CN114099716A - 双模态成像组合物及其在肺小结节定位中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种双模态成像组合物,系水凝胶,包括荧光素和光敏凝胶。经验证,本发明的双模态成像组合物在体外和体内都表现出恒定的强发光,具有荧光‑CT双模态成像特性;同时接受双模态成像组合物的组织部位具有明显的触感。因此其可用于对病灶组织(尤其是肺小结节)的定位,从而提高了外科医生在手术过程中对病灶的定位准确性和切除准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料,尤其涉及一种由MOF材料和明胶组成的组合物,呈现双模态成像特性,作为造影剂适用于肺小结节定位。
背景技术
近年来,由于低剂量计算机断层扫描(CT)的广泛应用,早期肺癌的诊断率得到了明显提升。因此肺小结节(即直径<1cm的病变,与良性疾病或早期肺癌有关)的诊断与治疗成为了广受医学专家关注的临床问题。然而,肺小结节的定位为临床医生带来了挑战,因为这些微小病变在手术中通常是看不见摸不着的,而且手术中肺的塌陷也会增加定位的难度。
为此,目前已有许多术前肿瘤标记技术来辅助肺小结节的定位,包括hookwire、微弹簧圈和染料标记等。其中,hookwire和微弹簧圈是被广泛应用于定位的金属标记物。然而,它们的侵入性特征会导致各种并发症,包括患者不适、气胸和血胸等,而呼吸相关的运动也可能导致标记物的移位。相比之下,吲哚菁绿(ICG)是一种可以通过近红外(NIR)荧光成像可视化的染料,由于其安全性良好,且NIR的发射光谱特征可提供良好的穿透性以及避免任何未染色组织的自发荧光,因此它也常用于肺小结节定位。然而,作为一种小分子荧光染料,ICG分子较为不稳定,在长时间激发下容易猝灭。ICG溶液容易快速扩散到周围的肺实质和脏层胸膜,这可能会降低定位的准确性。尽管ICG可以在注射后立即在CT中观察到,但当术前需要确认定位部位时, CT图像中很难观察到ICG,因此必须在注射ICG后尽快进行手术,这为术前定位和手术的时间安排增添了不便。此外,即使与其他类型的光线相比,NIR拥有超过10mm 的较强穿透性,但NIR辐照的穿透深度仍然有限,因此ICG也不适合深部结节定位。
由此可见,虽然ICG具有众多的优点和广泛的应用,但仍有必要开发新的荧光素或荧光素与其他材料的组合方式以改善肺小结节的术前定位。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种双模态成像组合物,具有双模态成像特性,利于术前确认定位部位。
本发明的另一个目的在于提供一种双模态成像组合物,有效限制染料的扩散范围,利于对手术部位的术中定位。
本发明的再一个目的在于提供一种双模态成像组合物,以其为造影剂,提高对病灶组织的定位准确性和切除准确性。
本发明的又一个目的在于提供一种双模态成像组合物,以其为造影剂,提高了外科医生在手术过程中对肺小结节定位准确性和切除准确性。
本发明的技术方案使用基于Eu3+的MOF并将发光材料加载到水凝胶上,通过 Eu(TTA)3(BPY)和UiO-67-bpy之间的配体交换反应成功合成了Eu-UiO-67-bpy(即 Eu-MOF)。由于4f-4f跃迁禁止效应,Eu3+的光吸收较弱,这使得Eu3+的直接激发效率非常低,除非采用高能光源激发。然而,在Eu-UiO-67-bpy之中,TTA和BPY能够克服受禁止的4f-4f跃迁来敏化发光,并且在Eu3+周围形成稳定的结构。
在紫外光照射下,TTA和BPY将能量进行了有效的吸收,随后能量从这些配体转移到Eu3+,最终使得Eu3+发出荧光,这被称为“天线效应”。由于在614nm(在可见光谱中)观察到峰值发射,即使不需要特定的光学设备来检测也可以看到荧光。此外,已知Eu3+可有效吸收X射线,从而使Eu-MOF在CT影像中可见。因此,若能将Eu-MOF应用于术前定位,外科医生可以在手术前立即确认定位部位,并且使用术中CT系统定位深部病灶。
