CN114073778A - 基于x射线衰减的生物成像用纳米粒子和组合物 - Google Patents

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柳智然
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Abstract

本发明涉及一种基于X射线衰减的生物成像技术，其特征在于，包括：核结构体，其包括X射线衰减物质；及壳层，其形成于上述核结构体上，并由具有生物相容性、体内非反应性的物质构成，从而具有通过如非创伤性地用于胸部X射线的普通X射线成像来能够简单、迅速地诊断癌症的效果。

Description

基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子和组合物
技术领域
本发明涉及一种基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子和组合物。
背景技术
癌症的发病率和死亡率一直不断增长，并且癌症是在世界范围内延长预期寿命的主要障碍之一。癌症的早期诊断提高了治疗可能性，对于大多数癌症，尤其是对于侵袭性或无早期症状的癌症的提高了其存活率。如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)和超声成像等非创伤性成像技术对于癌症的诊断是必不可少的，但是它们却存在时间长、暴露于高辐射、分辨率低等问题。另外，当肿瘤的形态与健康组织的形态相似时，由于对比度(contrast)的问题，这样的断层成像技术的使用受到了很大限制。因此存在如下问题：不能通过上述技术检测出如胰腺癌和结肠癌等癌症中所发生的早期变化或细微的变化。
由此，与荧光分子或纳米粒子(Nano Particle；NP)一同使用非创伤性光学成像的技术一直不断地发展，其中上述荧光分子或纳米粒子被设计为与癌症特异性地结合。与可视光或紫外线(UV)相比，使用近红外线(NIR)，尤其是使用了第二近红外线(NIR-II，900-1700nm)的荧光成像中，由于减少了组织吸收、散射及自发荧光，因此，长时间穿透组织，并且提高了时间性和空间性分辨能力。但是，具有如下问题：基于荧光的接近方法的本质问题是不可避免的，例如吸收光和发射光的受限的穿透深度及深度和分辨率之间的折衷。另外，通过针对生物毒性、低量子收率和不充分的检测系统的问题而限制临床应用。
但是，基于X射线的成像速度快，易于使用，并且对穿透深度几乎没有限制。尤其，与其他X射线技术(如CT)相比，常规的X射线成像(例如用于胸部X射线的成像)具有如下进一步的优点：即，所需费用少，并且针对辐射的暴露较少以及更容易接近。
因此，现实情况中有必要研究能够进行包含非创伤性普通X射线检查对肿瘤进行早期诊断的实时体内成像的纳米粒子开发及利用其的体内成像技术。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nat.Biomed.Eng.1,697-713(2017)(2017.09.12.公开)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种通过X射线拍摄，进行非创伤性生物体内成像的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子和其的制备方法。
另外，根据本发明的其他目的在于，提供一种包括上述纳米粒子的基于X射线衰减的生物成像用组合物。
另外，根据本发明另一目的在于，提供一种包括上述纳米粒子的基于X射线衰减的生物成像方法。
用于解决问题的方案
为了达到上述目的，本发明提供一种基于X射线衰减生物成像用纳米粒子，其包括：核结构体，其包括X射线衰减物质；及壳层，其形成于上述核结构体上，并由具有生物相容性、体内非反应性的物质构成。
另外，本发明提供基于X射线衰减生物成像用组合物，其包括上述基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子作为有效成分。
另外，本发明提供基于X射线衰减生物成像方法，其包括：将基于X射线衰减生物成像用纳米粒子与生物样本进行反应的步骤；及通过X射线拍摄来观察图像的步骤。
另外，本发明提供基于X射线衰减生物成像用纳米粒子的制备方法，其包括：制备X射线衰减物质前体溶液的步骤(第一步骤)；将上述第一步骤的溶液添加至核前体溶液中，来制备核结构体的步骤(第二步骤)；对上述第二步骤的核结构体进行退火处理的步骤(第三步骤)；及通过将上述第三步骤中退火处理的核结构体添加至壳前体溶液中，来制备具有核前体-壳层的纳米粒子的步骤(第四步骤)。
发明效果
根据本发明的基于X射线衰减的实时生物成像用纳米粒子可以快速地通过共合成方式来制备，并且其生物体内安全性和稳定性非常优秀。
另外，具有通过普通的X射线拍摄(如非创伤性地用于胸部X射线)来能够简单、迅速地进行实时生物成像(如癌症早期诊断等)的效果。
附图说明
图1是通过使用溴化铯铅(CPB)量子点(QD)闪烁体(Scintillator)来示出癌症的普通X射线成像的图，A示出通过普通的X射线检查来检测癌症的示意图；B示出CPB-SiO2@SiO2-Ab纳米粒子(NP)的结构；C和D示出在不同的放大率下CPB-SiO2@SiO2 NP的透射电子显微镜(TEM)图像(SiO2 NP中含有的CPB QD在C中以绿色箭头来表示)；E示出UV照射及日光(插入图)下的CPB-SiO2@SiO2 NP粉末图。
