CN114062632A - 一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法及其检测装置 - Google Patents
一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法及其检测装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，包括以下步骤：将待测水样注入检测芯片中的待测水样存储腔；待测水样和螯合剂混合反应后生成螯合物，螯合物进入检测芯片的反应腔；依次将存储在检测芯片中的AChE‑AuNPs‑抗体溶液和Fe3O4‑抗原分别挤入反应腔内，与螯合物反应；静置2min，磁分离后，存储在检测芯片中的清水挤入反应腔，洗去上浮的清液，上浮的清液进入废液腔；将存储在检测芯片中的Ach溶液挤入反应腔，使Ach溶液充满反应池，大量混合液被进入废液腔；检测仪检测插入反应腔内的电极组件的电压，得到电压和ph值的关系以及ph变化和镉离子浓度的关系；使用本发明检测方便，检测效率高。
Description
技术领域
本发明涉及淡水检测技术领域，特别是一种自动检测淡水水质的装置及其检测淡水水质的方法。
背景技术
重金属污染一直是一个人们广泛关注的问题。作为一种常见的重金属，镉在镍镉电池、油漆着色和电镀等工业领域广泛应用。镉是一种会通过食物链富集和水摄入的毒素，镉在肺、肾和肝脏等人体器官中的累积会对肾脏、肝脏、心血管和神经等方面造成损害。镉污染正严重威胁着人类健康，已被列为环境与食品污染的主要公害之一。世界卫生组织规定饮用水中镉离子的限量标准为3μg/L，但迄今为止开发出的许多检测方法，存在耗时长、成本高、操作复杂等问题，因此迫切需要建立一种低成本快速检测镉离子的方法。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有的淡水水质检测中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法及其检测装置，其检测方便，检测效率高。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法及其检测装置，其包括以下步骤，
将待测水样注入检测芯片中的待测水样存储腔；
检测芯片中的螯合剂存储腔和待测水样存储腔分别同时输出螯合剂和待测水样，待测水样和螯合剂混合反应后生成螯合物，螯合物进入检测芯片的反应腔；
依次将存储在检测芯片中的AChE-AuNPs-抗体溶液和Fe3O4-抗原分别挤入反应腔内，与螯合物反应；
静置2min，磁分离后，存储在检测芯片中的清水挤入反应腔，洗去上浮的清液，上浮的清液进入废液腔；
将存储在检测芯片中的Ach溶液挤入反应腔，使Ach溶液充满反应池，大量混合液被进入废液腔；
检测仪检测插入反应腔内的电极组件的电压，得到电压和ph值的关系以及ph变化和镉离子浓度的关系，实现待测水样中镉离子浓度的检测。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：所述电极组件包括相互独立的工作电极、参比电极和对电极。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：检测前制备好螯合剂、AChE-AuNPs-抗体溶液、Fe3O4-抗原和工作电极。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：制备所述螯合剂的步骤具体为，
将10mmol/L的乙二胺四乙酸溶液以1：10的比例倒入pH为7.4的0.01mol/L HEPES缓冲溶液中，混合均匀，用作游离镉离子的螯合剂。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：制备所述AChE-AuNPs-抗体溶液的步骤具体为，
向锥形瓶中分别倒入5mL的1mol/L氯金酸溶液和195mL水。利用高速磁力搅拌加热至沸腾，在沸腾7～8min后迅速加入10g/L的柠檬酸三钠溶液4mL；
加热20min后，搅拌约10min，冷却到室温后，4℃保存备用；
取10μL的0.1mol/L碳酸钾溶液，倒入1mL上述制得的AuNPs溶液，混合均匀作为 C液备用；
向抗体中加入的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，稀释至6mg/L后取1mL作为D液备用；
将C液倒入D液，室温下摇床孵育50min；
向混合液中加入100μL的100g/L的BSA溶液，继续摇床孵育2h；
将混合物倒入离心管中以8000r/min离心25min；
