CN114088951A - 心肌梗塞多指标联合检测的微流控芯片及装置和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学即时诊断技术领域；针对偏远地区心肌梗塞患者难以得到及时诊断的现状，本发明提供一种心肌梗塞多指标联合检测微流控芯片及装置和检测方法，微流控芯片是由3D打印疏水基底、滤纸微通道和封盖组成的夹芯结构芯片，相较于传统的微流控芯片及纸基设备，该芯片无需外置注射泵，同时省略了对滤纸的亲疏水处理，借助滤纸本身的毛细作用和基底的疏水作用即可实现液体的有效迁移；检测装置包括：成像平台和智能终端，利用成像平台结合智能终端的检测系统对芯片进行比色分析能够快速获取检测结果；心肌梗塞多指标检测芯片及装置操作简单、制作成本低，小巧便携，可用于心肌梗塞疾病的早期筛查和现场即时诊疗监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术，借助无驱动的微流控芯片结合检测装置实现对多种心肌梗塞生物指标的联合检测，属于医学即时诊断技术领域，更具体的说，涉及一种心肌梗塞多指标联合检测的微流控芯片及装置和检测方法。
背景技术
心肌梗塞（MI）是冠状动脉综合征的临床形式之一，是人类疾病中引起死亡的主要原因之一。当心肌梗塞发生时，通常会伴随着血液中心肌损伤生物指标的浓度急剧增加，因此通过检测相关的生物指标浓度，可进一步预判和确定心肌梗塞疾病的患病风险。目前，用于检测MI的技术主要包括酶联免疫吸附法、电化学发光测定法和表面等离子体共振法等，常用到的检测仪器主要有酶标仪、全自动电化学免疫分析仪和表面等离子体共振分析仪等。然而，这些测试一般只能在医院或专门的诊断中心进行，且需要专业人员操作和庞大的仪器，使得许多患者无法得到即时诊断。
微流控芯片是微流控技术实现的主要平台，它把生物和化学等领域中所涉及的采样、稀释、进样、反应、分离、检测等基本操作单元集成到很小的芯片上，实现常规化学或生物实验室的功能，具有操作简单、成本低、能够大量平行处理样本、可即用即弃等优点，在生物、化学、医学等领域有着巨大的应用潜力。
在许多检测平台中，尤其是微流控芯片已经被开发用于即时检测分析。如Guo等人（Li H F, Zhao M, Liu W, etal. Polydimethylsiloxane microfluidicchemiluminescence immunodevice with the signal amplification strategy forsensitive detection of human immunoglobin G. Talanta, 2016, 147, 430-436.）开发了一种基于信号放大策略的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控化学发光免疫检测芯片，用于检测人免疫球蛋白。Jiang等人（Hu B F, Li J J, Jiang X Y, etal. An automated andportable microfluidic chemiluminescence immunoassay for quantitativedetection of biomarkers. Lab on a Chip, 2017, 17, 2225-2234.）开发了一种完全集成和独立的微流控化学发光免疫检测芯片，用于临床样本中包括C反应蛋白和睾酮在内的生物指标的定量检测。但他们所用到的微流控芯片需要一个泵来控制流体流量，从而增加了检测的复杂性和成本。而纸基设备以其低成本、操作步骤简单、检测周期短、样品和试剂消耗量小且无需外泵来驱动液体的流动等优点受到了很多研究者的关注，并且在免疫检测方面也有很多应用，如Jiao等人（Jiao Y C, Du C, Zong L J, et al.3D vertical-flowpaper-based device for simultaneous detection of multiple cancer biomarkersby fluorescent immunoassay. Sensors& Actuators: B. Chemical, 2020, 306,127239.）基于折纸原理，制作了一种新型三维垂直流动纸基设备，结合夹心型荧光免疫分析法，实现了对多种肿瘤指标的同时检测。Guo等人（Guo X Y, Zong L J, Jiao Y C, etal. Signal-Enhanced Detection of Multiplexed Cardiac Biomarkers by a Paper-Based Fluorogenic Immunodevice Integrated with Zinc Oxide Nanowires.Analytical Chemistry, 2019, 91, 9300-9307.）设计了一种三维折叠纸基免疫检测设备，利用荧光免疫夹心分析法实现了对多种心肌梗塞指标的同时检测。但是这些纸基设备需要对其进行复杂的亲疏水处理，从而增加了制作纸基设备的时间和成本。