图2是示出CPB-SiO2@SiO2 NP的光谱调查结果的图，A至C示出在150℃下进行退火2小时前、后，CPB-SiO2 NP的FT-IR光谱(A)、针对O1s电子的X射线光电子能谱(B和C)；D示出退火前、后的Si-OH有关光谱强度的比较；E和F示出了针对水性CPB-SiO2@SiO2 NP溶液(1mg/ml)，通过电感耦合等离子体(ICP)测定来分析的随时间的Pb浓度变化(E)及通过光致发光(PL)强度(F)来进行分析的随时间的Pb浓度变化。
图3是CPB-SiO2 NP的光谱调查结果，图中示出针对水溶液(1mg/ml)的、随时间的相对光致发光(PL)强度，其中，上述水溶液(1mg/ml)包含150℃下进行退火2小时或不进行退火的CPB-SiO2 NP。
图4是示出CPB-SiO2@SiO2 NP的形态和荧光特性的图，A、B示出在不同的放大率下拍摄的CPB-SiO2@SiO2 NP的扫描电子显微镜(SEM)图像；C示出CPB-SiO2 NP和CPB-SiO2@SiO2NP溶液的光致发光(PL)光谱。
图5是示出X射线光电子能谱(XPS)测定结果的图，将针对CPB-SiO2@SiO2NP蒸镀膜的O1s、Si 2p和Pb 4f核电子的原子含量变化绘制(plot)为蚀刻时间(膜深度)的函数。
图6是示出CPB-SiO2@SiO2 NP的X射线衰减特性的图，A示出在各种管电位下拍摄的CPB-SiO2@SiO2 NP的X射线图像(包含NP的圆柱的厚度从左到右分别为0.5cm、1.0cm和2.0cm。)；B示出在50kVp的管电位下拍摄的NP的X射线图像(厚度从左向右分别为0.5cm、1.0cm和2.0cm)，该NP位于肌肉和骨骼的下方；C示出设置在肌肉和骨骼的下方的少量NP的X射线图像(管电位是50kVp，并且NP的量从左向右分别为1mg、3mg、5mg、10mg和20mg),并且还提供了对比度分辨率和SNR值。
图7是示出CPB-SiO2@SiO2 NP的体外细胞吸收和体内X射线癌症成像的图，A示出用0.5mg/mL的CPB-SiO2@SiO2-Ab NP处理24小时的Panc-1细胞的激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)图像(用DAPI(蓝色)对细胞核进行染色，将NP识别为绿色)；B示出用Panc-1细胞的光致发光(PL)来分析的细胞吸收效率，上述Panc-1细胞被各种浓度的CPB-S@SiO2-Ab NP处理24小时；C示出1.0mg/ml CPB-S@SiO2-Ab NP溶液的PL光谱及用该溶液处理的Panc-1细胞；D通过WST-1分析来进行分析的细胞存活率(将细胞用各种浓度的CPB-S@SiO2-Ab NP来进行处理，误差棒表示平均值±S.D(n＝3))；E示出将CPB-S@SiO2-Ab NP(2mg/kg)注射到静脉内2小时后，具有胰腺肿瘤的小鼠的体内图像、X射线图像及X射线和荧光叠加图像(黄色圆表示为胰腺肿瘤生长的部位)；F示出注射NP(10mg/kg)后，在多个时间点的实时体内X射线图像、X射线和荧光叠加图像(白色箭头表示肿瘤部位)。
图8是示出所注入的CPB-S@SiO2-Ab NP的生物分布的图，A、C示出注入CPB-S@SiO2-Ab NP 2小时后的(A)及注入CPB-S@SiO2-Ab NP第十天后(C)，被解剖的各种脏器的体外荧光成像；B示出注射NP 2小时后，从小鼠中解剖出的脏器，和未注射NP的情况下从小鼠中解剖出的脏器的相对荧光强度(误差棒表示平均±S.D，n＝每组有3只小鼠)。
图9是示出CPB-S@SiO2-Ab NP的毒性评价的图，示出了用CPB-S@SiO2-Ab NP进行处理及未用其进行处理的小鼠的脏器(肝脏、脾脏、胃、肠、肾脏及睾丸)的苏木精染色和伊红(H&E)染色的显微镜图像(比例尺＝200um)。
图10是示出与体重变化有关的CPB-S@SiO2-Ab NP的毒性评价的图，示出了针对注射CPB-S@SiO2-Ab NP(10mg/kg)的小鼠和对照组小鼠，经14天测量体重的结果(误差棒表示平均±S.D，n＝每组有3只小鼠)。
图11是示出与卤素组成有关的各种CsPbX3-SiO2@SiO2 NP粉末合成结果的图，示出了在UV照射下的各粉末图像(A)和各粉末的光致发光测定结果(B)。
具体实施方式
以下，具体描述本发明。
本发明人制备了具有生物安全性和稳定性的纳米粒子，上述纳米粒子包含如溴化铯铅(CsPbBr3，CPB)钙钛矿量子点(QD)的X射线衰减物质，并且通过发现如下特征来完成了本发明：上述纳米粒子可以仅用普通的X射线拍摄，通过量子点的X射线衰减反应来对癌症进行成像，从而不仅可以用于癌症的早期诊断，而且还可以进行体内成像。
本发明提供一种基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子，其包括：核结构体，包含X射线衰减物质；及壳层，形成于上述核结构体上，并且由具有体内非反应性的物质构成。
此时，上述X射线衰减物质包括：作为平均直径大小为5至15nm的量子点(quantumdot)物质的ABX3钙钛矿(perovskite)结构物质，上述壳层可以包括选自由SiO2、TiO2、ZnO、ZrO2和Al2O3组成的组中一个以上。
