应用；
H9、所述引物对或所述系统在鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木中的应用；
H10、所述引物对或所述系统在中国南瓜砧木育种中的应用。
上述应用中，所述TT基因型中国南瓜砧木具有去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状，所述TN基因型和NN基因型中国南瓜砧木均不具有去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。
为解决上述技术问题，本发明还提供了中国南瓜砧木育种方法。
本发明所提供的中国南瓜砧木育种方法，按照所述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法鉴定中国南瓜砧木的基因型，选择TT基因型的中国南瓜砧木作为亲本进行育种。
本发明中，所述去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木是指嫁接黄瓜后黄瓜果实无蜡粉、表皮油亮的中国南瓜砧木，所述非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木是指嫁接黄瓜后黄瓜果实有大量蜡粉的中国南瓜砧木。
本发明中，所述A1的两条单链DNA的摩尔数可为1:1。
本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，所述PCR产物含有393bp和380bp的DNA片段可表现为在300bp和400bp间有两条带，其中393bp的DNA片段为一条更接近400bp的条带。
本发明还提供SEQ ID No.1的第201-213位的DNA分子。
实验证明，利用本发明的中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记可以鉴定中国南瓜砧木的去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状，以有不同去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的中国南瓜砧木基因组为模板，利用本发明的鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对进行PCR扩增时得到的三种PCR产物，对应于不同的中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状，当中国南瓜砧木的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(393bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(380bp)时，中国南瓜砧木表现为去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状，当中国南瓜砧木的PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(380bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(393bp)，该中国南瓜砧木表现为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状，当中国南瓜砧木的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(393bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(380bp)，该中国南瓜砧木表现为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状。表明可以利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对A1和中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状情况。
本发明在中国南瓜砧木自交系N11中发现了一个去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的隐性基因Cmo w，其优异的去除嫁接黄瓜果实蜡粉表现在中国南瓜砧木育种中具有重要的利用价值。本发明获得了与去蜡粉基因(Cmo w)共分离分子标记5820529。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将去蜡粉基因通过杂交、回交转育的方法导入优良中国南瓜砧木自交系04-63中，使其获得了去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。
附图说明
图1为分子标记5820529与中国南瓜砧木去蜡粉基因Cmo w的遗传连锁图，该标记与去蜡粉基因Cmo w共分离。
图2为分子标记5820529扩增带型。其中P1为去蜡粉亲本N11，P2为非去蜡粉亲本04-63，F1为杂交一代；1-23为F2单株；M：Trans DNA markerI。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的中国南瓜砧木自交系N11，在非专利文献“李海真等，黄瓜专用砧木品种京欣砧6号的选育，中国瓜菜，2011，24(2)：18-20”中公开过，中国南瓜砧木自交系04-63在非专利文献“贾长才等，甜瓜、西瓜专用砧木品种-京欣砧3号的选育和推广，中国瓜菜，2011，24(5):28-31”中公开过，上述两个品种公众可从北京市农林科学院处获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的dNTPs为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。TaqDNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。PCR仪为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
实施例1、中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的鉴定
本实施例利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对A1对中国南瓜砧木的去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状进行鉴定，A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，P1为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，P2为与SEQ ID No.1的第371-393位反向互补的单链DNA。
1、待鉴定中国南瓜砧木为如下16种，每种中国南瓜砧木均选择50株进行黄瓜嫁接试验：
自交系04-63，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉；
自交系N11，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉；
京欣砧3号，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品；
京欣砧4号，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品；
京欣砧5号，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品；
京欣砧6号，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品；