近年来，随着智能设备如智能手机、平板电脑的发展与普及，将这些智能设备用于检测疾病指标的技术越来越多，如Biswas等人（Biswas S K, Chatterjee S,Bandyopadhyay S, et al. Smartphone-Enabled Paper-Based Hemoglobin Sensor forExtreme Point-of-Care Diagnostics. ACS Sensors, 2021, 6, 1077-1085.）提出了一种简单的纸基传感器，它与智能手机结合利用比色分析的方法实现了对人血液中血红蛋白的定量检测。Wang等人（Xu Wang, Fang Li, ZiqiCai, et al. Sensitive colorimetricassay for uric acid and glucose detection based on multilayer-modified paperwith smartphone as signal readout. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2018, 410, 2647-2655.）通过智能手机获取彩色图像并进行颜色分析来量化分析物的浓度，实现了对血清样品中尿酸和葡萄糖的定量检测。上述把生物检测的比色分析方法与微流控技术结合并借助智能设备进行即时检测，在疾病即时检测领域具有较大的应用潜力。
综上所述，对于心肌梗塞生物标志物的大型仪器检测，一般只能在特定的医疗机构进行，使许多患者难以得到及时的诊断，而微流控芯片技术虽然在即时检测领域具有较大的应用潜力，但是传统的微流控芯片需要外泵来驱动芯片内液体的流动，增加了检测的成本和复杂性。纸基设备不需要外泵来驱动液体的流动，但需要对其进行复杂的亲疏水处理，增加了制作纸基设备的时间和成本。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种心肌梗塞多指标联合检测的微流控芯片及装置和检测方法，该发明解决现在大型检测设备以及基于微流控芯片方面在疾病标志物即时检测中所存在的问题，能够实现对多种心肌梗塞指标的快速定量检测，便携易操作的检测设备借助新型微流控芯片实现对多种心梗标志物同时检测以确保对疾病的准确判断。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种用于心肌梗塞多指标联合检测的无驱动的微流控芯片，微流控芯片包括封盖和基底，滤纸微通道置于封盖和基底之间，封盖和基底设置用于放置滤纸微通道的凹槽，凹槽与滤纸微通道相匹配；封盖设置若干封盖凸起、一个冲洗通孔和若干用于滴加液体的第一通孔，冲洗通孔位于封盖中心位置，若干第一通孔分布在冲洗通孔四周；基底设置基底凹槽和若干固定孔，封盖和基底通过封盖凸起和固定孔连接。
进一步，封盖板面小于基底板面，基底凹槽延伸至基底的边缘。
一种用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，检测装置包括用于放置无驱动的微流控芯片的成像平台和置于智能终端内的多指标联合检测的检测系统，成像平台包括壳体和底座，壳体顶部设有拍照孔，壳体内部自上而下依次为光学透镜、用于安装光学透镜的支架和微流控芯片卡槽；检测系统通过调用智能终端的摄像头对标准品或待测品在微流控芯片检测区拍照，利用所获取的图像得到检测区显色的饱和度，根据饱和度建立心肌梗塞指标浓度与饱和度的标准方程，根据待测品的饱和度和标准方程计算待测品中心肌梗塞指标的浓度并在终端界面显示。
进一步，壳体内壁顶部设置光源。
进一步，光学透镜为菲涅尔透镜。
进一步，微流控芯片卡槽与壳体为抽拉式结构。
进一步，拍照孔的直径不小于15mm。