上述A选自由Ti、Sr、Ca、Cs、Ba、Y、Gd、La、Fe及Mn组成的组，上述B选自由Pb、Sn、Cu、Ni、Bi、Co、Fe、Mn、Cr、Cd、Ge及Yb组成的组，上述X选自由IyBr(1-y)、IyCl(1-y)和BryCl(1-y)(0≤y≤1)组成的组。
根据本发明的一实施例，根据本发明的纳米粒子可以通过将X射线衰减量子点(quantum dot)物质用SiO2进行封锁的方式来防止被分解或释放。
另外，上述壳层具有如下特征：其表面上还具有选自由酶基质、配体、氨基酸、肽、蛋白质、己烷、脂质、辅助因子、碳水化合物及抗体组成的组中的一种以上的靶向制剂，但是上述壳层不限于此。上述靶向制剂可以提高纳米粒子的吸收率，并且可以通过特异性地靶向来与体内细胞或组织等生物样本进行结合。另外，可以使用任何抗体，只要上述抗体特异性地仅靶向癌细胞并与癌细胞结合即可。
另外，上述癌细胞具有如下特征：上述癌细胞选自由大肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌或宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食道癌、小肠癌、肛门周围癌、输卵管肿瘤、子宫内膜肿瘤、宫颈肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤、霍奇金病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤和脑肿瘤组成的组，但是，根据本发明，可以通过普通X射线成像带来的X射线衰减而出现的变化来诊断癌症，因此可以诊断本领域技术人员已知的所有癌细胞。
另外，本发明提供一种基于X射线衰减的生物成像方法，其包括：将上述基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子与生物样本进行反应的步骤；及通过X射线成像来观察图像的步骤。
根据本发明的一实施例，作为与上述纳米粒子结合的癌特异性靶向剂的抗体将纳米粒子附着在癌细胞，在此处照射X射线时，通过溴化铯铅量子点闪烁体来显著减少穿透癌细胞的X射线光子的量，由于X射线衰减或溴化铯铅量子点闪烁体的荧光发光特性而使肿瘤部位变亮或发出荧光，从而通过其来诊断癌症。
另外，本发明提供一种基于X射线衰减的生物成像用组合物，其包括：作为有效成分的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子。
上述组合物可以包括药学上可接受的载体。上述药学上可接受的载体可以包括：生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油和肉豆蔻酸异丙酯等，并且不限于此。
另外，本发明提供一种基于X射线生物成像用纳米粒子的制备方法，其包括：制备X射线衰减物质前体溶液的步骤(第一步骤)；将上述第一步骤的溶液添加至核前体溶液中，来制备核结构体的步骤(第二步骤)；对上述第二步骤的核结构体进行退火(annealing)处理的步骤(第三步骤)；及通过将上述第三步骤中退火处理的核结构体添加至壳前体溶液中，来制备具有核前体-壳层的纳米粒子的步骤(第四步骤)。
根据本发明一实施例，上述纳米粒子制备方法具有如下特征：CPB QD被封锁在SiO2 NP内部，即作为用于快速共合成QD和NP的一种新型有效的合成方法，这种快速共合成可能导致CPB QD在分解前被封锁在SiO2 NP内部。
此时，上述X射线衰减物质前体，其特征在于，包括：选自由溴化铅(PbBr2)、溴化铯(CsBr)、碘化铯(CsI)、氯化铯(CsCl)和氯化铅(PbCl2)组成的组。上述X射线衰减物质前体溶液可以包括碱性催化剂，具体地可以包括氨催化剂，但不限于此。
另外，上述核前体或壳前体能够选自由正硅酸四甲基酯(tetramethylorthosilicate)和正硅酸四乙基酯(tetraethyl orthosilicate)组成的组，但不限于此。
另外，上述退火，其特征在于，在100℃至200℃下进行1小时至3小时，并且通过这种退火工艺来减少纳米粒子表面的羟基，从而增强了稳定性。
另外，本发明还可以包括将靶向剂与具有上述核前体-壳层的纳米粒子的壳层进行结合的步骤，上述将靶向剂与具有核前体-壳层的纳米粒子的壳层进行结合的步骤，其特征在于，包括：通过将上述纳米粒子与3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt)进行反应来对壳层进行改性的步骤；及对上述改性的纳米粒子与靶向剂进行共轭(conjugation)的步骤。
通过将这种靶向剂与壳层进行结合的工艺，可以提高纳米粒子的吸收率，并且可以将其特异性地靶向并结合于生物体内细胞或组织等生物样本。
另外，本发明提供一种新型有效的基于X射线衰减的生物成像方法，其可以通过使用溴化铯铅(CsPbBr3，CPB)钙钛矿量子点(QD)闪烁体，在体内细胞或组织等任何部位都可以进行检测。CPB钙钛矿QD具有能够以优秀的空间分辨能力来将入射X射线光子转换为可视性发光的优异的功能。但是，由于其对水分的稳定性较差以及可能释放毒性Pb化合物，因此，其使用受到了限制。
