CN110354920A - 一种纸基微流控芯片及基于其的磷酸化多肽的富集检测方法 - Google Patents

一种纸基微流控芯片及基于其的磷酸化多肽的富集检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型纸基微流控芯片及基于其的磷酸化多肽的富集检测方法。该芯片由纸基材料、疏水封闭材料、磷酸基团亲和试剂和显色试剂组成。其中，纸基材料由疏水封闭材料阻隔形成液流通道、富集区、显色区和吸水区，亲和试剂修饰在富集区用于特异性结合磷酸化多肽，显色试剂滴加在显色区，其颜色的变化可以指示磷酸化多肽的存在和含量。该芯片和方法可用于分析体液中磷酸化多肽的总量，或分析目标蛋白的磷酸化水平，具有简便、低成本的特点，特别适合于在医疗资源匮乏地区作为健康监测和医疗诊断的重要工具。

Description

一种纸基微流控芯片及基于其的磷酸化多肽的富集检测方法
技术领域
本发明涉及一种纸基微流控芯片及基于其的磷酸化多肽的富集检测方法，利用新型纸基微流控芯片，实现对磷酸化多肽的选择性富集和检测，属于分析检测技术领域。
背景技术
磷酸化是蛋白翻译后修饰的重要形式，在细胞信号转导、细胞分化、细胞增殖、周期调控、新陈代谢、转录和翻译、蛋白降解等方面具有关键作用。研究表明，哺乳动物中30％以上的蛋白存在磷酸化，异常的磷酸化与许多疾病相关。多肽是蛋白质水解的中间产物，也是参与生物体生长、发育、免疫、新陈代谢的重要物质，在生物体液或组织中，许多磷酸化多肽是潜在的生理病理标志物。尿液、血液等体液中的磷酸化多肽的分析检测，对肿瘤、帕金森氏症等疾病的早期诊断、预后监测、发病机制研究、药效研究等具有重要作用。
现有磷酸化多肽的富集方法，主要包括基于免疫识别的抗体富集法、基于消除反应的化学修饰法、基于亲和作用的固定金属离子、金属氧化物和金属氢氧化物富集法、基于电荷差异的离子交换色谱法等。常用的磷酸化多肽的检测方法包括质谱法、荧光光谱分析法、电化学检测法等。繁琐的步骤、高昂的成本、对大型仪器和专业操作人员的依赖等限制了上述方法在病房、野外、基层、家庭等医疗资源匮乏地区的广泛应用。
微流控芯片技术因其高度的集成能力、准确的微量液体操控能力和优异的便携性，而在分析检测领域具有广泛应用。传统的微流控芯片，其制作对场地、设备等条件的要求较为严格，制作成本也较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型纸基微流控芯片及基于该芯片的磷酸化多肽的富集检测方法。利用所提及的新型纸基微流控芯片可以针对磷酸化多肽实现操作简便、成本低廉的富集与检测。本发明的新型纸基微流控芯片因其低成本、高便携性、步骤简便、设计灵活等优点，有望在医疗资源匮乏地区成为健康监测和医疗诊断的重要工具。利用纸基微流控芯片，集成富集和检测两大功能，有望实现简便、低成本的磷酸化多肽的富集与检测。
本发明提供了一种纸基微流控芯片，由纸基材料、疏水封闭材料、磷酸基团亲和试剂和显色试剂组成，其中，利用常用的纸基芯片制作方法，使纸基材料由疏水封闭材料阻隔形成液流通道、富集区、显色区和吸水区，亲和试剂修饰在富集区用于特异性结合磷酸化多肽，显色试剂滴加在显色区，其颜色的变化可以指示磷酸化多肽的存在。。
其中，纸基材料可以选择由惰性纤维素形成的、具有毛细结构的、可以吸水的洁净纸材，例如定性滤纸、定量滤纸等。
其中，疏水封闭材料可以选择易加工的易与纸基材料结合的疏水材料。例如，聚丙烯膜、聚酯薄膜、PCR封板膜、ELISA封板膜、聚二甲基硅氧烷、蜡等。
其中，磷酸基团亲和试剂可以选择与磷酸基团具有特异性亲和作用的金属氧化物、固定化金属离子、抗体等试剂。例如，二氧化钛、二氧化锆、二氧化铈、二氧化锡、氧化镓、氧化铝、三氧化二铁、铈锆复合氧化物、磷酸化丝氨酸抗体、磷酸化苏氨酸抗体、磷酸化酪氨酸抗体等。
其中，显色试剂可以选择遇到肽段会发生颜色改变的试剂，如溴酚蓝、邻苯二甲醛、双缩脲试剂等。