本发明的技术方案采用甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)作为液体载体,为注射部位提供可触及性,从而帮助外科医生检测肺结节。当使用细针注射时,GelMA溶液表现出适合注射的流体粘度。GelMA不仅本身表现出优异的生物相容性,而且可限制 Eu-MOF释放到周围组织中,从而进一步降低了Eu-MOF/GelMA复合物的整体细胞毒性。
选择氨基基团的取代度大于70%或更高,尤其是80%或更高,如:但不限于:80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、88%、89%或90%或更高,以使 GelMA具有更高的硬度。兼顾光固化后水凝胶的硬度和固化前水凝胶溶液的流动性, GelMA的浓度为15wt%~20wt%,如:但不限于15wt%、16wt%、17wt%、18wt%、19wt%和20wt%。在紫外光激发下获得的水凝胶块图像和压缩模量数据也证实了 Eu-MOF/GelMA在发出明显红色荧光的同时可表现出相当高的硬度。
一种双模态成像组合物,包括荧光素(如:Eu-MOF)和光敏水凝胶(如:GelMA)。
本发明的技术方案通过注射载有Eu-MOF的GelMA水凝胶定位肺小结节的策略。使用Eu-MOF/GelMA进行定位时,荧光发射恒定且稳定,染料的扩散区域被限于注入点,并且该复合物在CT图像中清晰可见,这使得定位部位的CT-荧光双模态成像成为可能。
本发明提供的成像组合物制成造影剂,具有CT-荧光双模态成像特性。在猪肺和小鼠中进行体外和体内实验验证发现,Eu-MOF/GelMA复合水凝胶在体外和体内都表现出恒定的强发光;同时注射部位具有明显的触感。因此可用于对病灶组织(尤其是肺小结节)的定位,从而提高了外科医生在手术过程中对病灶的定位准确性和切除准确性。
GelMA光固化后可提供限制扩散的效果,因而与ICG和Eu-MOF/H2O相比, Eu-MOF/GelMA荧光扩散区域被限于注入点周围。在CT图像中可以清楚地观察到 Eu-MOF/GelMA悬液的注射部位,并表现出相对较高的CT值。这些结果表明Eu-MOF/GelMA适用于肺小结节定位的双模态成像。
附图说明
图1为UiO-67-bpy和Eu-UiO-67-bpy颗粒的透射电子显微镜和mapping图像;
图2为Eu-MOF颗粒的X射线衍射图;
图3为Eu-MOF/GelMA复合水凝胶的CT图像的荧光图像和3D重建图像,Eu-MOF 浓度范围为0至20mg/mL。相应的荧光强度和CT值在图像下方列出;
图4为Eu-MOF/GelMA复合水凝胶的压缩载荷-压缩位移曲线,Eu-MOF浓度为 20mg/mL;
图5为通过CCK-8测定HFL1细胞与不同浓度的Eu-MOF孵育24小时后的相对细胞活力统计图;
图6为对分别注射ICG水溶液、GelMA溶液、Eu-MOF/H2O悬液和Eu-MOF/GelMA 悬液的猪肺段进行2小时观察的荧光图像;
图7为分别注射Eu-MOF/H2O和Eu-MOF/GelMA悬液的猪肺段24小时观察的荧光图像;
图8为注射ICG水溶液、GelMA溶液、Eu-MOF/H2O悬液和Eu-MOF/GelMA悬液后2 小时拍摄的猪肺段CT图像及注射部位的CT值(**表示P<0.01);
图9为注射ICG水溶液、GelMA溶液、Eu-MOF/H2O悬液和Eu-MOF/GelMA悬液后2小时拍摄的小鼠肺的荧光图像和CT图像;
图10为注射ICG水溶液、GelMA溶液、Eu-MOF/H2O悬液和Eu-MOF/GelMA悬液后2小时拍摄的小鼠肺的注射部位CT值统计图(**表示P<0.01)。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例,所提供的所有数据均以平均值±标准差表示。数据分析由GraphPad Prism 8.0软件进行。P<0.05表明具有统计学显著性差异。