根据本发明的一实施例，通过引入嵌有CPB QD的二氧化硅(SiO2)核/壳纳米粒子(Nano Particle；NP)来解决了稳定性问题。通过CPB QD和SiO2 NP的快速共合成来形成核部分；通过使额外的SiO2在合成的核NP外部生长来形成壳部分，以完全防止QD被排出或分解。接着，将癌细胞表面附着受体作为靶标的抗-CD44抗体(Ab)与CPB-SiO2@SiO2 NP的表面进行接合。将少量CPB-SiO2@SiO2-Ab NP(以QD为基准2.8μg)注射到具有大约5mm大小的胰腺肿瘤的小鼠静脉内；然后拍摄了普通X射线图像。在肿瘤部位，CPB QD的强烈的X射线衰减(attenuation)引起的亮白色斑点(spot)逐渐变强，并在注射后2小时达到了最高的对比度。另外，对CPB QD的稳定性、X射线衰减特性及用于临床应用的含有QD的SiO2 NP的生物分布及毒性进行了评价。
图1的A和B示出用于根据普通X射线检查的癌症在体内成像的基本策略。含有X射线闪光CPB QD的SiO2 NP通过静脉内(IV)注射来引入到异种移植小鼠中。接合于NP上的癌-特异性抗体将NP附着在癌细胞上，在其内部的X射线闪光QD在X射线照射期间显著减少了穿过癌细胞的X射线光子的量，从而使癌区域在成像期间显得明亮。由此，本发明能够通过普通X射线检查来进行生物体内成像。
以下，通过实施例来对本发明更详细地进行描述。这些实施例是仅仅用于更加具体地描述本发明，对于本领域技术人员来讲显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
<参考例>材料
将如下材料购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，直接使用所领取的原样：溴化铅(PbBr2，99.999％)、溴化铯(CsBr，99.999％)、油酸(oleic acid；OA，90％，工业级)、油胺(oleyl amine；OLA；70％，工业级)、正硅酸四甲基酯(tetramethyl orthosilicate；TMOS，98％)、正硅酸四乙基酯(tetraethyl orthosilicate；TEOS，98％，样本等级)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane；APTES，99％)、氢氧化铵(ammoniumhydroxide；NH4OH，28％)、抗-CD44(兔子中产生的抗体)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt；磺基-SMCC)及2-巯基-乙基-胺盐酸盐(2-mercapto-ethyl-amine hydrochloride；2-MEA，≥98％)。将如下材料购自DAEJUNG，不进行进一步纯化，而是直接使用：N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide；DMF，99.5％)、甲苯(toluene，99.7％)及无水乙醇(anhydrousethanol，99.8％)。
<实施例1>CsPbBr3-SiO2@SiO2 NP的合成
首先，将0.3g PbBr2、0.17g CsBr、1.2ml OLA及3.6ml OA添加到20ml DMF中，并通过在90℃下搅拌直至混合物变透明，由此制备CPB前体溶液。之后，将28％NH4OH水溶液催化剂缓慢地添加到CPB前体溶液。将包含氨的2ml CPB前体溶液快速地注入到400μl/100mlTMOS/甲苯溶液中，并在室温下搅拌2小时。通过离心分离来收集所合成的CPB-SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。在150℃下对所获得的粉末进行退火2小时来去除表面的羟基。将NP添加到1.2ml/40ml TEOS/乙醇溶液中，并在室温下搅拌1小时，然后通过注入4ml的28％NH4OH溶液，使退火的CPB-SiO2 NP上形成额外的SiO2层。在室温下搅拌20小时后，通过离心来收集所合成的CPB-SiO2@SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。
<实施例2>CsPbI2Br1-SiO2@SiO2 NP的合成
将0.2212g PbI2、0.08376g PbBr2、CsI 0.1248g、CsBr 0.068g、1.2ml OLA及3.6mlOA添加到20ml DMF中，并通过在90℃下搅拌直至混合物变透明，由此制备前体溶液。之后，将28％NH4OH水溶液催化剂缓慢地添加到CsPbI2Br1前体溶液。将包含氨的2ml CsPbI2Br1前体溶液快速地注入到1600μl/100ml TMOS/甲苯溶液中，并在室温下搅拌2小时。通过离心分离来收集所合成的CsPbI2Br1-SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。在150℃下对所获得的粉末进行退火2小时来去除表面的羟基。将NP添加到1.2ml/40ml TEOS/乙醇溶液中，并在室温下搅拌1小时，然后通过注入4ml的28％NH4OH溶液，使退火的CsPbI2Br1-SiO2NP上形成额外的SiO2层。在室温下搅拌20小时后，通过离心来收集所合成的CsPbI2Br1-SiO2@SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。
<实施例3>CsPbBr2Cl1-SiO2@SiO2 NP的合成