沉淀物重悬于含有50g/L pH为8.0海藻糖的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液中，4℃保存备用；
取1g/L的AChE溶液20μL，倒入100μL的AuNPs-抗体溶液，混合均匀后在黑暗环境中摇床孵育2h，以7000r/min转速离心10min后弃去上清液，重复离心3次，将沉淀物重悬于100μL超纯水备用。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：制备所述Fe3O4-抗原的步骤具体为，
在烧杯中加入5mL乙二醇，称取0.4g乙酸钠加入烧杯，搅拌至溶解，称取0.17g六水和氯化铁，加入烧杯，继续搅拌至完全溶解；
向混合液中加入0.125g聚乙二醇，搅拌2h使其充分溶解；
取用聚四氟乙烯内胆容器，置于不锈钢反应釜中，将上述溶液全部倒到聚四氟乙烯内胆容器，将反应釜置于200℃油浴锅中加热10h；
等反应釜冷却后，用无水乙醇和超纯水分别洗涤3次得到的黑色产物，将洗涤后的产物移置无水乙醇中保存备用；
将800μL pH为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液倒入20μL的0.1g/L镉-抗原溶液，作为A液；
在离心管中分别加入250μL制备的Fe3O4溶液、30μL的0.6g/L1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和30μL的0.4g/L硫代羟基琥珀酰亚胺溶液，均匀混合后作为B液；
室温下摇床孵育混合均匀的A、B液1h，制得Fe3O4-抗原。倒入离心管，以6500r/min转速离心10min；
用pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤产物，将沉淀物复溶于1mL的10g/L的BSA溶液中，并放4℃保存备用。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：制备所述工作电极的步骤具体为，
用细砂纸打磨Ag丝，以除去Ag表面的氧化膜层，再用擦镜纸抛光，然后在2mol/L的NaOH溶液中用超声清洗10min，再用乙醇和蒸馏水各超声洗1遍并置于烘箱内烘干，将 Ag丝封装制备成微电极；
向水中加入25mg的IrCl4，在磁力搅拌器上搅拌15min，充分溶解后加入0.25mL的30％ H2O2溶液，继续搅拌15min，再加入二水合草酸，同样搅拌15min，最后通过加入K2CO3调节pH至10.5，将得到的黄色溶液放置于密闭容器内，室温保存；
将微电极、参比电极和对电极，在-0.40～1.0V范围内的电解液中循环扫描，直到使银丝表面镀上均匀的氧化铱膜层，室温保存。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：所述检测仪包括检测壳体，所述检测壳体上开有安装槽，所述检测壳体经安装槽可滑动地连接有检测盒，所述检测芯片连接在检测盒内，检测壳体上连接有能转动的检测板，所述检测板上连接有能贴合在电极组件外侧且分别与工作电极、参比电极和对电极一一对应的金属探头。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：所述检测芯片包括第一层芯片本体，所述第一层芯片本体下侧连接有第二层芯片本体，所述第一层芯片本体朝上的一端开有连接槽，所述第一层芯片本体的连接槽内连接有第三层芯片本体，所述第三层芯片本体朝上的一端开有进液槽，第三层芯片本体的底部开有与进液槽连通的进液孔，所述第三层芯片本体朝下的一端设有出液通道，所述出液通道的一端与进液孔连通，所述连接槽下侧的第三层芯片本体朝上的一端开有进液通道和防回流槽，所述进液通道的一端与出液通道的另一端相接，所述防回流槽的上侧与进液通道的上侧齐平，进液通道与防回流槽的一端相接，所述防回流槽远离进液通道一端的第一层芯片本体上开有出液孔，所述第一层芯片本体朝下的一端开有待测水样存储腔，待测水样存储腔的一端与出液孔连通，所述待测水样存储腔远离出液孔一端的第一层芯片本体朝下的一端设有第一通道，所述第一通道远离待测水样存储腔一端的第一层芯片本体朝下的一端开有第一单向槽，第一单向槽远离第一通道一端的第一层芯片本体朝下的一端设有第二通道，所述第二通道远离第一单向槽一端的第一层芯片本体朝下的一端开有第二单向槽，所述第二单向槽远离第二通道一端的第一层芯片本体朝下的一端设有第三通道，所述第三通道远离第二单向槽一端的第一层芯片本体朝下的一端开有螯合剂存储腔，第一层芯片本体朝下的一端还设有与第二通道相接的第四通道，所述第四通道远离第二通道一端的第一层芯片本体朝下的一端设有反应腔，第一层芯片本体朝上的一端连接有与反应腔所在位置对应的磁铁，所述反应腔外周的第一层芯片本体朝下的一端设有第五通道且排布有若干第六通道，所述第五通道远离反应腔一端的第一层芯片本体朝下的一端开有废液腔，所述第六通道远离反应腔一端的第一层芯片本体朝下的一端开有反应液存储腔。
