CN114085908B - 用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的基因靶点组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的基因靶点组合，包含CCL2基因和LIF基因。本发明还提供了其应用，以及一种用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的诊断试剂。基于本发明的基因靶点组合和诊断试剂能够有效的辅助临床检测评价mGBM的预后和恶性表征。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂技术领域，特别是指一种用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的基因靶点组合以及诊断试剂。
背景技术
胶质母细胞瘤(GBM)是成人脑部最常见的原发性恶性肿瘤，10％-20％的GBM患者被诊断为一种以上的肿瘤病灶或多灶性GBM(mGBM).与只有一个GBM肿块或单病灶GBM(uGBM)的患者相比，mGBM患者的总生存期缩短，对目前的治疗措施耐药.参与mGBM肿瘤演变的基因或基因集仍有待阐明。
根据转录组学特征和基因改变可以将GBM分为4种分子亚型，即原神经亚型(Proneural)、神经亚型(Neural)、经典亚型(Classical)和间充质亚型(Mesenchymal)，分别具有明显的遗传和转录组学特征。在临床预后和治疗中，4种亚型也对应不同的生存长度和治疗反应。而报道显示Mesenchymal型GBM最为恶性同时对常规放化疗耐受性也最强，其调控机制尚不清楚。
CCL2全称是C-C motif chemokine ligand 2，中文名称为半胱氨酸-半胱氨酸基序趋化因子配体2。LIF全称是Leukemia Inhibitory Factor或者LIF Interleukin6Family Cytokine，中文名称为白血病抑制因子或者LIF白细胞介素6家族细胞因子。以往研究报道，它们在免疫调节过程中发挥作用。
鉴于mGBM的预后比uGBM更差，确定参与GBM进展的关键基因可能揭示GBM预后不佳的潜在机制，并为mGBM和uGBM提供新的治疗靶点是当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种联合CCL2和LIF表达情况对胶质母细胞瘤患者预后和耐药特征进行评估的应用，是本领域工作者亟需解决的问题，可以为临床诊疗提供更加多样化和个性化的手段。
本发明首先提供了一种用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的基因靶点组合，包含CCL2基因和LIF基因。
本发明进一步提供了上述基因靶点组合在制备用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的诊断试剂中的应用。
在根据本发明的一个实施方案中，通过检测CCL2基因和LIF基因的表达情况。
在根据本发明的一个实施方案中，通过测定对应于CCL2基因和LIF基因表达的mRNA或蛋白质确定CCL2基因和LIF基因的表达情况。
在根据本发明的一个实施方案中，判断胶质母细胞瘤临床预后或治疗耐受。
本发明的另一方面提供了一种用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的诊断试剂，包含用于测定CCL2基因和LIF基因表达情况的制剂。
在根据本发明的一个实施方案中，所述制剂选自引物、探针或抗体中的一种或多种。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种联合CCL2和LIF的表达情况对胶质母细胞瘤患者预后和耐药特征进行评估的应用，能够有效的辅助临床检测评价mGBM的预后和恶性表征。
附图说明
图1为LIF和CCL2在GBM中的表达及临床意义相关图谱；其中，
a为病人标本mGBM1_A-C三个肿瘤灶上CCL2和LIF蛋白标记物表达情况的代表性免疫组化(IHC)图像，比例尺：100微米；
b为使用TCGA_GBM数据库检测原神经亚型(Proneural)、经典亚型(Classical)和间充质亚型(Mesenchymal)三种不同分子亚型的GBM中LIF和CCL2的mRNA表达情况图谱；