将0.0134g CsCl、0.2936g PbBr2、1.2ml OLA及3.6ml OA添加到20ml DMF中，并通过在90℃下搅拌直至混合物变透明，由此制备前体溶液。之后，将28％NH4OH水溶液催化剂缓慢地添加到CsPbBr2Cl1前体溶液。将包含氨的2ml CsPbBr2Cl1前体溶液快速地注入到400μl/100ml TMOS/甲苯溶液中，并在室温下搅拌2小时。通过离心分离来收集所合成的CsPbBr2Cl1-SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。在150℃下对所获得的粉末进行退火2小时来去除表面的羟基。将NP添加到1.2ml/40ml TEOS/乙醇溶液中，并在室温下搅拌1小时，然后通过注入4ml的28％NH4OH溶液，使退火的CsPbBr2Cl1-SiO2 NP上形成额外的SiO2层。在室温下搅拌20小时后，通过离心来收集所合成的CsPbBr2Cl1-SiO2@SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。
<实施例4>CsPbBr1Cl2-SiO2@SiO2 NP的合成
将0.0117g CsBr、0.2225g PbCl2、1.2ml OLA及3.6ml OA添加到20ml DMF中，并通过在90℃下搅拌直至混合物变透明，由此制备前体溶液。之后，将28％NH4OH水溶液催化剂缓慢地添加到CsPbBr1Cl2前体溶液。将包含氨的2ml CsPbBr1Cl2前体溶液快速地注入到400μl/100ml TMOS/甲苯溶液中，并在室温下进行搅拌2小时。通过离心分离来收集所合成的CsPbBr1Cl2-SiO2 NP，并用乙醇清洗三次。在150℃下对所获得的粉末进行退火2小时来去除表面的羟基。将NP添加到1.2ml/40ml TEOS/乙醇溶液中，并在室温下搅拌1小时，然后通过注入4ml的28％NH4OH溶液，使退火的CsPbBr1Cl2-SiO2 NP上形成额外的SiO2层。在室温下搅拌20小时后，通过离心来收集所合成的CsPbBr1Cl2-SiO2@SiO2NP，并用乙醇清洗三次。
<实施例5>表面变形及抗体共轭(conjugation)
将所合成的CPB-SiO2@SiO2 NP以5mg/ml的浓度溶解于无水乙醇中。将过量的APTES添加于溶液中，然后在60℃下维持过夜。通过离心分离来收集NP，并在室温下与磺基-SMCC反应2小时，上述NP为CPB-SiO2@SiO2 NP表面被氨官能化的NP。额外地，在37℃下将抗-CD44抗体与50mM 2-MEA反应1.5小时，然后使混合物通过脱盐柱，由此分离过量的2-MEA。最后，针对CPB-SiO2@SiO2 NP的抗体共轭通过如下方式进行：在4℃下将马来酰亚胺-活性化的NP和包含疏基(sulfhydryl)的抗体进行混合。
<实施例6>体外(in vitro)CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的吸收效率
在37℃以及5％CO2的条件下，将Panc-1细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(Pen-Strep)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)中培养过夜。为了测定NP的吸收效率，将细胞接种(seeding)在60mm培养皿(1×106细胞)中，并且在37℃条件下，在包含多种浓度(0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml)的CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中培养24小时。用甲醛固定细胞，并通过PL光谱法对荧光发光进行测定。
<实施例7>细胞存活率分析
为了分析细胞存活率，将Panc-1细胞接种于96孔板中，并通过多种浓度的(PBS中0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml)CPB-SiO2@SiO2-Ab NP溶液来对Panc-1细胞处理多个时间段(24小时、48小时及72小时)。根据制备商的实验方案，通过使用水溶性四唑盐(WST-1)分析(Dogen)来分析细胞存活率。将WST-1溶液添加到各个孔，使细胞在37℃下反应30分钟。之后，通过使用酶标仪(Micro plate reader，BioTek)，测定450nm下的吸光度。
<实施例8>免疫荧光分析
将Panc-1细胞接种于4孔腔室载玻片(每孔1.5×104细胞)上，并在多个时间段通过CPB-SiO2@SiO2-Ab NP溶液(0.5mg/ml)对上述Panc-1细胞进行处理。将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下，用0.1％曲拉通X-100在PBS中渗透15分钟，然后在室温下，用2％BSA封闭1小时。之后，将细胞用DAPI(Abcam)进行染色，并且通过使用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)来进行分析。
<实施例9>小鼠异种移植实验及成像