作为本发明所述基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法的一种优选方案，其中：所述第三层芯片本体朝下的一端设有伸进防回流槽内的防回流板，初始状态下，所述防回流板和进液通道之间具有进液缝隙，向下挤压与待测水样存储腔所在位置相对应的第一层芯片本体时，所述防回流板紧密贴合在出液通道与防回流槽相接的第一层芯片本体上且覆盖出液通道，所述第二层芯片本体朝上的一端设有伸进第一单向槽内的第一单向板和伸进第二单向槽内的第二单向板，初始状态下，所述第一单向板紧密贴合在第一通道远离待测水样存储腔一端的第一层芯片本体上且覆盖第一通道，所述第二单向板紧密贴合在第三通道远离螯合剂存储腔一端的第一层芯片本体上且覆盖第三通道。
本发明的有益效果：使用本发明能实现淡水中镉离子的检测，检测溶液存储于检测芯片内的各个存储腔内，依次按照进液顺序单向进入反应腔内，检测溶液不会回流，提高检测的可靠性，同时不易受外界环境影响，通过检测芯片和检测仪的配合，实现电极组件输出电压的检测，从检测出的电压值计算出镉离子浓度，检测方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明基于纳米颗粒构建的酶联增敏检测方法的基本化学反应；图1中A 为镉-抗原功能化修饰的磁纳米颗粒与镉-抗体和乙酰胆碱酯酶功能化修饰的金纳米颗粒的识别，B为螯合物和乙酰胆碱酯酶功能化修饰的金纳米颗粒的识别，C为金纳米颗粒表面所修饰的乙酰胆碱酯酶催化乙酰水解产生乙酸。
图2为抗体和Cd螯合物的竞争机制和结果；其中A为待测水样中有镉离子或偏多的影响和结果，B为待测水样中没有镉离子或偏少的影响和结果。
图3为本发明中检测机构的主视图。
图4为图3中的A-A向视图。
图5为本发明中检测机构的立体结构图一。
图6为本发明中检测机构的立体结构图二。
图7为本发明中检测机构的立体结构图三。
图8为本发明中检测机构的的爆炸结构图一。
图9为本发明中检测机构的的爆炸结构图二。
图10为本发明中第一层芯片本体的立体结构图。
图11为由标准液测定的催化底物乙酰水解产生乙酸后pH的变化量与待测液的数据和拟合后的对应关系，拟合的关系为y＝-0.1835*x+0.47582，其中R2＝0.98945，R2为相关系数，可以在pH变化范围0.01～10内较为准确的反应pH的变化量与待测液的关系。
图12为由标准液测定的pH的数据与电极电压的数据和拟合后的对应关系。拟合的关系为y＝-69.4361*x+604.60994，其中R2＝0.98913，可以在pH范围2～8.4内较为准确的反应pH的数据与电极电压的数据的关系。
图中，100检测仪，101检测壳体，102检测板，103金属探头，200检测机构，201检测盒本体，201a安装腔，201b检测口，202第二按压柱，203第一按压柱，204进液密封盖，205盒盖，206第一层芯片本体，206a待测水样存储腔，206b螯合剂存储腔，206c第四通道， 206d第三通道，206e第二通道，206f第一通道，206g第一反应通道，206h第二反应通道， 206i第三反应通道，206j第四反应通道，206k出液孔，206l第一单向槽，206m第二单向槽， 206n废液腔，206o第二反应存储腔，206p第一反应存储腔，206q第三反应存储腔，206r第四反应存储腔，206s连接槽，206t出液通道，206u防回流槽，206v第五通道，207第三层芯片本体，207a防回流单向板，207b进液孔，207c进液通道，207d进液槽，208参比电极， 209第二层芯片本体，209a第二单向板，209b第一单向板，209c第一反应单向板，209d第二反应单向板，209e第三反应单向板，209f第四反应单向板，209g第三单向板，209h出液单向板，210对电极，211工作电极，212第二反应按压柱，213第一反应按压柱，214第三反应按压柱，215第四反应按压柱，216磁铁。
具体实施方式
在阐述本发明的具体实施方案之前，定义本文使用的术语如下：
术语“AChE”是指:乙酰胆碱酯酶；
术语“ACh”是指:乙酰胆碱；
术语“AuNPs”是指:金纳米颗粒；
术语“HEPES”是指:4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；