c为LIFHigh/CCL2High的GBM样本和LIFLow/CCL2Low的GBM样本中，四种分子亚型所占的百分比图谱，LIFHigh/CCL2High的GBM样本中间充质亚型(Mesenchymal)占比最高，而LIFLow/CCL2Low的GBM样本中原神经亚型(Proneural)占比最高。
d为胶质瘤组织微阵列上CCL2和LIF蛋白标志物表达情况的代表性IHC图像，比例尺：100微米；
e为胶质瘤组织芯片样本和TCGA_GBM数据库中基于LIF或/和CCL2表达情况的病人生存曲线分析图谱；
f为通过ELISA测定2例mGBM患者(mGBM1和mGBM2)和另外5例uGBM患者血清中LIF和CCL2的蛋白水平图。
图2为LIF/CCL2共表达、mGBM和间充质亚型GBM，三者之间的相关性图谱；其中，
a为在TCGA_GBM数据库中对不同表型的GBM进行Verhaak_Glioblastoma_Mesenchymal基因集的GSEA富集分析图谱；
b为在TCGA_GBM数据库中对不同表型的GBM进行Hallmark_Epithelial_Mesenchymal_Transition基因集的GSEA富集分析的图谱；
c为通过GSEA分析从TCGA_GBM数据库中获得的不同GBM表型的转录组聚类热图。
d为用LIF/CCL2与vehicle处理的LN18细胞富集Verhaak_Glioblastoma_Mesenchymal基因集图谱；
e为用LIF/CCL2与vehicle处理的LN18细胞富集Hallmark_Epithelial_Mesenchymal_Transition基因集图谱；
f为LIF/CCL2处理对比vehicle处理的LN18细胞中显著上调基因，和TCGA_GBM数据库中的间充质亚型对比其他亚型中显著上调基因的维恩图，FC表示变化倍数；
g为mGBM的肿瘤起始和进展示意图。
图3为mGBM1不同分子亚型特征基因的表达和预后相关图谱；其中，
c为不同的GBM公共数据库中LIF的mRNA表达和CCL2的mRNA表达之间的Pearson相关性分析图谱；
d为利用3个GBM数据库检测不同分子亚型中LIF和CCL2的mRNA表达情况图谱；
f为三个GBM数据库中基于LIF或CCL2表达量高低的Kaplan-Meier生存曲线分析图谱；
g为TCGA_GBM数据库中LIFHigh/CCL2High与LIFLow/CCL2Low或间充质亚型与原神经亚型患者的放化结合(左)或单一方案(右)治疗的Kaplan-Meier生存分析图谱。
图4为来自TCGA_GBM数据库的不同GBM表型的GSEA分析。a)-d)在指定基因集的背景下，不同GBM表型富集基因集的维恩图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
除非特殊声明，下述实施例中涉及的仪器、材料均可通过商购途径获得。
除非特殊声明，下述实施例中涉及的试剂均采用市售的分析纯级试剂。
抗体和试剂
抗CCL2(#sc-32771)来自Santa Cruz Biotechnology。
抗LIF(#ab138002)来自abcam。
重组人LIF(#300-05)和重组人CCL2(#300-04)来自PeproTech。
细胞培养
人GBM细胞系LN18来自ATCC(www.ATCC.org)并在37℃、含有5％CO2的培养箱中培养，所使用的基础培养基为DMEM/F12并添加了10％的胎牛血清。根据生产商的说明，每半年使用AmpFLSTR Identifiler试剂盒(#4322288，ThermoFisher)通过STR DNA指纹分析对该细胞系进行表征，并验证其为支原体阴性。将STR图谱与已知ATCC指纹进行比较，且能够匹配上已知DNA指纹。LIF和CCL2重组蛋白，根据生产商的产品数据表和相关说明进行添加。
实施例1转录组测序分析LIF/CCL2与Mesenchymal分型以及mGBM的相关性
1)转录组测序的文库制备