所有动物实验均按照首尔圣母医院动物管理及使用委员会的指令来进行的。将Panc-1(3×106个细胞)皮下植入BALB/c裸鼠(Orient Bio)的基底膜(Matrigel)中。监测生长直至肿瘤大小达到约150±30mm3。将200μl的CPB-SiO2@SiO2-Ab NP溶液(1mg/ml)注射到尾静脉中。在获得实时X射线图像之前，用异氟烷和医疗用氧气对所有小鼠进行麻醉。为了调查CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的生物分布，对小鼠注射NP后2小时或第十天，处死小鼠并对处死的小鼠进行了解剖。
<实施例10>特性分析
通过高分辨透射电子显微镜(HRTEM，JEM-2100F，JEOL Ltd.)和场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，JSM-7610F，JEOL Ltd.)，对所合成的CPB-SiO2及CPB-SiO2@SiO2 NP的大小及形态进行了分析。通过傅立叶变换红外(FT-IR)光谱法(NicoletTMiSTM50FTIR光谱仪，赛默飞世尔)和X射线光电子能谱(XPS，PHI 5000VersaProbe，ULVAC PHI)来对CPB-SiO2 NP表面的羟基的变化进行分析。通过使用具有450nm激发波长的荧光分光光度计(SM245，韩国光谱产品有限公司及Darsa Pro-5200，PSI有限公司)来对CPB-SiO2及CPB-SiO2@SiO2NP的PL光谱进行了分析。通过电感耦合等离子体质谱法来检测来自于CPB-SiO2@SiO2 NP的元素铅的释放。通过体内光学成像系统-小动物活体成像(IVIS Lumina XRMS，珀金埃尔默股份有限公司)来获得体内(in vivo)荧光及X射线图像。对肿瘤及主要脏器进行解剖，并立即在10％甲醛中固定24小时，然后，将这些图像用相同的小动物活体成像来进行拍摄。将组织放入石蜡中，并进行切片(厚度：5-15μm)，并且用苏木精和伊红(H&E)进行染色，以用于显微镜评价。
<实验例1>CsPbX3-SiO2@SiO2 NP的合成
CsPbX3 QD被封锁在SiO2 NP内部，即为了QD和NP的快速共合成而开发了新型有效的合成方法。将包含用于合成SiO2的碱性催化剂的QD前体溶液迅速地注入到Si前体溶液中，然后在非常短的时间内同时发生由碱性催化剂引起的SiO2 NP的合成及CsPbX3 QD的配体辅助再沉淀(ligand-assisted re-precipitation；LARP)。由于如此的快速共合成而使CsPbX3 QD在分解前被封锁在SiO2 NP内部。图11是示出根据卤素组成的各种CsPbX3-SiO2@SiO2 NP粉末合成结果的图，示出了在UV照射下的各粉末图像(A)和各粉末的光致发光测定结果(B)。根据每个CsPbX3量子点的卤素(X)组分的分子式为CsPbI2Br1(红色)、CsPbBr3(绿色)、CsPbBr2Cl1(青色)、CsPbBr1Cl2(蓝色)，并且根据X的变化示出固有的光致发光。另外，如FT-IR光谱所示，在150℃下的后退火显著降低了表面羟基，这可以通过降低950cm-1处的Si-OH拉伸(stretching)峰的减小来确认(图2的A)。另外，在O1s电子的结合能区域中的XPS测定中还示出表面羟基的减少(图2的B和图2的C)。这与FT-IR结果一致，并且退火后，Si-OH相关的O1s峰面积在533.2eV下降低到76.4％(图2的D)。如光致发光(PL)强度随时间的变化所示，由此通过退火工艺而减少的羟基数量有助于内部CPB QD的稳定性(图3)。350小时后，未退火的CPB-SiO2 NP达到初始PL强度的1/5，并快速地失去了PL特性。之后，为了阻断CPBQD的释放或分解，已退火的CPB-SiO2 NP通过附加的SiO2层的生长而再一次被封锁。TEM图像其结果清楚地示出了CPB-SiO2@SiO2核-壳结构(图1的C和图1的D)。CPB-SiO2核的平均直径为100nm且SiO2壳层的厚度约为26nm。如图1的C中的箭头所示，在放大的TEM图像中清楚地观察大小为8-11nm的CPB QD。在UV照射下观察到的所合成的NP的512nm波长的绿色发射是大小为4-15nm的CPB QD的特征，此波长的发射表明，QD在SiO2NP中也表现出良好的PL特征(图1的E和图4)。
<实验例2>CPB-SiO2@SiO2 NP的安全性和稳定性
通过对所旋转涂覆的NP薄膜的深度剖析(depth profile)XPS测定来对CPB-SiO2@SiO2 NP中包含的CPB QD的量进行测定(图5)。在刻蚀之后，Si、O及Pb原子的院子含量几乎恒定，分别为31.1％、68.8％和0.046％，其表明每1g NP中Pb原子的总量约为0.5mg。其意味着本发明中注入到IV的NP的量(200μg)中Pb的质量仅仅是1μg。而且，由于QD在NP内部非常稳定，因此由NP内的CPB QD引起的血中铅含量将远小于此。图2的E示出针对CPB-SiO2@SiO2NP水溶液(1mg/ml)，通过电感耦合等离子体(ICP)测定的随时间的Pb浓度变化。14天后从溶液中检测出的Pb浓度仅仅是0.2ppb(0.02μg/dl)，其表示在NP中仅释放极少量的Pb化合物或与Pb相关的化合物。所观察到的Pb含量明显低于世界卫生组织(WHO)和疾病控制与预防中心(CDC)推荐的最大血铅浓度，即成人为10μg/dl，儿童为5μg/dl。在NP中CPB QD的稳定性也可以通过PL测定来进行确认(图2的F)。1.0mg/ml CPB-SiO2@SiO2 NP溶液的PL强度在5天期间几乎没有变化，并且14天后的初始值略减少至92％。