其中，常用制作方法包括直接切割法、光刻法、喷蜡打印法等纸基微流控芯片的常用制作方法，可用于在纸基材料上用疏水封闭材料构建疏水阻隔，从而形成亲水的通道、富集区和显色区。
另一方面，本发明提供一种基于纸基微流控芯片的磷酸化多肽的富集检测方法，该方法包括如下步骤：步骤一：样品溶液的引入；步骤二：富集区的清洗；步骤三：磷酸化多肽的洗脱；步骤四：显色。
在上述的基于纸基微流控芯片的磷酸化多肽的富集和检测的基本步骤中，样品溶液从第一入口引入，并经过富集区，出口处与吸水纸相接以驱动液体流动。样品引入完毕后，从第一入口滴加清洗液，清洗富集区，以除去未结合的非磷酸化多肽。三次清洗后，将芯片折叠，使出口与第二入口相接，在第一入口滴加洗脱液，借由吸水区提供的驱动力，洗脱液沿着通道流动，经过富集区，将磷酸化多肽从富集区洗脱下来，并送到显色区。在显色区，磷酸化多肽与显色试剂发生相互作用，使显色区颜色改变。实验人员可以通过观察颜色的变化来判断磷酸化多肽的有无，通过与比色卡相比较，可对磷酸化多肽进行半定量分析。利用手机、相机等设备对显色区拍照，使用图像处理软件测量显色区的RGB值。根据显色区红色通道的平均值或蓝色通道的平均值，结合标准曲线，可以进行磷酸化多肽的定量检测。
其中，清洗液为乙腈和三氟乙酸的混合物或者乙腈和甲酸的混合物。其中乙腈的体积浓度为10％-60％，三氟乙酸或甲酸的体积浓度为0.1％-6％。
其中，洗脱液为含磷酸盐的溶液或碱性溶液，如10％的氨水、125mM碳酸氢铵缓冲液(含50mM磷酸铵)、0-200mM磷酸钠、0-200mM磷酸氢二钾、0-0.1M NaOH等。
其中，图像处理软件为常用的具有RGB值读取功能的软件，如Photoshop、ImageJ等。
本发明的有益效果：提供了一种新型纸基微流控芯片和一种基于该芯片的磷酸化多肽的富集检测方法。磷酸化多肽的分析对肿瘤、帕金森氏症等疾病的早期诊断、预后监测、发病机制研究、药效研究等具有重要作用。该芯片和方法可用于分析体液中磷酸化多肽的总量，或分析目标蛋白的磷酸化水平，具有简便、低成本的特点，特别适合于在医疗资源匮乏地区成为健康监测和医疗诊断的重要工具。
附图说明
图1为本发明提供的一种新型纸基微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例1提供的利用滤纸和聚丙烯膜制作纸基微流控芯片的结构示意图。
图3为本发明实施例2提供的用于磷酸化多肽检测的纸基微流控芯片的实物图。
图4为本发明实施例2提供的基于纸基微流控芯片的磷酸化多肽检测结果。左侧为阴性对照，右侧为磷酸化多肽的富集显色结果。
图5为本发明实施例3提供的利用滤纸和Parafilm(帕拉胶膜)制作的纸基微流控芯片的结构。
图6为本发明实施例3提供的滤纸-Parafilm纸基微流控芯片富集磷酸化多肽后的显色结果。
图7为本发明实施例4提供的磷酸化多肽富集检测的标准曲线。
具体实施方式
图1为本发明提供的一种新型纸基微流控芯片的结构示意图。图2为本发明实施例1提供的利用滤纸和聚丙烯膜制作纸基微流控芯片的结构示意图。图3为本发明实施例2提供的用于磷酸化多肽检测的纸基微流控芯片的实物图，其中显色区显示为黄色。图4为本发明实施例2提供的基于纸基微流控芯片的磷酸化多肽检测结果。左侧为阴性对照(黄色)，右侧为磷酸化多肽的富集显色结果(蓝色)。图5为本发明实施例3提供的利用滤纸和Parafilm(帕拉胶膜)制作的纸基微流控芯片的结构。图6为本发明实施例3提供的滤纸-Parafilm纸基微流控芯片富集磷酸化多肽后的显色结果，其中显色区显示由黄色变为蓝色。图7为本发明实施例4提供的磷酸化多肽富集检测的标准曲线。