使用TRIzol试剂(15596026ThermoFisher,USA)根据生产商说明，提取细胞总RNA。每份样品制备总量为2μg的RNA用作RNA样品输入材料。使用的/>UltraTM RNA文库制备试剂盒(NEB,USA)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样本的属性序列中。大致步骤为，使用poly-T寡聚核苷酸连接的磁珠从总RNA中纯化mRNA。在NEBNext第一链合成反应缓冲液(5X)中，通过在高温下使用二价阳离子对样品进行碎片化。使用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(RNase H-)合成cDNA的第一条链。随后使用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成。通过核酸外切酶/聚合酶活性，将剩余的单链突出端转化为平末端。DNA片段3’端腺苷酰化后，连接具有发夹环结构的NEBNext接头，准备杂交。为了筛选长度优先为150～200bp的cDNA片段，用AMPure XP系统(Beckman Coulter,Beverly,USA)纯化文库片段。然后接头连接的cDNA在37℃反应15min，然后在95℃反应5min后进行PCR。然后用Phusion高保真DNA聚合酶、通用的万能PCR引物集合和Index(X)引物进行PCR。最后，对PCR产物进行纯化(AMPure XP系统)，并在Agilent Bioanalyzer 2100系统上对文库质量进行评估。
2)聚类和测序
根据生产商的说明，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)在cBotCluster Generation System上对索引编码样本进行聚类。簇生成后，在Illumina Hiseq平台上对文库制备物进行测序，生成125bp/150bp配对末端读取数据。
3)质量控制
fastq格式的原始数据(原始读取)首先通过内部perl脚本进行处理。在该步骤中，通过从原始数据中删除包含适配器的读取、包含ploy-N的读取和低质量读取，获得纯净数据(纯净读取)。同时，计算了纯净数据的Q20、Q30和GC含量。所有下游分析均基于高质量的纯净数据。
4)读段映射到参考基因组
参考基因组和基因模型注释文件直接从基因组网站下载。使用Bowtie v2.2.3建立参考基因组的索引，并使用Hisat2 v2.0.5将配对末端纯净读取数据与参考基因组进行比对。因为Hisat2可以基于基因模型注释文件生成剪接集的数据库，比其他非剪接作图工具具有更好的作图结果，因此在此选择Hisat2作为作图工具。
5)基因表达水平的定量
HTSeq用于计数映射到每个基因的读段数。然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并读取映射到该基因的片段数。FPKM代表每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片，同时考虑测序深度和基因长度对reads计数的影响，是目前最常用的估计基因表达水平的方法。
6)差异表达分析
采用edgeR软件包进行差异表达分析。edgeR是评估RNA-seq数据中差异表达最流行的Bioconductor包之一。它基于负二项式(NB)分布，并通过NB离散参数对生物复制之间的变化进行建模。这种方法立即能够处理复杂的实验设计。通过DESeq发现的校正P值<0.05的基因被定义为差异表达。使用DEGSeq R软件包进行两种条件的差异表达分析。使用Benjamini&Hochberg方法调整P值。将校正P值0.005和log2(倍数变化)为1设定为显著差异表达的阈值。
由图2d可知，用LIF/CCL2处理LN18细胞后可以使细胞富集Verhaak_Glioblastoma_Mesenchymal基因集图谱，说明LIF/CCL2的表达促使了胶质瘤细胞产生了Mesenchymal的表型特征。而图2e则说明，用LIF/CCL2处理LN18细胞可以富集Hallmark_Epithelial_Mesenchymal_Transition基因集图谱，同样也说明了LIF/CCL2的表达促进了细胞向Mesenchymal表型的转化。同时在公共数据库中，如图2a所示LIFHigh/CCL2High和Mesenchymal表型以及mGBM也都可以富集Verhaak_Glioblastoma_Mesenchymal基因集图谱。