<实验例3>CPB-SiO2@SiO2 NP的X射线衰减特性
通过使用临床X射线装置(EVA-HF520，COMED)来评价由CPB-SiO2@SiO2NP引起的X射线衰减。在40kVp、50kVp、60kVp(峰值kVp)的各种X射线管电位下，获得NP以0.5cm、1.0cm和2.0cm的厚度容纳于塑料容器的放射线照片(图6的A)。X射线束强度和源像距(source-image distance；SID)分别被固定为2mAs和100cm。随着样品厚度的增加，对于每个管电位，观察到显示出更高的X射线衰减的更加明亮的图像。为了验证在人体内部也能有效地观察这样的X射线衰减，使用重量为300g、厚度为1.5cm的猪排进行了替代实验。如图6的B中所示，在50kVp管电位的X射线检查过程中，可以清楚地确认位于肌肉或骨骼下方的CPB-SiO2@SiO2 NP。位于肌肉下方的NP(厚度为2.0cm)的对比度分辨率为0.34，相比骨骼的0.32略高。对比度分辨率定义为(SROI-Smuscle)/(SROI+Smuscle)，其中SROI是感兴趣区域(Region OfInterest；ROI)，Smuscle是肌肉的信号强度。肌肉下方0.5cm及1.0cm厚度的NP的对比度分辨率分别为0.08和0.18，相比厚度为2.0cm的NP的对比度分辨率小，但是由于用肉眼可检测的最小对比度约为0.005～0.05水平，因此能够容易区分。当将NP置于骨骼下方时，由于NP和骨骼增加了X射线的衰减，因此对比度分辨率(0.37、0.39和0.45)更高于仅有骨骼(0.32)时的对比度分辨率。并且还评价了定义为信号标准强度与标准偏差之比的信噪比(signal tonoise ratio；SNR)。除肌肉下方厚度为0.5cm的NP以外，所有NP样本的SNR均大于骨骼的SNR，这表明NP的发光比骨骼更均匀。所有这些结果表明，即使所合成的CPB-SiO2@SiO2NP隐藏在肌肉和骨骼等组织中，也可以通过普通X射线图像来清晰地进行识别。另外，还测试了量相当少的NP，以确定在X射线放射线成像中能够识别的最小量(图6的C)。虽然很难区分1mg NP和肌肉之间的对比度，但是3mg(这相当于10mg/kg的组织重量)以上的NP可以清楚地区分NP和肌肉之间的对比度。另外，NP的SNR显示出均大于骨骼的SNR。
<实验例4>分析体外(in vitro)CPB-SiO2@SiO2 NP吸收率和细胞存活率
为了将胰腺细胞的CD44表面附着受体作为靶标，将抗CD44抗体与所合成的CPB-SiO2@SiO2 NP的表面结合。由于CD44的表达通常与不良预后有关，因此CD44是胰腺癌重要的预后标志物和治疗靶标。通过将马来酰亚胺-活性化的NP表面与抗体上的疏基(Sulfhydryl)反应，从而使抗-CD44抗体与CPB-SiO2@SiO2 NP的表面结合。通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)对Panc-1细胞中CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的吸收进行了评价(图7的A)。用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞核在蓝色范围的最大461nm下发光。从CPB QD发出的明亮的绿色荧光主要在不存在蓝色区域的地方观察到，这表明QD在细胞中稳定并且主要位于胞质溶胶(cytosol)中。
为了检测CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的吸收效率，将Panc-1细胞以1×106的密度接种于60mm细胞培养板上，并保持24小时；接着用各种浓度的NP额外处理24小时，然后用甲醛固定细胞。表示CPB QD吸收的Panc-1细胞的PL强度稳定增加，直到NP的浓度增加到0.5mg/ml，但此后没有显示显著的增加(图7的B)。对于1mg/ml溶液的情况，最大吸收率显示为76.8％(图7的C)。针对CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的细胞毒性研究，在应用于癌症成像中非常重要。图7的D示出CPB-SiO2@SiO2-Ab NP对通过WST-1分析观察到的Panc-1细胞存活率的效果。对于NP的所有浓度，在细胞培养条件下均未观察到细胞毒性，也未观察到对细胞增殖或分化的其他影响。由于已知当Pb浓度为3μM以上时细胞死亡，因此这种非毒性可说明CPB-SiO2@SiO2-AbNP几乎不释放Pb。
<实验例5>体内(in vivo)X射线癌症成像
所移植的Panc-1细胞在异种移植小鼠中成长为充分的大小时，将200μl的1mg/mlCPB-SiO2@SiO2-Ab NP溶液注射到静脉内。图7的E明确示出在X射线照射下，异种移植小鼠肿瘤位置中的白色和绿色标记。这表明抗体接合的NP成功识别了CD44的预后标志物，更重要的是，可以通过简单的普通X射线成像来容易地检测体内癌细胞。另外，由于肿瘤培养在皮肤下，因此还观察到了CPB QD的512nm波长绿色荧光。