威盛1号，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为辽宁省农业科学院园艺分院产品；
甬砧2号，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为宁波市学业科学研究院产品；
甬砧8号，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为宁波市学业科学研究院产品；
新秀，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为北京亘青种子有限公司；
大阪太郎，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为北京九方盛远种子有限公司产品；
哥弟砧木，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为北京中联韩种子有限公司产品；
壮士，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为农友种苗(中国)有限公司产品；
冀砧10号，其除嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为河北省农林科学院经济作物研究所；
哥俩好，其嫁接黄瓜果实表型为有蜡粉，为辽宁锦州鑫园世家种业有限公司产品；
北农亮砧，其嫁接黄瓜果实表型为无蜡粉，为北京绿色阳光种子有限公司产品。
2、中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的鉴定
用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)分别提取上述各种中国南瓜砧木幼嫩叶片的基因组DNA，作为模版利用引物对A1进行PCR扩增。
利用引物对A1进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P1，P2，中国南瓜砧木基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P1和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火25s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上160V电泳70min，经银染后于灯箱下观察，记载。
以上各中国南瓜砧木的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序结果如表1所示，表1中393bp的PCR产物表示SEQ ID No.1所示的DNA片段，380bp的PCR产物表示SEQID No.2所示的DNA片段(SEQ ID No.2所示的DNA片段与SEQ ID No.1所示的DNA片段相比，缺少SEQ ID No.1第201-213位)。然后鉴定各中国南瓜砧木的去除嫁接黄瓜果实蜡粉的情况，PCR产物与表型的关系如表1所示。
表1、不同南瓜砧木PCR产物和去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分析结果
Figure BDA0002658208490000081
Figure BDA0002658208490000091
注：嫁接黄瓜表型均是以黄瓜品种津绿17(天津市绿丰园艺新技术开发有限公司产品，登记编号：GPD黄瓜(2018)120302)作为接穗得到的嫁接黄瓜的表型。
利用A1在以不同中国南瓜砧木基因组DNA为模板进行PCR扩增时，PCR产物共有三种情况：第一种情况是PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段(393bp)，该中国南瓜砧木的基因型为TT；第二种情况是PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段(380bp)，该中国南瓜砧木的基因型为NN；第三种情况是PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段(393bp)和SEQ IDNo.2所示的DNA片段(380bp)这两种DNA片段，该中国南瓜砧木的基因型为TN。根据PCR扩增产物定义中国南瓜砧木的基因型，其中TT基因型表示中国南瓜砧木的两条同源染色体均为SEQ ID No.1，TN基因型表示中国南瓜砧木的一条同源染色体为SEQ ID No.1，另一条同源染色体为SEQ ID No.2，NN基因型表示中国南瓜砧木的两条同源染色体均为SEQ ID No.2。其中，TT基因型和NN基因型均可稳定遗传。
将以中国南瓜砧木的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA分子命名为中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记，中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记的多态性为中国南瓜砧木基因组中对应于SEQ ID No.1为SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2。
结果表明，当中国南瓜砧木的PCR产物为第一种情况(即中国南瓜砧木的基因型为TT基因型)时，该中国南瓜砧木表现为去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状，其作为砧木得到的嫁接黄瓜无蜡粉。当中国南瓜砧木的PCR产物为第二种情况(即中国南瓜砧木的基因型为NN基因型)时，该中国南瓜砧木表现为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状，其作为砧木得到的嫁接黄瓜有蜡粉。当中国南瓜砧木的PCR产物为第三种情况(即TN基因型)时，该中国南瓜砧木表现为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状，其作为砧木得到的嫁接黄瓜有蜡粉。PCR产物的三种情况(或中国南瓜砧木的TT、NN和TN基因型)与中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的情况完全一致，表明可以利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对A1鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的情况。
实施例2、与中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状控制基因Cmo w共分离InDel分子标记的获得方法
将实施例1的中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状分子标记命名为分子标记5820529，本实施例具体描述了所述的与中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状基因Cmow共分离InDel分子标记5820529的获得方法，包括以下步骤：
(一)中国南瓜砧木自交系N11与04-63 F2代的创建与表型鉴定：
(1)中国南瓜砧木自交系N11(母本，P1)与04-63(父本，P2)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2代群体。
(2)F2代群体单株温室种植育苗，子叶展开后以黄瓜品种津绿17作为接穗得到225株嫁接苗。225株嫁接苗的砧木编号从ZN1顺序编号至ZN225。嫁接苗定植于温室，结瓜期调查每个嫁接单株黄瓜的果实蜡粉性状，并利用引物对A1进行PCR扩增，分析基因型。
表型和基因型对应下分析结果见表2，性状遗传分析见表3。
表2 N11×04-63 F2代群体去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分析结果