本发明以下实施例,所采用的检测项目和相应方法如下:
1.Eu(TTA)3(BPY)的合成
将六水氯化铕(366mg,1mmol)、TTA(667mg,3mmol)和BPY(156mg, 1mmol)溶解在乙醇(5mL)和水(1mL)的混合物中。随后,将1mL的3M NaOH 溶液加入上述混合物中以得到白色沉淀。在室温(25℃)下连续搅拌2小时后,将反应产物离心,用1:1乙醇和水的混合溶剂(10mL)洗涤沉淀,干燥备用。
六水氯化铕、八水氯化锆、TTA、BPY和2,2'-联吡啶-5,5-二羧酸(BPY-DC)购自J&KScientific(中国,北京)。
2.UiO-67-bpy的合成
将BPY-DC(20mg,0.08mmol)加入1mL DMF中,得到白色悬液。在另外的反应瓶中,将八水合氯化锆(9mg,0.028mmol)溶解在3mL DMF中。随后,将这两种溶液混合,并加入24mL乙酸。短暂的超声分散处理后,将悬液在90℃下加热 18小时以产生UiO-67-bpy,将产物进行离心,用DMF和乙醇的1:1混合溶剂(20mL) 洗涤,干燥备用。
3.Eu-UiO-67-bpy(Eu-MOF)的合成
将UiO-67-bpy(50mg)和Eu(TTA)3(BPY)(30mg)加入DMF(5mL)中,超声分散5min后,将混合物密封并在120℃烘箱中加热3小时,然后冷却至室温。最后,将产物进行离心,用DMF和乙醇的1:1混合溶剂(20mL)洗涤,干燥备用。
4.Eu-MOF的物理特性
TEM图像和mapping图像由JEM-2100场发射透射电子显微镜(JEOL,日本,东京)拍摄。通过D8 Advance仪器(Bruker,德国,卡尔斯鲁厄)测得XRD表征。通过FS5荧光分光计(Edinburgh Instruments,英国,利文斯通)测得荧光光谱。
5.Eu-MOF的生物相容性
将HFL1细胞悬液以每孔5×103个细胞的密度接种到96孔板中,并在标准条件 (37℃,5%CO2)下孵育过夜。随后,将细胞与不同浓度的Eu-MOF(0、0.05、0.1、 0.25、0.5和1mg/mL)孵育24小时。此后,每孔用PBS洗涤3次以去除残留的Eu-MOF,然后分别加入100μL的HFL1培养基和10μL CCK-8溶液。孵育2h后,测量450nm 处的吸光度,并计算相对细胞活力。
HFL1(人胎肺成纤维细胞1)细胞和HFL1完全培养基由中国科学院干细胞库(中国,上海)提供。
6.Eu-MOF/GelMA复合水凝胶的制备
将1g GelMA添加到5mL光引发剂溶液中并在65℃避光水浴中下加热以获得 20%(w/v)GelMA溶液。在进一步使用之前,使用孔径为0.22μm的过滤器过滤GelMA 溶液。将浓度为0、12.5、25、50、100和200mg/mL的Eu-MOF水性悬液(0.1mL) 与GelMA溶液(0.9mL)混合,以获得不同浓度的Eu-MOF/GelMA混合物。将浓缩物倒入内径为5mm、高度为2mm的模具中,在用405nm光源照射30秒后,从模具中分离出光固化的固体水凝胶。
GelMA购自Engineering For Life(中国,苏州)。
7.复合水凝胶的物理特性
在365nm紫外光照射下拍摄Eu-MOF/GelMA复合水凝胶的荧光图像,并使用ImageJ软件量化每个水凝胶块的荧光强度。使用μCT80 Micro-CT系统(SCANCO Medical,瑞士,巴瑟斯多夫)进行CT扫描和3D重建。使用Instron 5542动态力学分析仪(美国,马塞诸塞州,坎顿)测试机械特性。使用应力-应变曲线的0-10%(0-0.2 mm)应变范围内的线性区域的斜率计算压缩模量。
8.体外研究