一种心肌梗塞多指标联合检测的检测方法，通过上述的微流控芯片检测心肌梗塞的指标，预制无驱动的微流控芯片，在不同的第一通孔内滴加不同底物溶液，心肌梗塞指标检测区显示不同的颜色，根据显色区不同的饱和度在检测系统中显示心肌梗塞指标的浓度值，具体包括以下步骤：
步骤1. 预制无驱动的微流控芯片；
步骤2. 将待测品通过第一通孔滴加到检测区，室温孵育15 min，冲洗并干燥；向检测区滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级捕获抗体孵育15~20 min，冲洗干燥；
步骤3. 向不同的检测区滴加基于HRP显色的不同底物溶液，针对心肌梗塞指标显示不同的颜色；待检测区显色完全后，将微流控芯片放入微流控芯片卡槽中，通过智能终端对微流控芯片检测区的显色区拍照得到待测品显色图片的饱和度；
步骤4. 检测系统根据心肌梗塞指标浓度和饱和度之间关系的标准方程，结合步骤3获取的饱和度计算得到心肌梗塞指标的浓度值并在检测系统的界面显示。
进一步，步骤1中，预制无驱动的微流控芯片包括以下步骤：
步骤1.1 向微流控芯片检测区滴加浓度为0.25 mg/mL壳聚糖溶液，室温孵育15min；然后向检测区滴加浓度为2.5%的戊二醛溶液，室温活化2 h，用超纯水冲洗并干燥，使得微流控芯片检测区形成醛基用于固定一级捕获抗体；
步骤1.2 将不同浓度的各心肌梗塞指标一级捕获抗体分别固定到不同的检测区，室温孵育，冲洗并干燥；利用1%牛血清白蛋白封闭检测区，室温孵育，冲洗并干燥。
综上所述，发明具有以下有益效果：
本发明提出的用于心肌梗塞多指标联合检测的微流控芯片，只需借助滤纸的毛细作用力就能驱动滴加在芯片内液体的流动，无需外泵来驱动液体的流动，使检测平台更加简洁，且不需对滤纸进行疏水化处理；微流控芯片疏水外壳利用3D打印技术制作，方便快捷，可以进行大规模生产，拆卸方便可重复利用。成像平台是利用3D打印技术制作出来的，制作成本低，结合酶联免疫吸附法借助多种显色对多种心肌梗塞生物指标同时检测使得对心肌梗塞疾病的判断更加准确，利用成像平台结合智能终端的检测系统对芯片进行比色分析能够快速的获取检测结果，在现场即时检测领域以及医疗条件欠发达地区进行心肌梗塞疾病的预判具有很大的应用潜力。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片结构示意图；
图2为本发明的封盖结构示意图；
图3为本发明成像平台结构示意图；
图4为本发明中智能设备上安装的检测软件界面图。
图中：1：封盖；1-1：封盖凸起；1-2：第一通孔；1-3：封盖凹槽，1-4：冲洗通孔；2：滤纸微通道；3：基底；3-1：固定孔；3-2：基底凹槽；4：壳体；5：拍照孔；6：微流控芯片卡槽；7：LED灯圈；8：支架；9：底座。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图1~2所示，本发明公开了一种用于心肌梗塞多指标联合检测的无驱动的微流控芯片，无驱动的微流控芯片无需外置注射泵，借助滤纸本身的毛细作用和基底的疏水作用即可实现液体的有效迁移，且可重复拆卸、组装，满足芯片高效利用的需求，微流控芯片包括封盖1和基底3，滤纸微通道2置于封盖1和基底3之间，滤纸微通道2选用Whatman 3MM滤纸，封盖1和基底3设置用于放置滤纸微通道2的凹槽，凹槽与滤纸微通道2相匹配，滤纸微通道2置于凹槽内，当液体在滤纸微通道2上流动时，封盖凹槽1-3能够避免流动的液体接触到封盖1，不会造成封盖1的污染，封盖1实现多次重复利用；封盖1设置若干封盖凸起1-1、一个冲洗通孔1-4和若干用于滴加液体的第一通孔1-2，若干第一通孔1-2作为检测区和显色区，每个检测区检测一种心肌梗塞指标，冲洗通孔1-4位于封盖1中心位置，冲洗缓冲液通过冲洗通孔1-4滴加至滤纸微通道2，若干第一通孔1-2分布在冲洗通孔1-4四周；基底3设置基底凹槽3-2和若干固定孔3-1，封盖1和基底3通过封盖凸起1-1和固定孔3-1连接，图2所示实施例中，封盖凸起1-1设置为方形，固定孔3-1与封盖凸起1-1相匹配，滤纸微通道2放入基底凹槽3-2中，封盖1和基底3组装完成即得到无驱动的微流控芯片，封盖1板面小于基底3板面，基底凹槽3-2延伸至基底3的边缘，基底凹槽3-2可作为废液流出通道，使得冲洗后的缓冲液流出微流控芯片；封盖1和基底3选用聚乳酸树脂等具有一定疏水性的材料制作；图1-2所示实施例中，第一通孔1-2的数量为4个，呈十字型分布于冲洗通孔1-4四周，其中三个第一通孔1-2用于检测人心型脂肪酸结合蛋白（FABP）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肌红蛋白（MYO）三种心肌梗塞指标，一个第一通孔1-2用于空白对照。