Figure BDA0002658208490000101
Figure BDA0002658208490000111
Figure BDA0002658208490000121
Figure BDA0002658208490000131
Figure BDA0002658208490000141
Figure BDA0002658208490000151
Figure BDA0002658208490000161
注：嫁接黄瓜表型均是以黄瓜品种津绿17作为接穗得到的嫁接黄瓜的表型。
表3、N11×04-63 F2代群体去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的遗传分析
Figure BDA0002658208490000162
注：N、T分别代表黄瓜果实有蜡粉单株、无蜡粉单株。χ2 0.05,1＝3.84。
(3)通过对F2代单株进行遗传分析，发现中国南瓜砧木自交系N11携带一个隐性去除嫁接黄瓜果实蜡粉基因。
(二)多态性分子标记筛选
(4)将10株具有去除黄瓜果实蜡粉性状F2单株的叶片等量混池。用CTAB法(SuePorebski L.,1997)提取去蜡粉亲本N11、非去蜡粉亲本04-63、去蜡粉F2单株混池的DNA，应用InDel分子标记与BSA(Bulk Segregant Analysis)结合的方法进行多态性分子标记筛选。
(5)利用亲本N11与04-63基因组重测序，本课题组在中国南瓜20条染色体上设计合成531对InDel标记，对N11、04-63和去蜡粉F2单株混池进行多态性筛选。
PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，Tag酶(5单位/μL)0.2μL，10μM引物(F/R)各0.3μL，模版DNA 30ng，加ddH2O至15μL；
InDel标记反应条件为DNA95℃预变性3min后，94℃变性30s，54℃退火25s，72℃延伸25s，循环36次，最后72℃延伸10min。
在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染后照相记录结果。
选择在亲本间有多态性且在去蜡粉F2单株混池中表现为具有亲本N11带型扩增优势的引物，作为去蜡粉基因Cmo w连锁的候选分子标记，共2个。
(三)紧密连锁分子标记5820529的获得
(6)根据连锁交换规律，利用2个候选分子标记在去蜡粉F2单株间的基因型资料与单株的嫁接黄瓜果实蜡粉性状资料，获得了2个分子标记与Cmo w基因的连锁关系。进一步开发2个分子标记与去蜡粉基因Cmo w间多态性InDel标记33个，并构建了分子标记与Cmo w基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP 3.0，获得了与去蜡粉基因Cmo w共分离的分子标记5820529(图1)；
(四)去蜡粉基因Cmo w向非去蜡粉中国南瓜砧木自交系的转移
(7)利用获得的与去蜡粉基因Cmo w共分离的分子标记5820529，通过杂交、回交转育及自交纯化将去蜡粉基因导入非去蜡粉中国南瓜砧木优良自交系中，具体为：以去蜡粉亲本N11(母本，P1)、非去蜡粉亲本04-63(父本，P2)、杂交一代(F1)为对照，对F2单株采用分子标记5820529进行鉴别，结果见图2，选择引物对A1扩增后带型与去蜡粉亲本N11(只有一条393bp条带)相同的单株进行进一步的选育。利用上述策略，成功改良非去蜡粉中国南瓜砧木优良自交系04-63，使其携带去蜡粉基因Cmo w具备了去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。
中国南瓜砧木种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于中国南瓜砧木新品种培育具有重要作用。本发明通过将具有去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的种质N11与非去蜡粉自交系04-63杂交，经遗传分析确定N11中携带有一个隐性的去蜡粉基因Cmo w，通过构建去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分离群体，经多态性分子标记筛选，获得了与去蜡粉基因Cmo w共分离的分子标记5820529。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将去蜡粉基因Cmo w转育到非去蜡粉中国南瓜砧木优良自交系04-63中，使其获得了去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。在传统育种方法中，由于缺乏与中国南瓜砧木去蜡粉基因连锁的分子标记，每代去蜡粉基因的转移均需要进行自交，然后嫁接黄瓜，鉴定黄瓜果实的蜡粉表型，耗时耗力，育种周期长。因此，分子标记5820529的开发可以简便准确的筛选携带去蜡粉基因Cmo w的单株，大大节省去蜡粉中国南瓜砧木材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性，加快了去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状砧木新品种的培育速度。本发明获得与中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状控制基因Cmo w共分离的共显性分子标记5820529。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将去蜡粉基因Cmo w成功导入其它非去蜡粉中国南瓜砧木优良自交系，使之获得去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记5820529检测中国南瓜砧木去蜡粉基因Cmo w，可以确定去蜡粉基因是否存在以及存在状态，并预测植株对嫁接黄瓜果实蜡粉的去除情况，加快该去蜡粉基因的利用。本发明提出了利用中国南瓜砧木种质资源N11中去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状控制基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将去蜡粉基因导入非去蜡粉中国南瓜砧木优良自交系中，利用该方法成功将去蜡粉基因Cmo w导入中国南瓜砧木优良自交系04-63，使其获得了去除嫁接黄瓜果实蜡粉的性状。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 北京市农林科学院
<120> 鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记及其应用
<130> GNCSY202219
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 393
<212> DNA
<213> 中国南瓜(Cucurbita moschata)
<400> 1
ggaccttatc tcctcatcct gtgggaccca cttccacctg ccctccattc tcccctttaa 60
ctctccaatt taaatctttt ttcaatttct ataattattt caactaaatt tatttcatat 120
tttttaatta tcatttacga tggagtttga ctaatccact tgtaacgttg actttatttc 180
tggacggaca cgtggcacgt gatatgagga ctggattgga gggggacaag agtccagtaa 240
aatccaaaag gacgcaggga ggtaattaaa tgaggttaaa tgtagagatt aatagcacac 300
aaacgagggg gggcccttct gtaaaaatac actaaattac tactgagtca actcggcccc 360