术语“BSA”是指:牛血清白蛋白。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
参照图3～图10，为本发明的第一个实施例，该实施例提供了一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其检测方便，能实现淡水中重金属的检测。
一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其包括以下步骤：
将待测水样注入检测芯片中的待测水样存储腔206a；
检测芯片中的螯合剂存储腔206b和待测水样存储腔206a分别同时输出螯合剂和待测水样，待测水样和螯合剂混合反应后生成螯合物，螯合物进入检测芯片的反应腔206w；
依次将存储在检测芯片中的AChE-AuNPs-抗体溶液和Fe3O4-抗原分别挤入反应腔206w 内，与螯合物反应；
静置2min，磁分离后，存储在检测芯片中的清水挤入反应腔206w，洗去上浮的清液，上浮的清液进入废液腔206n；
将存储在检测芯片中的Ach溶液挤入反应腔206w，使Ach溶液充满反应池，大量混合液被进入废液腔206n；
检测仪100检测插入反应腔206w内的电极组件的电压，得到电压和ph值的关系以及 ph变化和镉离子浓度的关系，实现待测水样中镉离子浓度的检测；
其中，电极组件包括相互独立的工作电极211、参比电极208和对电极210。
进一步的，检测仪100包括检测壳体101，检测壳体101上开有安装槽，检测壳体101经安装槽可滑动地连接有检测机构200，检测机构200包括检测盒，检测芯片连接在检测盒内，检测壳体101上连接有能转动的检测板102，检测板102上连接有能贴合在电极组件外侧且分别与工作电极211、参比电极208和对电极210一一对应的金属探头103。
进一步的，检测芯片包括第一层芯片本体206，第一层芯片本体206下侧连接有第二层芯片本体209，第一层芯片本体206朝上的一端开有连接槽206s，第一层芯片本体206的连接槽206s内连接有第三层芯片本体207，第三层芯片本体207朝上的一端开有进液槽207d，第三层芯片本体207的底部开有与进液槽207d连通的进液孔207b，第三层芯片本体207朝下的一端设有出液通道206t，出液通道206t的一端与进液孔207b连通，连接槽206s下侧的第三层芯片本体207朝上的一端开有进液通道207c和防回流槽206u，进液通道207c的一端与出液通道206t的另一端相接，防回流槽206u的上侧与进液通道207c的上侧齐平，进液通道207c与防回流槽206u的一端相接，防回流槽206u远离进液通道207c一端的第一层芯片本体206上开有出液孔206k，第一层芯片本体206朝下的一端开有待测水样存储腔206a，待测水样存储腔206a的一端与出液孔206k连通，待测水样存储腔206a远离出液孔206k一端的第一层芯片本体206朝下的一端设有第一通道206f，第一通道206f远离待测水样存储腔206a一端的第一层芯片本体206朝下的一端开有第一单向槽206l，第一单向槽206l远离第一通道206f一端的第一层芯片本体206朝下的一端设有第二通道206e，第二通道206e远离第一单向槽206l一端的第一层芯片本体206朝下的一端开有第二单向槽206m，第二单向槽206m远离第二通道206e一端的第一层芯片本体206朝下的一端设有第三通道206d，第三通道206d远离第二单向槽206m一端的第一层芯片本体206朝下的一端开有螯合剂存储腔206b，第一层芯片本体206朝下的一端还设有与第二通道206e相接的第四通道206c，第四通道206c远离第二通道206e一端的第一层芯片本体206朝下的一端设有反应腔206w，第一层芯片本体206朝上的一端连接有与反应腔206w所在位置对应的磁铁216，反应腔206w 外周的第一层芯片本体206朝下的一端设有第五通道206v且排布有若干第六通道，第五通道206v远离反应腔206w一端的第一层芯片本体206朝下的一端开有废液腔206n，第六通道远离反应腔206w一端的第一层芯片本体206朝下的一端开有反应液存储腔，本实施例中，反应液存储腔设置有四个，四个反应液存储腔分别为第一反应存储腔206p、第二反应存储腔206o、第三反应存储腔206q和第四反应存储腔206r，第一反应存储腔206p、第二反应存储腔206o、第三反应存储腔206q和第四反应存储腔206r内分别存储有AChE-AuNPs-抗体溶液、Fe3O4-抗原、清水和Ach溶液，四个第六通道分别为第一反应通道206g、第二反应通道206h、第三反应通道206i和第四反应通道206j，第一反应通道206g设置在第一反应存储腔206p和反应腔206w之间的第一层芯片本体206上，第二反应通道206h设置在第二反应存储腔206o和反应腔206w之间的第一层芯片本体206上，第三反应通道206i设置在第三反应存储腔206q和反应腔206w之间的第一层芯片本体206上，第四反应通道206j设置在第四反应存储腔206r和反应腔206w之间的第一层芯片本体206上。
