CN111569961B - 一种一次性纸基数字微流控检测芯片及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种一次性纸基数字微流控BNP标志物检测芯片，所述芯片包括：下极板和上极板，所述下极板按照从下向上的顺序依次包括基底、电极层、介电层、疏水层四层结构，所述上极板包括透明基底和透明电极。该检测芯片能够简化人员操作和自动化处理样品的要求，能够实现多种微量液滴样品的操作，而且还具有低成本、快速、即用即抛、回收及运输简便的特点，同时具有检测时间短、检出限低、灵敏度高的优势。另外，本发明还提供了使用该检测芯片对BNP‑B型脑钠肽快速全自动检测的方法。

Description

一种一次性纸基数字微流控检测芯片及其检测方法
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体而言涉及一种一次性纸基数字微流控检测芯片以及使用该芯片检测心肌标志物脑钠肽(BNP)的方法。
背景技术
BNP-B型脑钠肽，主要来源于心室。它的含量与心室的压力，呼吸困难的程激素调节系统的状况相关。心室的体积和压力增高可导致血浆内BNP的升高，升高的程度与心室扩张和压力超负荷成正比可敏感和特异性反映左心室功能的变化。临床上检测BNP浓度值可以协助诊断心力衰竭，判断病情的严重程度和预后恢复情况，其判断临界值为100pg/mL，低于此值时即能排除心衰风险。
传统医院及生化实验室、大型医疗设备中进行的各种临床检测方法虽然具有精确度高，诊断效力强，同时可针对大量样本进行快速检测的优势，但是其一般要求现场具有相应的实验室设施环境，所采购的设备购置成本高，检测结果通常含有大量医学指标，对于检测人员的操作及医学知识水平均有较高的要求，无法适应社区、家庭、急救、战乱等紧急或非常规医疗环境的需求。
为了实现检测流程的快速化、自动化，操作流程的简易化、无害化，检测结果的准确及易读性，检测装置的低成本及小型化便携性要求等，人们已经开发了多种技术和产品，如检测试剂盒，试纸，连续流微流控芯片，数字微流控芯片等。例如中国专利CN201810463747公开了一种N末端脑钠肽前体检测试剂盒及其检测方法，中国专利CN201510696683公开了一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，中国专利CN201710780455公开了一种数字微流控基板及其制作方法、数字微流控芯片及方法。
目前，体外诊断(IVD)主要有两种发展趋势：一种是自动化、一体集成化，即利用大型医院配套的中心实验室的全自动化、高灵敏的大型仪器设备，实现高精度的疾病分析诊断；另一种小型化、床旁化，即通过掌上小型简易设备，实现现场快速分析诊断。
对于小型化的现场快速分析方案，现有技术中公开的这些芯片或检测方法仍然存在如下缺陷：
(1).对于检测试剂盒类产品，其一般是将检测过程所需的试剂配置好，并提供实验相关器材，如离心管、移液枪枪头等，打包后以类似于急救包的形式进行分发，其省去了操作人员配置相关试剂的过程，但同时，试剂盒仍要求操作人员具有一定的医学知识及生化操作技能，实际操作过程仍然靠人来完成，难以规避人为因素造成的影响。
(2).对于试纸类产品，纸张作为产品的基材得到了广泛的运用，人们通过各种印刷工艺在纸张上实现了各种检测方案，如化学显色、胶体金免疫层析等，其极大地简化了操作流程，无相关医学知识的人员在使用特定的试纸产品时只需要根据说明书进行操作，但是其缺点在于试纸平台上的检测项目较为局限，难以实现复杂流程及高精度的检测方法，如需要多次洗脱及加样的磁珠ELISA 检测方法等。
(3).对于连续流微流控芯片产品，市面上常见的芯片多为气压驱动、微泵驱动或离心驱动的生化检测盘、检测芯片等，其材质多为PMMA等硬质树脂，可实现复杂流程的微量样品快速自动检测，但由于产品微通道尺寸小，进样后必然存在死体积及清洗问题，多次使用后的清洗程度也无法进行相应的评估，从而干扰检测结果的准确性，难以长期重复利用，由此也带来了环保和回收的问题。同时芯片外围设备需要配套清洗装置、驱动装置等，其最终产品尺寸不再具有便携性上的优势。