同样的，图2b表明公共数据库中LIFHigh/CCL2High和Mesenchymal表型以及mGBM可以富集Hallmark_Epithelial_Mesenchymal_Transition基因集图谱。进一步通过基因表达聚类分析如图2c所示，我们可以发现LIFHigh/CCL2High和Mesenchymal表型以及mGBM可以聚为一类(前三列)，而LIFLow/CCL2Low和Non-Mesenchymal表型以及uGBM聚为另一类(后三列)。通过对不同的基因集进行分析结果显示，LIFH/CCL2H vs.LIFL/CCL2L的差异基因集,和Mesenchymal vs.Other的差异基因集，以及mGBM vs.uGBM的差异基因集，它们三者之间存在大量的交集，如图4a-d。
而在公共数据库中如图1b以及图3d所示，我们也发现，LIF/CCL2在Mesenchymal亚型中高表达，同时图1c也表明了，在LIFH/CCL2H即LIF和CCL2都为高表达的样本中Mesenchymal分型的占比达到了55.6％，而LIFL/CCL2L即LIF和CCL2都为低表达的样本中Mesenchymal分型的占比仅为7.2％。
图2f结果显示，LIF/CCL2处理的LN18细胞中显著上调基因，和TCGA_GBM数据库中的间充质亚型对比其他亚型中显著上调基因，有部分重叠，证明了LIF/CCL2处理诱导了部分间充质亚型特异性表达基因的表达。
以上结果和结论表明，LIFHigh/CCL2High与Mesenchymal表型和mGBM三者之间存在极大的相关性，他们的基因表达谱相似度极高，存在大量的重叠，因此我们提出肿瘤演进模型，如图2g所示，肿瘤最初形成的uGBM病灶在LIF/CCL2等肿瘤微环境因素的作用下，逐渐诱导形成了更为恶性的Mesenchymal亚型，进而促进了mGBM的起始和进展。
实施例2 TMZ IC50计算，及预后数据分析验证LIF/CCL2促进治疗耐受
将5000个细胞接种于96孔板过夜生长，然后将系列浓度的TMZ加入到含有LIF/CCL2或PBS溶剂的孔中。生长72h后，通过CCK-8试验测定细胞活力，并使用GraphPad Prism5软件计算IC50。
由图3h可知，用LIF/CCL2处理后，LN18细胞对TMZ的IC50值从308.3(uM)增加到了500.9(uM)，而LN229细胞对TMZ的IC50值从237.8(uM)增加到了322.4(uM)。IC50值的增加说明了LIF/CCL2处理促进了胶质瘤细胞对TMZ治疗的耐受能力。图3f的预后数据分析表明，LIFH/CCL2H的患者在接受放化疗治疗后的治疗效果不良，生存率更低，说明LIFH/CCL2H导致了放化疗的耐受，造成了病人生存率降低。而LIFL/CCL2L病人疗效更好生存率更高。同时LIFH/CCL2H的病人生存曲线和间充质亚型(Mesenchymal)病人的生存曲线高度重合，也与我们提出的LIF/CCL2可以诱导间充质亚型相关表型的结论相一致。
实施例3 GBM患者血清LIF和CCL2的ELISA检测，验证LIF/CCL2表达与mGBM相关。
试剂盒购自R&D systems(Human LIF Immunoassay#DLF00B和/>Human CCL2/MCP-1 Immunoassay#DCP00)，7例患者(mGBM1、mGBM2和5例uGBM患者)的血清根据生产商说明进行预处理，然后进行ELISA检测。同时用重组人LIF和重组人CCL2建立标准曲线。
由图1f可知，在2例mGBM患者的血清中LIF和CCL2的表达显著高于5例uGBM患者。说明LIF和CCL2的高表达可以作为mGBM患者的标志性特征，而mGBM患者的预后普遍较差，由此也可以通过检测LIF和CCL2的血清表达量来预测患者的预后情况。
实施例4免疫组织化学实验，验证LIF和CCL2高表达患者预后不良。以及LIF和CCL2的表达相关性。
石蜡切片：石蜡标本放入-20℃冰箱预冷后进行切片、摊片及风干等步骤。
脱蜡：将石蜡切片置于60℃烘箱内烘烤30min后进行脱蜡步骤：二甲苯I15min，二甲苯II 15min，100％酒精10min，95％酒精5min，85％酒精5min，75％酒精5min，自来水冲洗5min，PBS内5min。