如图1所示，其示出了本发明的一种纸基微流控芯片的通道和反应区结构，其中包括第一第一入口1，出口2，富集区3，第二第二入口4，显色区5，以及吸水区6。基于纸基微流控芯片的磷酸化多肽的富集和检测的基本步骤如下：样品溶液从第一入口1引入，并经过富集区3，出口2处与吸水纸相接以驱动液体流动。样品引入完毕后，从第一入口1滴加清洗液，清洗富集区3，以除去未结合的非磷酸化多肽。三次清洗后，将芯片折叠，使出口2与第二入口4相接，在第一入口1滴加洗脱液，借由吸水区6提供的驱动力，洗脱液沿着通道流动，经过富集区3，将磷酸化多肽从富集区洗脱下来，并送到显色区5。在显色区5，磷酸化多肽与显色试剂发生相互作用，使显色区颜色改变。实验人员可以通过观察颜色的变化来判断磷酸化多肽的有无，通过与比色卡相比较，可对磷酸化多肽进行半定量分析。利用手机、相机等设备对显色区拍照，使用图像处理软件测量显色区的RGB值。根据显色区红色通道的平均值或蓝色通道的平均值，结合标准曲线，可以进行磷酸化多肽的定量检测。在上述步骤中，清洗液为乙腈和三氟乙酸的混合物或者乙腈和甲酸的混合物。乙腈的体积浓度为10％-60％，三氟乙酸或甲酸的体积浓度为0.1％-6％。洗脱液为含磷酸盐的溶液或碱性溶液，如10％的氨水、125mM碳酸氢铵缓冲液(含50mM磷酸铵)、0-200mM磷酸钠、0-200mM磷酸氢二钾、0-0.1MNaOH等。图像处理软件为常用的具有RGB值读取功能的软件，如Photoshop、ImageJ等。
实施例1：利用whatman(沃特曼)1#滤纸和聚丙烯膜制作纸基微流控芯片。
芯片结构如图2所示。其中部件2、3、4的材质为whatman1#滤纸，部件1和5的材质为聚丙烯膜。部件1为上层盖膜，其上用打孔器打出四个直径为3mm(毫米)的孔，分别对准部件3的左右两端和部件2的上下两端。部件3为多肽富集通道，长1.5cm，其中心区域经过二氧化钛颗粒修饰，用于特异性结合磷酸化蛋白或多肽。部件2为显色通道，长0.75cm，其上端滴加有0.5微升3.3mM(毫摩尔每升)的溴酚蓝和1微升250mM的柠檬酸缓冲液，在遇到蛋白质或多肽时由黄色变为蓝色。部件4为废液收集区，长1.5cm，宽1.2cm，其下端与部件2的上端相接，不断吸收废液，同时也为液体的流动提供驱动力。部件5为下层盖膜，其上用打孔器打出两个直径为3mm的孔，分别对准部件3的左右两端。将部件1～5如图2所示的顺序放置，利用部件1和5将部件2、3、4封装固定，即可得到由whatman1#滤纸和聚丙烯膜制作的纸基微流控芯片。
实施例2：利用whatman1#滤纸和聚丙烯膜制作纸基微流控芯片
如图3所示，利用whatman1#滤纸和聚丙烯膜制作纸基微流控芯片，检测磷酸化多肽。基本步骤如下。10-6M(摩尔浓度)酪蛋白溶液与胰蛋白酶在37℃(摄氏度)孵育24小时，获得含有磷酸化多肽的肽段混合溶液。将30微升上述肽段混合溶液从通道的左侧入口引入，流经富集区。通道的右侧出口与吸水纸相接以驱动液体流动。样品引入完毕后，从通道的左侧入口滴加清洗液30微升，清洗富集区，以除去未结合的非磷酸化多肽。三次清洗后，将芯片折叠，使通道的右侧出口与显色区的下端入口相接，在通道的左侧入口滴加50mM磷酸氢二钾洗脱液10微升，借由吸水区提供的驱动力，洗脱液沿着通道流动，经过富集区，将磷酸化多肽从富集区洗脱下来，并送到显色区。在显色区，磷酸化多肽与溴酚蓝发生相互作用，使显色区由黄色变为蓝色(图4)。
实施例3：利用定性滤纸和Parafilm制作纸基微流控芯片用于磷酸化多肽的富集和检测。
如图5所示，在两层图案化的Parafilm(部件1和3)中夹上一层定性滤纸(部件2)，用玻璃板和长尾夹固定后，放入120℃烘箱，20min(分钟)后取出，Parafilm在高温和压力的作用下浸入滤纸，形成疏水封闭区；而Parafilm上预先留出的镂空图案，使该区域的滤纸暴露，形成亲水通道和反应区(图6)。
利用该纸基微流控芯片，检测磷酸化多肽。基本步骤如下。纵向折叠芯片，使通道的左侧出口与吸水区相接以驱动液体流动。30微升含有磷酸化多肽的肽段混合溶液从富集通道的右侧入口引入，流经富集区。样品引入完毕后，从富集通道的右侧入口滴加清洗液30微升，清洗富集区，以除去未结合的非磷酸化多肽。三次清洗后，将芯片横向折叠，使通道的左侧出口与显色通道的左侧入口相接，在富集通道的右侧入口滴加50mM磷酸氢二钾洗脱液15微升，洗脱液沿着通道流动，经过富集区，将磷酸化多肽从富集区洗脱下来，并送到显色区。使显色区的溴酚蓝由黄色变为蓝色(图6)，指示了磷酸化多肽的存在。