由于上述产品及技术的不足，人们开发了数字微流控(Digital microfluidics,DMF)相关产品，它是是一种以体积为微升或纳升级别的微液滴为操控单元的微流体控制技术。该技术能够通过精确操控液滴移动，实现液滴的指定方向上的运动、融合、分离等操作，完成各种生物化学反应。基于介电润湿效应 (Electrowetting on dielectrics,EWOD)的数字微流控芯片通过在控制电极上施加电压，液滴在接触界面上施加电场后会增加其表面浸润程度，表现为液体在介电层固体表面的接触角下降，去电后液滴接触角回复正常，当存在连续的周期性和方向上的电场变化时，液滴在电极间接触角的变化导致了其整体的前进和回缩，可实现在无外加驱动泵的条件下液滴连续产生、移动、分裂和融合等复杂操作，满足生化检测中的复杂操作需求。数字微流控产品能够很好地迎合小型化、自动化、平台化的检测需求，但基于电润湿原理的检测芯片主要是采用微电子加工工艺在玻璃、硅片和PCB等硬质基材上制作，材料成本较高。对于多次重复检测来说，同样存在清洗和废弃的问题，同时其制作相较连续流微流控芯片更加复杂，回收成本较高。因此如能解决其制造成本和芯片原材料问题，数字微流控产品必然能得到更广泛的应用。
本发明结合了试纸产品及数字微流控技术的纸基数字微流控检测平台技术，可以将数字微流控技术所需的各类电极印刷在纸张上，降低了芯片的制作成本及周期；也能将试纸类产品集成在在纸基数字微流控芯片上，实现功能上的延展及互补。此外，纸张作为环保可再生可回收材料，有效的避免了PCB、硅晶圆、玻璃等材料带来的高制作、回收成本和废弃污染问题。
发明内容
为了解决现有技术的上述问题，本发明的一个目的在于提供一种一次性纸基数字微流控BNP标志物检测芯片，不仅达到简化人员操作和自动化处理样品的要求，能够实现多种微量(微升/纳升级别)液滴样品的操作，而且还具有低成本、快速、即用即抛、回收及运输简便的特点。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种一次性纸基数字微流控检测芯片，所述芯片包括：下极板和上极板，所述下极板按照从下向上的顺序依次包括基底、电极层、介电层、疏水层四层结构，所述上极板包括透明基底和透明电极；
其中，所述下极板划分为引脚区、储液区、运动区、检测区及废液收集区；
所述下极板的电极层的电极图案包括驱动电极、储液电极和引脚电极，驱动电极和储液电极为工作电极，引脚电极只提供电信号的转接。
优选地，所述驱动电极为至少两排并排排列的电极单元，作为液滴运动的通道，形成所述运动区，每个电极单元为具有带锯齿状边缘设计的正方形，相邻两个电极单元的锯齿状边缘相互契合，所述驱动电极的一端紧邻检测区，另一端紧邻废液收集区；
优选地，所述电极单元的正方形状的边长L为1.8mm至2.4mm，更优选为2.1mm，所述正方形的边长L与锯齿的半高度d之间的比值L:d为12 至16。
优选地，所述储液电极作为存储样品或试剂的区域，并能够实现液滴的存储、拉出及回液，构成所述储液区，并与所述驱动电极垂直设置，所述储液电极分为A、B和C三个电极单元，其中电极单元A为两端为锯齿边缘的长方形，一端与所述驱动电极中单个所述电极单元的锯齿状边缘相互契合。
所述电极单元为B一端具有凹部，相对一端具有凸部的长方形，所述凹部与所述电极单元A中相对所述驱动电极的一端的锯齿状边缘相互契合，所述凸部的边缘平直。
所述电极单元C为一端具有凹部的长方形，所述凹部与所述电极单元B 中的所述凸部相互契合。
所述电极单元A的宽度小于电极单元B和C的宽度，与所述驱动电极中的所述电极单元的正方形边长L相同，所述电极单元B和C的宽度相同，所述电极单元B的长度为LB，所述电极单元C的长度为LC，优选地，LB/LC比值区间为0.25-0.5。
优选地，所述检测区紧邻所述驱动电极的一端，用于收集经运动区移动的反应后的液滴，并显色。
优选地，所述检测区为半圆形试纸，所述试纸可选用滤纸、层析纸或其他试纸类产品，同样具有纸芯片成本低的优势。当液滴移动到检测区域层析纸附近的电极时，其受到层析纸中的纤维结构毛细力的作用拉扯，使得液滴能够在不需要施加外力的情况下自动地进入到检测区域中。
优选地，所述废液收集区紧邻所述驱动电极的紧邻所述检测区一端的相对一端，用于收集经运动区移动的反应后的废液。