抗原修复：PBS充分润洗切片15min。配置对应抗体的修复液后，高压锅加入适量水后加热至沸腾，将切片放入高压锅中高压2min 30s。然后立即用自来水冲洗降温高压锅，取出切片放入盛有修复液的修复盒中，自然冷却到室温。
内源性过氧化氢酶的灭活：取出切片，PBS润洗3次，每次5min，加入3％H2O2，37℃作用30min。
封闭：取出切片，PBS润洗3次，每次5min。轻轻甩干切片后放置于湿盒中，滴加山羊封闭血清于组织上。37℃烘箱中孵育30min。
一抗孵育：轻轻甩干切片，将稀释好的抗体滴到切片上，盖上湿盒盖，4℃冰箱内孵育过夜。
二抗孵育：取出切片，复温至室温后，将切片置于修复盒中，PBS润洗3次，每次5min。轻轻甩干PBS后置于湿盒中，将免疫组化二抗滴加到切片上，37℃烘箱中孵育30min。
显色：取出湿盒，将切片放于修复盒中，PBS浸洗3次，每次5min。取出切片置于显微镜下，滴加DAB显色液。当显色到适合的程度立刻放到水中终止反应。
复染：切片放于自来水中冲洗5min，苏木素染色液中染色20s，自来水充分冲洗后，再放入盐酸酒精中分化1s，再次用自来水冲洗至切片反蓝。
脱水、透明：将切片依次浸泡入75％酒精5min，85％酒精5min，95％酒精5min，100％酒精10min，二甲苯15min，新鲜二甲苯15min。
封片：将切片置于通风橱中自然晾干后，每片滴加50-100μL的中性树胶，用盖玻片封片。可将切片置于37℃烘箱中去除气泡。
扫描保存：切片扫描仪扫描切片后保存图像。
根据我们的免疫组织化学(IHC)评价体系.IHC染色评价进行如下。使用OlympusBX51显微镜(Olympus Tokyo Japan)手动选择每个组织切片的5个最具特征性的高倍视野(放大400倍)。计数信号阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比，阳性率分类标准为50％以上(+++)、25％～50％之间(++)、5％～25％之间(+)、5％以下(-)。然后，“+++”和“++”的病例被认为是该靶蛋白的高表达。否则，将病例定义为靶蛋白低表达。
由图1d可以看到，我们通过免疫组化染色阳性信号的强弱可以将病人区分为LIF和CCL2的高表达组和低表达组。进一步通过对高低表达两组病人的预后进行分析，如图1e显示，可以看到不管是LIF高表达的病人，CCL2高表达的病人，或者LIF和CCL2都高表达的病人，他们都比低表达的病人预后更差。因此，我们可以通过免疫组化染色来检测LIF和CCL2的表达量高低，进而判断病人的预后情况。
通过图1a，我们在一例mGBM病人的三个不同病灶中检测了LIF和CCL2的表达，可以看到，LIF和CCL2自身的表达呈现出正相关关系，即LIF表达高的灶点CCL2的表达也高。而数据库分析也显示了同样的结果，如图3c所示，LIF和CCL2的表达呈现出正相关性。
实施例5统计学分析
GBM和胶质瘤数据库下载自https://xenabrowser.net/datapages/，在线分析在gliovis.bioinfo.cnio.es/或http://gepia2.cancer-pku.cn/#index网站上完成。DAVID生物信息学资源和基因集富集分析(GSEA)(P<0.05，FDR<0.25)被用于分析我们的数据。通过Student’s t检验确定统计学显著性，P<0.05视为具有统计学显著性。采用Kaplan-Meier生存图和log-rank统计评价患者的生存情况。通过Pearson相关性数据，分析不同基因或蛋白质之间的关系。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的基因靶点组合在制备用于评估胶质母细胞瘤治疗效果的诊断试剂中的应用，所述基因靶点组合为CCL2基因和LIF基因。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过测定对应于CCL2基因和LIF基因表达的mRNA或蛋白质确定CCL2基因和LIF基因的表达情况。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，判断胶质母细胞瘤临床预后或治疗耐受。
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