本发明还公开了一种用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，检测装置包括用于放置无驱动的微流控芯片的成像平台和置于智能终端内的多指标联合检测的检测系统，成像平台包括壳体4和底座9，成像平台可使用3D打印技术制作，壳体4顶部设有拍照孔5，拍照孔5的直径不小于15mm，壳体4内部自上而下依次为光学透镜、用于安装光学透镜的支架8和微流控芯片卡槽6，光学透镜置于支架8上，支架8的中心位置开设用于观察微流控芯片的通孔，微流控芯片卡槽6与壳体4为抽拉式结构；壳体4内壁顶部设置光源7，用于智能终端拍照时提供均匀光照；光学透镜为菲涅尔透镜，用于偏折微流控芯片第一通孔1-2内的光线，保证智能终端拍摄图像的均匀性，同时对微流控芯片检测区的图像具有成像放大作用，本实施例中，光学透镜的焦距为40mm，光源7选用直径40mm，电压为12V的LED灯圈，光学透镜边长为23mm。
检测系统通过调用智能终端的摄像头对标准品或待测品在微流控芯片的检测区拍照，利用所获取的图像得到检测区显色的饱和度即S值，饱和度与心肌梗塞指标浓度是一一对应关系，根据对已知浓度心肌梗塞指标的标准品在微流控芯片的检测区上显色获取的S值，建立各心肌梗塞指标浓度与相应的S值之间的标准方程，并将已建立的标准方程内置到检测系统中，将已知的高浓度的样品稀释成不同浓度的标准品，标准方程是通过将不同浓度的标准品加入到微流控芯片中显色后，利用检测系统获取相应的饱和度，将所获得的相应的饱和度与对应的心肌梗塞指标浓度进行线性拟合得到该指标浓度的线性方程，线性方程作为标准方程编写到智能终端的检测系统中，各检测指标的标准方程预先保留在检测软件中，对待测样本检测时，无需对标准品拍照分析建立标准方程，根据待测品的饱和度和标准方程，计算待测品中心肌梗塞指标的浓度并在终端界面显示，检测系统使用Java语言编写，在Android设备上运行，智能终端安装“MI Detect”检测软件，其检测界面如图4所示，具体操作如下：
屏幕上点击图标进入主界面，主界面有三个按钮选项：“Detect”、“History”和“Quit”， 点击“History”按钮选项，显示历史检测记录数据；点击“Quit”按钮选项，退出应用程序；点击主界面“Detect”按钮，进入检测界面，此时应用程序调用手机摄像头进行显色图像预览，在预览界面显示一个十字形对准框，对准框与显色图像对准，摄像头自动对焦后，点击相机图标按钮，自动获取对准框区域内颜色的S（饱和度）值。最后点击“Next”按钮，显色图像的S值及检测结果显示在结果界面上。
本发明还公开了一种心肌梗塞多指标联合检测的检测方法，通过上述的检测装置检测心肌梗塞的指标，预制无驱动的微流控芯片，在不同的第一通孔1-2内滴加不同底物溶液，心肌梗塞指标检测区显示不同的颜色，根据显色区不同的饱和度在检测系统中显示心肌梗塞指标的浓度值，具体包括以下步骤：
步骤1. 预制无驱动的微流控芯片；预制微流控芯片包括以下步骤：
步骤1.1 向微流控芯片检测区滴加浓度为0.25 mg/mL壳聚糖溶液，室温孵育15min；然后向检测区滴加浓度为2.5%的戊二醛溶液，室温活化2 h，用超纯水冲洗并干燥，使得微流控芯片的检测区形成醛基用于固定一级捕获抗体。
步骤1.2 将不同浓度的各心肌梗塞指标一级捕获抗体分别固定到不同的检测区，室温孵育，冲洗并干燥；利用1%牛血清白蛋白封闭检测区，室温孵育，冲洗并干燥。
步骤2. 将待测品通过第一通孔1-2滴加到检测区，室温孵育15 min，冲洗并干燥；向检测区滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级捕获抗体孵育15~20 min，冲洗干燥。
步骤3. 向不同的检测区滴加基于HRP显色的不同底物溶液，针对心肌梗塞指标显示不同的颜色；待检测区显色完全后，将微流控芯片放入微流控芯片卡槽6中，通过智能终端对微流控芯片检测区的显色区拍照得到待测品显色图片的饱和度。
步骤4. 检测系统根据心肌梗塞指标浓度和饱和度之间关系的标准方程，结合步骤3获取的饱和度计算得到心肌梗塞指标的浓度值并在检测系统的界面显示。