优选地，所述下极板的所述基底为纸张制品，例如可以为表面光滑且可打印或印刷的相纸、打印纸、铜版纸等。例如EPSON光面相纸和HP光面相纸。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种BNP-B型脑钠肽快速全自动检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)将表面链霉亲和素-生物素-捕获抗体修饰的磁珠颗粒分散液加注到第一储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个磁珠分散液滴，并将该液滴移动至所述运动区的一列电极单元中的一个或多个上，通过磁场将磁珠固定，并通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区；
2)将含有BNP的样品溶液加注到第二储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个样品溶液分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤1)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，使BNP与磁珠表面的捕获抗体反应并固定在磁珠表面，通过液滴运动使其混合充分，然后通过磁场将表面固定有BNP的磁珠固定，并通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区；
3)将PBS缓冲液(标准磷酸盐缓冲溶液)加注到第三储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个缓冲液分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤2)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，对表面固定有BNP的磁珠进行洗脱，通过磁场将表面固定有BNP的磁珠固定，然后通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区，该步骤重复三次；
4)将含有辣根过氧化物酶(HRP)修饰的酶标抗体-溶液加注到第四储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤3)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，使BNP与酶标抗体进行反应，通过液滴运动使其混合充分2分钟，通过磁场将表面固定有链霉素亲和素-生物素-捕获抗体-BNP- 酶标抗体复合物的磁珠固定，然后通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区；
5)重复步骤3)三次；
6)将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢(H2O2)显色液加注到第五储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤4)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，进行HRP催化的TMB与H2O2的氧化还原反应，TMB氧化后产生的二亚胺可使溶液呈淡蓝色，且其颜色深浅与二亚胺浓度正相关。然后去除磁场，通过控制所述运动区的所述电极单元将含有磁珠的液滴移动至检测区；
7)对检测区进行色度分析。
优选地，其中步骤7)如下进行：
71)建立标准曲线，采用RGB颜色分析法根据吸收了不同浓度的BNP 的作为检测区的试纸的色度与BNP浓度的关系，建立色度与BNP浓度的标准曲线；
72)步骤6)的含有磁珠的液滴移动至检测区后静置5min，待其显色稳定；
73)采集检测区的色度值，并根据采用RGB颜色分析法与步骤71)中的标准曲线进行对比，得到BNP浓度数值。
优选地，所述步骤73)中检测区的色度值的采集可以使用色度检测仪检或直接手机照相然后进行图像分析，当使用手机照相时需保证测量条件与标准曲线测量条件一致。
有益效果
根据本发明的检测芯片具有以下优势：