ICG水溶液(2.5mg/mL)、GelMA溶液(18wt%)、Eu-MOF/H2O悬液(Eu-MOF 水悬液,5mg/mL)和Eu-MOF/GelMA悬液(混合物)0.1mL的50mg/mL Eu-MOF 悬液和0.9mL的20wt%GelMA溶液)已预先制备。从猪肺中分离出大小相似的肺段,然后分别注射上述四种溶液(0.1mL),随后用405nm光源照射30秒。在注射前、注射后5分钟和2小时分别拍摄肺段的白光图像和365nm荧光图像。使用Optomedic 2100系列高清荧光内窥镜系统(中国,佛山)拍摄注射ICG肺段的荧光图像。注射后 2小时获得micro-CT图像和CT值。此外,另取两组肺段分别注射等量Eu-MOF/H2O 和Eu-MOF/GelMA,观察它们的荧光在24小时内的变化。
9.体内研究
6周龄BALB/c小鼠通过腹腔注射水合氯醛溶液(10wt%,5mL/kg)麻醉并置于右侧卧位。识别肋弓下缘,剃掉该区域的毛皮,并用75%乙醇对切口部位进行消毒。沿肋弓下缘上方1cm的平行线做1cm的切口,切开皮肤皮下组织以显露肋骨。随后,在肋间肌上做0.5cm的切口。于小鼠左肺分别注射0.05mL ICG水溶液、GelMA溶液、 Eu-MOF/H2O悬液或Eu-MOF/GelMA悬液,然后用405nm光源照射30秒。照射后立即缝合切口,用注射器抽出胸腔内多余气体以保持胸腔内低压。注射后2小时处死小鼠,剪除部分肋骨后拍摄白光图像和365nm荧光图像。最后,将整肺游离并进行 micro-CT扫描。
实施例1Eu-MOF和Eu-MOF/GelMA复合水凝胶的制备和表征
图1显示了UiO-67-bpy和Eu-UiO-67-bpy颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像,其中Eu-UiO-67-bpy的直径为100-120nm。而mapping图像表明Eu、Zr、F和N在MOF的框架内均匀分布。X射线衍射(XRD)实验也证实了Eu-UiO-67-bpy的MOF结构的成功构建(图 2)。Eu-MOF分别在342和614nm处观察到激发和发射光谱峰,这表明Eu-UiO-67-bpy可在紫外光激发下发出较强的红色荧光。此外,丁达尔效应测试证实GelMA、Eu-MOF/H2O和 Eu-MOF/GelMA的悬液形成了良好的分散体。
Eu-MOF/GelMA复合水凝胶块的CT图像的荧光图像和三维(3D)重建如图3所示,其中不同水凝胶浓度(即0、1.25、2.5、5、10和20mg/mL)分别为56.152±14.933,81.303 ±22.294,119.060±25.916,147.305±34.401,176.172±34.430,以及251.489±17.709。这些结果表明Eu-MOF荧光强度随着浓度增加而提升。此外,对应的CT值分别为8.550±2.584、10.039±1.572、15.338±3.018、23.521±6.399、36.805±5.136、63.547±4.418。与不含Eu-MOF 的水凝胶相比,具有最高Eu-MOF浓度的水凝胶在3D重建图像中显示出明显更高的密度。此外,我们以压缩模量衡量Eu-MOF/GelMA复合水凝胶的硬度。根据压缩载荷-位移曲线(图 4),复合物的压缩模量为0.13725±0.01120MPa,足以通过手指触摸将其与软组织(例如肺实质)区分开来。如图5所示,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)评估Eu-MOF的生物相容性,HFL1细胞与0到1mg/mL的不同浓度的Eu-MOF共孵育24小时,结果显示,在不同 Eu-MOF浓度下,相对细胞活力均>98%[0.05mg/mL为(101.32±0.65)%,0.1mg/mL为(99.83 ±1.19)%,0.25mg/mL为(100.24±2.12)%,0.5mg/mL为(98.78±1.35)%,1mg/mL为 (98.18±1.82)%]。
实施例2双模态成像体外实验