通过X射线和荧光成像来监测所注入的CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的实时生物分布，其结果示于图7的F。信号强度随时间逐渐增加，并在注射后2小时达到最大值，并且5天后未观察到可检测的信号。为了详细研究生物分布，拍摄了NP注射后2小时和10天后解剖的各种脏器的荧光图像(图8)。如预期的那样，在注射后2小时(图8的A和图8的B)，在直径约5mm的肿瘤中检测到强烈的绿色发光。并且荧光强度相比未处理对照组细胞高4.4倍。虽然在肝脏和肾脏中观察到了若干的荧光，但是在脾脏和肠道中未观察到。在NP注射10天后，任何脏器中未观察到荧光(图8的C)。另外，为了评价CPB-SiO2@SiO2-Ab NP的急性毒性，对经过NP处理的小鼠的各种脏器进行了苏木精和伊红(H&E)染色(图9)。与未用NP处理的对照小鼠的器官相比，在组织形态上未观察到明显的差异，这表明NP的生物相容性。另外，虽然以毒性评价的基本尺度对体重变化进行了监测，但是在处理组之间没有观察到体重的显著差异(图10)。
因此，通过利用稳定封锁在SiO2 NP内的CPB QD来确认在没有毒性的情况下，通过非创伤性普通X射线检查来对癌症有效地进行实时检测。

Claims (14)

1.一种基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子，其特征在于，包括：
核结构体，其包括X射线衰减物质；及
壳层，其形成于所述核结构体上，并由具有生物相容性、体内非反应性的物质构成。
2.根据权利要求1中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子，其特征在于，
所述X射线衰减物质是平均直径大小为5至15nm的量子点。
3.根据权利要求2中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子，其特征在于，
所述量子点是ABX3钙钛矿结构物质，
其中，所述A选自由Ti、Sr、Ca、Cs、Ba、Y、Gd、La、Fe及Mn组成的组；
所述B选自由Pb、Sn、Cu、Ni、Bi、Co、Fe、Mn、Cr、Cd、Ge及Yb组成的组；
所述X选自由IyBr(1-y)、IyCl(1-y)及BryCl(1-y)组成的组，0≤y≤1。
4.根据权利要求1中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子，其特征在于，
所述壳层选自由SiO2、TiO2、ZnO、ZrO2和Al2O3组成的组中一个以上。
5.根据权利要求1中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子，其特征在于，
所述壳层的表面上还具有选自由酶基质、配体、氨基酸、肽、蛋白质、己烷、脂质、辅助因子、碳水化合物及抗体组成的组中的一种以上的靶向制剂。
6.一种基于X射线衰减的生物成像用组合物，其特征在于，包括：作为有效成分的根据权利要求1至5中任一项所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子。
7.一种基于X射线衰减的生物成像方法，其特征在于，包括：
将根据权利要求1至5中任一项所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子与生物样本进行反应的步骤；及
通过X射线成像来观察图像的步骤。
8.一种基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，包括：
第一步骤，制备X射线衰减物质前体溶液的步骤；
第二步骤，将所述第一步骤的溶液添加至核前体溶液中，来制备核结构体的步骤；
第三步骤，对所述第二步骤的核结构体进行退火处理的步骤；及
第四步骤，通过将所述第三步骤中退火处理的核结构体添加至壳前体溶液中，来制备具有核前体-壳层的纳米粒子的步骤。
9.根据权利要求8中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述X射线衰减物质前体选自选自由溴化铅、溴化铯、碘化铯、氯化铯和氯化铅组成的组。
10.根据权利要求8中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述X射线衰减物质前体包括碱性催化剂。
11.根据权利要求8中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述核前体或所述壳前体选自由选自由正硅酸四甲基酯和正硅酸四乙基酯组成的组。
12.根据权利要求8中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述退火在100℃至200℃下进行1小时至3小时。
13.根据权利要求8中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，还包括：
将靶向剂与具有所述核前体-壳层的纳米粒子的壳层进行结合的步骤。
14.根据权利要求13中所述的基于X射线衰减的生物成像用纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述将靶向剂与具有所述核前体-壳层的纳米粒子的壳层进行结合的步骤包括：
通过将所述纳米粒子与3-氨丙基三乙氧基硅烷和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠进行反应来对壳层进行改性的步骤；及
对改性的所述纳米粒子与靶向剂进行共轭的步骤。
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