1)可以实现微量样品的检测，本芯片操作的液滴均在微升级别，极微量的样品即可完成检测，其样品中BNP浓度检出限为20.9pg/mL，检测时间为 12min，具有检测时间短、检出限低、灵敏度高的优势。
2)整个检测过程实现了自动化，不需要人为干预，仅需要人工加样即可，检测结果直接输出BNP浓度值，对人员的操作水平及医学知识水平要求低。
3)根据本发明的检测芯片为一次性使用方式，即抛式的使用方式操作避免了清洗步骤，同时制造成本低，适用于单次检测的应用场景。
4)通用化的检测操纵过程，对于不同检测项目，其检测步骤可切分为液滴级别上的移动、混合、分离等，其基本逻辑相似，针对不同的检测路径只需更改基底上的电极布局即可，不需要更换外围的驱动及配套装置。
5)该纸基芯片平台可集成各种纸芯片，实现如化学显色、免疫层析、胶体金等常用的检测方案，从而在单芯片上集成了数字微流控和显色示纸/侧向层析检测试纸两种功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据本发明的一次性纸基数字微流控芯片检测平台的照片；
图2为根据本发明的检测芯片中电极层的电极图案；
图3为所述运动区的所述电极单元的形貌图案；
图4为所述储液电极的结构图示意图；
图5为根据本发明的所述运动区的所述电极单元的边缘与液滴的关系图；
图6为使用根据本发明的检测芯片的脑钠肽检测过程的示意图。
图7为根据本发明实施例1的检测芯片检测的BNP浓度与色度值的对应关系的拟合曲线函数图，证明检测样品的浓度检出值与实际值有比较好的对应关系。
附图标记
1-引脚区，2-储液区，3-运动区，4-检测区，5-废液收集区，11-引脚电极， 21-储液电极，31-驱动电极，311-电极单元
具体实施方式
在下文中，将参照附图详细地描述本公开的优选的实施方式。在描述之前，应当了解在说明书和所附权利要求中使用的术语，并不应解释为局限于一般及辞典意义，而是应当基于允许发明人为最好的解释而适当定义术语的原则，基于对应于本发明技术层面的意义及概念进行解释。因此，在此的描述仅为说明目的优选实例，而并非是意指限制本发明的范围，因而应当了解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以做出其他等同实施和修改。
为了阐明本发明，在附图中省略了与描述无关的部分，并且在整个说明书中，相同或相似的部件由相同的附图标记表示。
另外，为了便于说明，任意地示出了附图中所示的每个部件的尺寸和厚度，因此本发明不必限于附图中所示的那些。
在整个说明书中，当提到某个元件“连接”到另一个元件时，它不仅包括“直接连接”，还包括其他构件之间的“间接连接”。另外，当提到某个元件“包括”某个部件时，这意味着该元件可以进一步包括其他部件而不是排除其他部件，除非相反地明确描述。
本文所使用的术语“第一”、“第二”等是用来解释各种构成元件，并且它们仅用于将一种构成元件与另一种构成元件区分的目的。
并且，本文中所使用的术语仅用于解释示例性实施例，且并不旨在限制本发明。单数表达也包括其复数表达，除非在上下文中另有明确表示。在本文中所使用的“包含”、“配备有”或“具有”之类的术语用于指定实践特性、数目、步骤、构成元件或其组合的存在，并且应当理解为不排除一个或多个其他特性、数目、步骤、构成元件或其组合的添加或存在的可能。
并且，如果一个层或一个元件被提及为形成于“层”或“元件”的“上面”或“上方”，这意味着每一个层或元件被直接形成在该层或元件上，或者在层、主体或基材之间可形成其他的层或元件。
下面参考图1至图5详细说明根据本发明的所述一次性纸基数字微流控 BNP标志物检测芯片的结构，所述芯片包括：下极板和上极板，所述下极板按照从下向上的顺序依次包括基底、电极层、介电层、疏水层四层结构，所述上极板包括透明基底和透明电极；
其中，所述下极板划分为引脚区1、储液区2、运动区3、检测区4及废液收集区5；
所述下极板的电极层的电极图案包括驱动电极31、储液电极21和引脚电极11，驱动电极31和储液电极21为工作电极，引脚电极11只提供电信号的转接。
优选地，所述驱动电极31为至少两排并排排列的电极单元311，作为液滴运动的通道，形成所述运动区3，每个电极单元311为具有带锯齿状边缘设计的正方形，相邻两个电极单元311的锯齿状边缘相互契合，所述驱动电极的一端紧邻检测区4，另一端紧邻废液收集区5；