如图6所示,在注射后2小时内,ICG迅速扩散到猪肺段的周围肺实质中。在Eu-MOF/H2O 组合的中,荧光区域的亮度在2小时后显著降低,荧光区域与正常肺组织之间的边界变得更加模糊。然而,Eu-MOF/GelMA复合水凝胶在2小时后保持了限定的荧光区域和高荧光强度。
此外,如图7所示,我们对Eu-MOF/H2O和Eu-MOF/GelMA样品在24小时内荧光区域的变化进行了观察。具体而言,Eu-MOF/H2O悬液在注射后立即沿肺表面发生扩散,随着时间的推移,荧光强度逐渐降低。6小时后,在注射点仅观察到一个暗淡的荧光点,24小时后,荧光变得几乎不可见。相比之下,Eu-MOF/GelMA的荧光强而稳定,在24小时内几乎没有发生变化。进一步观察表明,即使在48小时和72小时后荧光仍保持不变。CT图像显示ICG、 GelMA、Eu-MOF/H2O和Eu-MOF/GelMA样品之间存在明显差异(图8),CT值分别为1.046 ±2.954,5.456±3.544,17.913±4.157,以及42.601±3.432,由此可见注射Eu-MOF/GelMA水凝胶的肺段的注射部位CT值明显高于其他样品。
实施例3双模态成像体内实验
如图9和图10所示,荧光成像表明,2小时后ICG在小鼠肺表面的扩散区域相当大,甚至壁层胸膜也被绿色荧光染色。同样,注射Eu-MOF/H2O悬液2小时后记录的图像显示荧光区域广泛分布,荧光强度不足而无法与周围的普通肺实质区分开来。然而,Eu-MOF/GelMA的红色荧光可集中在注射点,且荧光强度高。此外,与ICG、GelMA 和Eu-MOF/H2O相比,Eu-MOF/GelMA样品的CT图像显示注射区域具有显著的高密度(图10)。注射ICG、GelMA、Eu-MOF/H2O和Eu-MOF/GelMA的肺段的注射部位 CT值分别为5.789±2.386,16.662±2.906,35.357±2.848以及87.222±4.636。
本实施例取得各种图像和数据表明,Eu-MOF/GelMA复合水凝胶在体外和体内都表现出恒定的强发光。由于光交联GelMA提供的限制扩散的效果,与ICG和Eu-MOF/H2O相比,Eu-MOF/GelMA荧光扩散区域被限于注入点周围。在CT图像中可以清楚地识别出 Eu-MOF/GelMA悬液的注射部位,并表现出相对较高的CT值。在实验中,小鼠肺中各种注射剂的CT值高于猪肺,这可能是由于小鼠肺部致密的间质空间限制了溶液或悬液的扩散所导致,并且在处死小鼠时肺放出气体和取出肺的过程可能会压缩液体介质。总之,这些结果表明本实施例的Eu-MOF/GelMA适用于肺结节定位的双模态成像。
Claims (10)
1.一种双模态成像组合物,系水凝胶,其特征在于包括荧光素和光敏水凝胶,具有荧光-CT双模态成像特性。
2.根据权利要求1所述的双模态成像组合物,其特征在于所述的荧光素为Eu-UiO-67-bpy。
3.根据权利要求1所述的双模态成像组合物,其特征在于所述光敏水凝胶为GelMA,其氨基基团的取代度大于70%。
4.根据权利要求1所述的双模态成像组合物,其特征在于所述GelMA的氨基基团的取代度大于80%。
5.根据权利要求1所述的双模态成像组合物,其特征在于所述GelMA的氨基基团的取代度为80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、88%、89%或90%。
6.根据权利要求1所述的双模态成像组合物,其特征在于所述的GelMA的浓度为15wt%~20wt%。
7.根据权利要求1所述的双模态成像组合物,其特征在于所述的GelMA的浓度为16wt%、17wt%、18wt%或19wt%。
8.一种权利要求1~7之一所述的双模态成像组合物在制备造影剂中的应用。
9.一种造影剂,其特征在于包括权利要求1~7之一所述的双模态成像组合物。
10.根据权利要求9所述的造影剂在制备用于肺小结节定位的药物中的应用。
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