taatcccccc gagtcttaaa ttcctccaac tcg 393
<210> 2
<211> 380
<212> DNA
<213> 中国南瓜(Cucurbita moschata)
<400> 2
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cccttctgta aaaatacact aaattactac tgagtcaact cggcccctaa tccccccgag 360
tcttaaattc ctccaactcg 380

Claims (10)

1.中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为以中国南瓜砧木的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第200位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第214位下游特异结合的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述分子标记的多态性为中国南瓜砧木基因组中对应于SEQ ID No.1第201-213位为SEQ ID No.1第201-213位或缺失SEQ IDNo.1第201-213位。
3.根据权利要求1所述的中国南瓜砧木分子标记，其特征在于：所述P1为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第371-393位反向互补的单链DNA。
4.鉴定中国南瓜砧木基因型的方法，所述基因型为TT基因型、TN基因型和NN基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1)和K2)：
K1)以待测中国南瓜砧木基因组DNA为模板，采用权利要求1-3中任一所述引物对A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定中国南瓜砧木基因型：
所述PCR产物为DNA片段1的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型，所述DNA片段1是一条含有SEQ ID No.1的第201-213位的DNA片段；所述PCR产物为所述DNA片段1和所述DNA片段2的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型，所述DNA片段2是一条不含有SEQID No.1的第201-213位的DNA片段；所述PCR产物为所述DNA片段2的所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型；
Ⅱ、包括如下L1)和L2)：
L1)以待测中国南瓜砧木基因组DNA为模板，采用P1和P2组成的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；所述P1为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第371-393位反向互补的单链DNA；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定中国南瓜砧木基因型：
所述PCR产物含有393bp和380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型；所述PCR产物含有393bp的DNA片段、不含有380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型；所述PCR产物不含有393bp的DNA片段、含有380bp的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定中国南瓜砧木基因型：
所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测中国南瓜砧木的基因型为TN基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木的基因型为TT基因型；所述PCR产物含有SEQ IDNo.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述待测中国南瓜砧木的基因型为NN基因型。
5.鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的方法，包括：
1)按照权利要求4所述的方法鉴定待测中国南瓜砧木的基因型；
2)根据基因型确定待测中国南瓜砧木的去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状：TT基因型的待测中国南瓜砧木为或候选去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木，TN基因型的待测中国南瓜砧木为或候选为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木，NN基因型的待测中国南瓜砧木为或候选为非去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中国南瓜砧木。
6.鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的引物对，为权利要求1-3中任一所述引物对A1。
7.鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为权利要求1-3中任一所述引物对A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
8.下述H1-H10中任一应用：
H1、权利要求1-3中任一所述中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记在鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中的应用；
H2、权利要求1-3中任一所述中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记在鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木中的应用；
H3、权利要求1-3中任一所述中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的分子标记在中国南瓜砧木育种中的应用；
H4、权利要求4或5所述方法在鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木中的应用；
H5、权利要求4或5所述方法在中国南瓜砧木育种中的应用；
H6、权利要求4所述鉴定中国南瓜砧木基因型的方法在鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中的应用；
H7、权利要求6所述引物对或权利要求7所述系统在制备鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、权利要求6所述引物对或权利要求7所述系统在鉴定或辅助鉴定中国南瓜砧木去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状中的应用；
H9、权利要求6所述引物对或权利要求7所述系统在鉴定或辅助鉴定去除嫁接黄瓜果实蜡粉性状稳定遗传中国南瓜砧木中的应用；
H10、权利要求6所述引物对或权利要求7所述系统在中国南瓜砧木育种中的应用。
9.中国南瓜砧木育种方法，按照权利要求4所述的方法鉴定中国南瓜砧木的基因型，选择TT基因型的中国南瓜砧木作为亲本进行育种。
10.核苷酸序列是SEQ ID No.1的第201-213位的DNA分子。
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