参考图3和图5，所述电极单元311的正方形状的边长L为1.8mm至 2.4mm，更优选为2.1mm，所述正方形的边长L与锯齿的半高度d之间的比值L:d为12至16，当L/d值在此范围内时，可以有效地驱动单个液滴移动，而不会发生单个液滴直接的“黏连”现象。图5A表示当电极单元为标准正方形时液滴覆盖的情况，图5B表示当电极单元为根据本发明的带锯齿状边缘的正方形时液滴覆盖的情况。图5A与图5B的对比可以看出，当电极单元为根据本发明的带锯齿状边缘的正方形时，液滴覆盖的电极单元的边缘周长更长。
参考图4，所述储液电极21作为存储样品或试剂的区域，并能够实现液滴的存储、拉出及回液，构成所述储液区2，并与所述驱动电极31垂直设置，所述储液电极21分为A、B和C三个电极单元，其中电极单元A为两端为锯齿边缘的长方形，一端与所述驱动电极31中单个所述电极单元311的锯齿状边缘相互契合；
所述电极单元为B一端具有凹部，相对一端具有凸部的长方形，所述凹部与所述电极单元A中相对所述驱动电极31的一端的锯齿状边缘相互契合，所述凸部的边缘平直；
所述电极单元C为一端具有凹部的长方形，所述凹部与所述电极单元B 中的所述凸部相互契合。
所述电极单元A的宽度小于电极单元B和C的宽度，与所述驱动电极 31中的所述电极单元311的正方形边长L相同，所述电极单元B和C的宽度相同，所述电极单元B的长度为LB，所述电极单元C的长度为LC，优选地，LB/LC比值区间为0.25-0.5，这样可以实现在芯片侧面实时加注液体或试剂以保证加样区液体充足的基础上，通过操控信号连续不断地形成单个液滴，同时由于电极单元A、B和C均有相互契合的凹凸结构，使得单个液滴的形成更为顺畅，不会发生驱动力不足导致的液滴难以连续生成的问题。
优选地，所述检测区4紧邻所述驱动电极31的一端，用于收集经运动区 3移动的反应后的液滴，并显色。
优选地，所述检测区4为半圆形试纸，所述试纸可选用滤纸、层析纸或其他试纸类产品，同样具有纸芯片成本低的优势。当液滴移动到检测区4层析纸附近的电极时，其受到层析纸中的纤维结构毛细力的作用拉扯，使得液滴能够在不需要施加外力的情况下自动地进入到检测区域中。
优选地，所述废液收集区5紧邻所述驱动电极31的紧邻所述检测区4 一端的相对一端，用于收集经运动区3移动的反应后的废液。
优选地，所述下极板的所述基底为纸张制品，例如可以为表面光滑且可打印或印刷的相纸、打印纸、铜版纸等。例如EPSON光面相纸和HP光面相纸。
根据本发明的一次性纸基数字微流控检测芯片中所述检测区为半圆形试纸，所述试纸可选用滤纸、层析纸或其他试纸类产品。使优选使用层析纸，所述层析纸对液滴进行固定，借助层析纸吸去液滴中的水分，使得各类检测反应终程得到固定，便于读取检测结果，并保证了检测的准确性和稳定性。
优选地，根据本发明的BNP-B型脑钠肽快速全自动检测方法为免疫夹心法(Sandwich ELISA)，概括地说，首先向样品中加入链霉素亲和素-生物素- 捕获抗体修饰的磁珠分散液，通过BNP-捕获抗体结合的方式将样品中的BNP 富集在磁珠表面。用洗涤的方法使磁珠上形成的BNP-捕获抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入HRP标记的酶标抗体，也通过反应与BNP结合在磁珠上。此时磁珠上的HRP的量与样品中BNP的量对应相关。加入可与磁珠上固定的HRP进行显色反应的TMB显色液后，TMB被HRP催化与 H2O2发生氧化还原反应，并被氧化为显淡蓝色的二亚胺，二亚胺的量与标本中BNP的量直接相关且其颜色深度随其本身浓度增加而加深，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。同时由于HRP的催化效率很高，放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
本检测方法中所使用的市售试剂均为市售可得产品：
1)链霉素亲和素修饰的磁珠分散液产品，例如DynabeadsTM MyOneTMStreptavidin T1磁珠产品。
2)标准磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
3)BNP冻干标准品(试检用)。