实施例4：磷酸化多肽的定量检测。
使用0、0.83、4.1、8.3、41.7、83μM的酪蛋白酶解液配制一系列不同浓度的磷酸化多肽混合溶液，利用whatman1#滤纸和聚丙烯膜制作的纸基微流控芯片检测磷酸化多肽。使用手机对显色区拍照，使用图像处理软件Image J测量显色区的RGB值。以酪蛋白酶解液的浓度为横轴，以显色区的红色通道的平均值(R)为纵轴，绘制标准曲线(图7)。
配制80μM的磷酸化多肽样品，按照上述步骤检测其蓝色通道的数值，并根据上述标准曲线计算其浓度，结果表明，计算得到的浓度为78.45μM，与已知浓度的吻合率为98.06％。

Claims (14)

1.一种纸基微流控芯片，由纸基材料、疏水封闭材料、磷酸基团亲和试剂和显色试剂组成，其特征在于，利用常用的纸基芯片制作方法，使纸基材料由疏水封闭材料阻隔形成液流通道、富集区、显色区和吸水区，亲和试剂修饰在富集区用于特异性结合磷酸化多肽，显色试剂滴加在显色区，其颜色的变化可以指示磷酸化多肽的存在。
2.根据权利要求1所述的纸基微流控芯片，其特征在于，所述纸基材料为由惰性纤维素形成的、具有毛细结构的、可以吸水的洁净纸材。
3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体，其特征在于，所述疏水封闭材料为易加工的易与所述纸基材料结合的疏水材料。
4.根据权利要求1或2所述的纸基微流控芯片，其特征在于，所述磷酸基团亲和试剂为与磷酸基团具有特异性亲和作用的金属氧化物、固定化金属离子、抗体试剂。
5.根据权利要求4所述的纸基微流控芯片，其特征在于，所述显色试剂为遇到肽段会发生颜色改变的试剂。
6.一种基于纸基微流控芯片的磷酸化多肽的富集检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一：样品溶液的引入；步骤二：富集区的清洗；步骤三：磷酸化多肽的洗脱；步骤四：显色。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤一如下：样品溶液从第一入口引入，并经过富集区，出口处与吸水纸相接以驱动液体流动。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤二如下：样品引入完毕后，从第一入口滴加清洗液，清洗富集区，以除去未结合的非磷酸化多肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤三如下：将芯片折叠，使出口与第二入口相接，在第一入口滴加洗脱液，借由吸水区提供的驱动力，洗脱液沿着通道流动，经过富集区，将磷酸化多肽从富集区洗脱下来，并送到显色区。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤四如下：在显色区，磷酸化多肽与显色试剂发生相互作用，使显色区颜色改变。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进行三次清洗。
12.根据权利要求8或11所述的方法，其特征在于，清洗液为乙腈和三氟乙酸的混合物或者乙腈和甲酸的混合物，其中乙腈的体积浓度为10％-60％，三氟乙酸或甲酸的体积浓度为0.1％-6％。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，洗脱液为含磷酸盐的溶液或碱性溶液。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，可以通过观察颜色的变化来判断磷酸化多肽的有无，通过与比色卡相比较，可对磷酸化多肽进行半定量分析，或者利用手机、相机等设备对显色区拍照，使用图像处理软件测量显色区的RGB值，根据显色区红色通道的平均值或蓝色通道的平均值，结合标准曲线，可以进行磷酸化多肽的定量检测。
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