本发明还可以借助ELISA的方法或者单纯的化学显色方法对其他物质进行快速定量检测，应用范围广。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于心肌梗塞多指标联合检测的无驱动的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括封盖（1）和基底（3），滤纸微通道（2）置于封盖（1）和基底（3）之间，封盖（1）和基底（3）设置用于放置滤纸微通道（2）的凹槽，凹槽与滤纸微通道（2）相匹配；所述封盖（1）设置若干封盖凸起（1-1）、一个冲洗通孔（1-4）和若干用于滴加液体的第一通孔（1-2），冲洗通孔（1-4）位于封盖（1）中心位置，若干第一通孔（1-2）分布在冲洗通孔（1-4）四周；所述基底（3）设置基底凹槽（3-2）和若干固定孔（3-1），封盖（1）和基底（3）通过封盖凸起（1-1）和固定孔（3-1）连接。
2.根据权利要求1所述的用于心肌梗塞多指标联合检测的无驱动的微流控芯片，其特征在于：所述封盖（1）板面小于基底（3）板面，基底凹槽（3-2）延伸至基底（3）的边缘。
3.一种用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，其特征在于：所述检测装置包括用于放置无驱动的微流控芯片的成像平台和置于智能终端内的多指标联合检测的检测系统，所述成像平台包括壳体（4）和底座（9），壳体（4）顶部设有拍照孔（5），壳体（4）内部自上而下依次为光学透镜、用于安装光学透镜的支架（8）和微流控芯片卡槽（6）；
所述检测系统通过调用智能终端的摄像头对标准品或待测品在微流控芯片检测区拍照，利用所获取的图像得到检测区显色的饱和度，根据饱和度建立心肌梗塞指标浓度与饱和度的标准方程，根据待测品的饱和度和标准方程计算待测品中心肌梗塞指标的浓度并在终端界面显示。
4.根据权利要求3所述的用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，其特征在于：所述壳体（4）内壁顶部设置光源（7）。
5.根据权利要求3所述的用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，其特征在于：所述光学透镜为菲涅尔透镜。
6.根据权利要求3所述的用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，其特征在于：所述微流控芯片卡槽（6）与壳体（4）为抽拉式结构。
7.根据权利要求3所述的用于心肌梗塞多指标联合检测的检测装置，其特征在于：所述拍照孔（5）的直径不小于15mm。
8.一种心肌梗塞多指标联合检测的检测方法，通过权利要求1所述的微流控芯片检测心肌梗塞的指标，其特征在于：预制无驱动的微流控芯片，在不同的第一通孔（1-2）内滴加不同底物溶液，心肌梗塞指标检测区显示不同的颜色，根据显色区不同的饱和度在检测系统中显示心肌梗塞指标的浓度值，具体包括以下步骤：
步骤1. 预制无驱动的微流控芯片；
步骤2. 将待测品通过第一通孔（1-2）滴加到检测区，室温孵育15 min，冲洗并干燥；向检测区滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级捕获抗体孵育15~20 min，冲洗干燥；
步骤3. 向不同的检测区滴加基于HRP显色的不同底物溶液，针对心肌梗塞指标显示不同的颜色；待检测区显色完全后，将微流控芯片放入微流控芯片卡槽（6）中，通过智能终端对微流控芯片检测区的显色区拍照得到待测品显色图片的饱和度；
步骤4. 检测系统根据心肌梗塞指标浓度和饱和度之间关系的标准方程，结合步骤3获取的饱和度计算得到心肌梗塞指标的浓度值并在检测系统的界面显示。
9.根据权利要求8所述的心肌梗塞多指标联合检测的检测方法，其特征在于：所述步骤1中，预制无驱动的微流控芯片包括以下步骤：
步骤1.1 向微流控芯片检测区滴加浓度为0.25 mg/mL壳聚糖溶液，室温孵育15 min；然后向检测区滴加浓度为2.5%的戊二醛溶液，室温活化2 h，用超纯水冲洗并干燥，使得微流控芯片检测区形成醛基用于固定一级捕获抗体；
步骤1.2 将不同浓度的各心肌梗塞指标一级捕获抗体分别固定到不同的检测区，室温孵育，冲洗并干燥；利用1%牛血清白蛋白封闭检测区，室温孵育，冲洗并干燥。
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