4)生物素修饰的抗BNP抗体产品，如小鼠抗人BNP单克隆抗体 [50E1]，以下称为捕获抗体，辣根过氧化物酶(HRP)修饰的抗 BNP抗体产品，如小鼠抗人BNP单克隆抗体[24C5]，以下称为酶标抗体。
5)3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢(H2O2)显色液。
以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。
实施例1
1)取适量链霉素-生物素-捕获抗体修饰的磁珠颗粒分散液，加注到第一储液电极上，其中链接在磁珠上的捕获抗体典型浓度值为50μg/ml，磁珠浓度值为2.5mg/mL，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个磁珠分散液滴，并将该液滴移动至所述运动区的一列电极单元中的一个或多个上，通过磁场将磁珠固定，并通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区。
其中链霉素亲和素-生物素-抗BNP抗体修饰的磁珠颗粒如下制备：
a)取适量链霉素亲和素修饰的磁珠颗粒分散液产品原液(DynabeadsTM MyOneTMStreptavidin T1磁珠产品)，浓度稀释至2.5mg/mL。
b)将1)中稀释后的磁珠分散液与分散稀释在PBS溶液中的生物素标记的捕获抗体(小鼠抗人BNP单克隆抗体[50E1])在室温下混合，抗体浓度为0.1mg/mL，低速涡旋混匀30min。
c)使用磁场将溶液中的磁珠颗粒固定，静置2-3min。
d)使用PBS溶液加0.1％的牛血清蛋白进行冲洗4-5次，以封闭磁珠上的多余结合位点，然后重新稀释密度至2.5mg/mL，其固定在磁珠上的抗体浓度为50μg/mL。
2)将含有BNP的样品溶液加注到第二储液电极上，使用的待测样品浓度区间为10-2000pg/mL，其由BNP冻干标准品加PBS缓冲液稀释而来，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个样品溶液分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤1)中负载单个磁珠分散液滴的所述运动区的所述电极单元上，使BNP与磁珠表面连接的捕获抗体反应并固定在磁珠表面，通过液滴运动使其混合充分，然后通过磁场将表面固定有BNP的磁珠固定，并通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区。
3)将PBS缓冲液(标准磷酸盐缓冲溶液)加注到第三储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个缓冲液分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤2)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，对表面固定有BNP的磁珠进行洗脱，通过磁场将表面固定有BNP的磁珠固定，然后通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区，该步骤重复三次。
4)将含有辣根过氧化物酶(HRP)修饰的酶标抗体溶液加注到第四储液电极上，其典型浓度值为0.8mg/mL，通过分别控制所述电极单元A、B和C 实现单个分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤 3)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，使BNP与酶标抗体进行反应，通过液滴运动使其混合充分2分钟，通过磁场将表面固定有链霉素亲和素-生物素-捕获抗体-BNP-酶标抗体复合物的磁珠固定，然后通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区。
5)重复步骤3)。
6)将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢(H2O2)显色液加注到第五储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤4)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，进行HRP催化的TMB与H2O2的氧化还原反应，TMB氧化后产生的二亚胺可使溶液呈淡蓝色，且其颜色深浅与二亚胺浓度正相关。然后去除磁场，通过控制所述运动区的所述电极单元将含有磁珠的液滴移动至检测区。
7)对检测区进行色度分析，其中：
71)建立标准曲线，采用RGB颜色分析法根据吸收了不同浓度的BNP 的作为检测区的试纸的色度与BNP浓度的关系，建立色度与BNP浓度的标准曲线；
72)步骤6)的含有磁珠的液滴移动至检测区后静置5min，待其显色稳定；
73)使用色度检测仪检或直接手机照相然后采集检测区的图像并进行色度值分析，并根据采用RGB颜色分析法与步骤71)中的标准曲线进行对比，得到BNP浓度数值。
其中含有BNP的样品溶液的浓度区间为0-2000pg/mL，从中选择如下表 1列出的7组浓度样品进行了3次重复试验，每组浓度计算三次实验测得值的标准差作为检测曲线的误差限，详细数据见如下表1。
表1
Figure BDA0002495787780000171
对上述数据进行线性拟合后，得到拟合曲线函数，具体见图7，经计算其R2值为0.9731，该值的统计学意义是说明拟合函数因变量值与自变量间的相关关系，越接近1说明该模型越能反映实际值情况。因此该模型函数可以很好的解释检测色度值与样品BNP浓度的对应关系，即通过本产品的事先标定，待检测样品的浓度检出值与实际值有比较好的对应关系。

Claims (11)

1.一种一次性纸基数字微流控检测芯片，所述芯片包括：下极板和上极板，所述下极板按照从下向上的顺序依次包括基底、电极层、介电层、疏水层四层结构，所述上极板包括透明基底和透明电极；
其中，所述下极板划分为引脚区、储液区、运动区、检测区及废液收集区；
所述下极板的电极层的电极图案包括驱动电极、储液电极和引脚电极，驱动电极和储液电极为工作电极，引脚电极只提供电信号的转接；
所述驱动电极为至少两排并排排列的电极单元，作为液滴运动的通道，形成所述运动区，每个电极单元为具有带锯齿状边缘设计的正方形，相邻两个电极单元的锯齿状边缘相互契合，所述驱动电极的一端紧邻检测区，另一端紧邻废液收集区；
所述电极单元的正方形状的边长L为1.8mm至2.4mm，所述正方形的边长L与锯齿的半高度d之间的比值L:d为12至16；
所述储液电极作为存储样品或试剂的区域，并能够实现液滴的存储、拉出及回液，构成所述储液区，并与所述驱动电极垂直设置，所述储液电极分为A、B和C三个电极单元，其中电极单元A为两端为锯齿边缘的长方形，一端与所述驱动电极中单个所述电极单元的锯齿状边缘相互契合；
所述电极单元为B一端具有凹部，相对一端具有凸部的长方形，所述凹部与所述电极单元A中相对所述驱动电极的一端的锯齿状边缘相互契合，所述凸部的边缘平直；
所述电极单元C为一端具有凹部的长方形，所述凹部与所述电极单元B中的所述凸部相互契合。
2.根据权利要求1所述微流控检测芯片，其特征在于，所述电极单元的正方形状的边长L为2.1mm。
3.根据权利要求1所述微流控检测芯片，其特征在于，所述电极单元A的宽度小于电极单元B和C的宽度，与所述驱动电极中的所述电极单元的正方形边长L相同，所述电极单元B和C的宽度相同，所述电极单元B的长度为LB，所述电极单元C的长度为LC，LB/LC比值区间为0.25-0.5。
4.根据权利要求1所述微流控检测芯片，其特征在于，所述检测区紧邻所述驱动电极的一端，用于收集经运动区移动的反应后的液滴，并显色。
5.根据权利要求1所述微流控检测芯片，其特征在于，所述检测区为半圆形试纸，所述试纸选用滤纸、层析纸或其他试纸类产品，当液滴移动到检测区域层析纸附近的电极时，其受到层析纸中的纤维结构毛细力的作用拉扯，使得液滴能够在不需要施加外力的情况下自动地进入到检测区域中。
6.根据权利要求1所述微流控检测芯片，其特征在于，所述废液收集区紧邻所述驱动电极的紧邻所述检测区一端的相对一端，用于收集经运动区移动的反应后的废液。
7.根据权利要求1所述微流控检测芯片，其特征在于，所述下极板的所述基底为纸张制品，所述纸张制品为表面光滑且可打印或印刷的相纸、打印纸、铜版纸。
8.根据权利要求7所述微流控检测芯片，其特征在于，所述纸张制品为EPSON光面相纸和HP光面相纸。
9.一种采用权利要求1至8中任意一项所述微流控检测芯片对BNP-B型脑钠肽快速全自动检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)将表面链霉亲和素-生物素-捕获抗体修饰的磁珠颗粒分散液加注到第一储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个磁珠分散液滴，并将该液滴移动至所述运动区的一列电极单元中的一个或多个上，通过磁场将磁珠固定，并通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区；
2)将含有BNP的样品溶液加注到第二储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个样品溶液分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤1)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，使BNP与磁珠表面的捕获抗体反应并固定在磁珠表面，通过液滴运动使其混合充分，然后通过磁场将表面固定有BNP的磁珠固定，并通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区；
3)将PBS缓冲液(标准磷酸盐缓冲溶液)加注到第三储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个缓冲液分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤2)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，对表面固定有BNP的磁珠进行洗脱，通过磁场将表面固定有BNP的磁珠固定，然后通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区，该步骤重复三次；
4)将含有辣根过氧化物酶(HRP)修饰的酶标抗体溶液加注到第四储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤3)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，使BNP与酶标抗体进行反应，通过液滴运动使其混合充分2分钟，通过磁场将表面固定有链霉素亲和素-生物素-捕获抗体-BNP-酶标抗体复合物的磁珠固定，然后通过控制所述运动区的所述电极单元将液体部分作为废弃液移动至另一列所述电极单元上，并最终移动至废液收集区；
5)重复步骤3)；
6)将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢(H2O2)显色液加注到第五储液电极上，通过分别控制所述电极单元A、B和C实现单个分散液滴，并控制所述运动区的所述电极单元将该液滴移动至步骤4)中负载磁珠的所述运动区的所述电极单元上，进行HRP催化的TMB与H2O2的氧化还原反应，TMB氧化后产生的二亚胺可使溶液呈淡蓝色，且其颜色深浅与二亚胺浓度正相关，然后去除磁场，通过控制所述运动区的所述电极单元将含有磁珠的液滴移动至检测区；
7)对检测区进行RGB色度分析。
10.根据权利要求9所述的BNP-B型脑钠肽快速全自动检测方法，其特征在于，步骤7)如下进行：
71)建立标准曲线，采用RGB色度分析法根据吸收了不同浓度的BNP的作为检测区的试纸的色度与BNP浓度的关系，建立色度与BNP浓度的标准曲线；
72)步骤6)的含有磁珠的液滴移动至检测区后静置5min，待其显色稳定；
73)采集检测区的色度值，并根据采用RGB颜色分析法与步骤71)中的标准曲线进行对比，得到BNP浓度数值。
11.根据权利要求10所述的BNP-B型脑钠肽快速全自动检测方法，其特征在于，所述步骤73)中检测区的色度值的采集使用色度检测仪检或直接手机照相然后进行图像分析，当使用手机照相时需保证测量条件与标准曲线测量条件一致。
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