进一步的，第三层芯片本体207朝下的一端设有伸进防回流槽206u内的防回流板，初始状态下，防回流板和进液通道207c之间具有进液缝隙，向下挤压与待测水样存储腔206a 所在位置相对应的第一层芯片本体206时，防回流板紧密贴合在出液通道206t与防回流槽 206u相接的第一层芯片本体206上且覆盖出液通道206t，第二层芯片本体209朝上的一端设有伸进第一单向槽206l内的第一单向板209b和伸进第二单向槽206m内的第二单向板 209a，初始状态下，第一单向板209b紧密贴合在第一通道206f远离待测水样存储腔206a一端的第一层芯片本体206上且覆盖第一通道206f，第二单向板209a紧密贴合在第三通道206d远离螯合剂存储腔206b一端的第一层芯片本体206上且覆盖第三通道206d；反应腔206w位置处的第二层芯片本体209朝上的一端设有与第四通道206c对应的第三单向板209g、与第一反应通道206g对应的第一反应单向板209c、与第二反应通道206h对应的第二反应单向板209d、与第三反应通道206i对应的第三反应单向板209e、与第四反应通道206j对应的第四反应单向板209f，废液腔206n位置处的第二层芯片本体209朝上的一端设有与第五通道206v对应的出液单向板209h，初始状态下，第三单向板209g紧密贴合在第四通道206c远离第二通道206e一端的第一层芯片本体206上且覆盖第四通道206c，第一反应单向板209c紧密贴合在第一反应通道206g远离第一反应存储腔206p的一端且覆盖第一反应通道206g，第二反应单向板209d紧密贴合在第二反应通道206h远离第二反应存储腔206o 的一端且覆盖第二反应通道206h，第三反应单向板209e贴合在第三反应通道206i远离第三反应存储腔206q的一端且覆盖第三反应通道206i，第四反应单向板209f紧密贴合在第四反应通道206j远离第四反应存储腔206r的一端且覆盖第四反应通道206j，出液单向板209h紧密贴合在第五通道206v与废液腔206n相接一端的第一芯片本体上且覆盖第五通道206v。
进一步的，检测盒包括具有安装腔201a的检测盒本体201，检测盒本体201上开有检测口201b，三个金属探头103能经检测口201b分别抵触在对应的电极外端，检测盒本体201 上侧连接有盒盖205，盒盖205上连接有能上下翻转的进液密封盖204，无外力作用下，进液密封盖204贴合在第三芯片本体上侧，待测水样存储腔206a正上方的盒盖205上连接有能在高度方向上移动的第一按压柱203，螯合剂存储腔206b正上方的盒盖205上连接有能在高度方向上移动的第二按压柱202，第一反应存储腔206p正上方的盒盖205上连接有能在高度方向上移动的第一反应按压柱213，第二反应存储腔206o正上方的盒盖205上连接有能在高度方向上移动的第二反应按压柱212，第三反应存储腔206q正上方的盒盖205上连接有能在高度方向上移动的第三反应按压柱214，第四反应存储腔206r正上方的盒盖205 上连接有能在高度方向上移动的第四反应按压柱215，各个按压柱的结构相同，按压柱的下端为球形端面，初始状态下，各个按压柱的底部与第二层芯片本体209的上侧接触。
向上翻转进液密封盖204，将待测水样滴入进液槽207d，待测水样依次经进液通道207c、防回流槽206u和出液孔206k进入待测水样存储腔206a，合上进液密封盖204后静置1min，向下按压第一按压柱203和第二按压柱202，待测水样存储腔206a通向第一通道206f的压强增大，第一单向板209b和第二单向板209a均朝着第二通道206e所在方向发生变形，同时防回流单向板207a朝着进液通道207c所在方向变形并贴紧在进液通道207c上，防止待测水样回流，待测水样从第一单向板209b和第一通道206f间的缝隙处流至第二通道206e内，螯合剂从第二单向板209a和第三通道206d间的缝隙处流至第二通道206e内，螯合剂和待测水样同时依次经第二通道206e进入第三通道206d充分混合均匀，第三通道206d上设有多个弯曲段，弯曲段对应的第三通道206d内的第一层芯片本体206下侧设有混合部，混合部的外缘和第三通道206d之间具有流通间隙，提高螯合剂和待测水样混合的均匀性和效率，第四通道206c内的压强增大，混合均匀后的螯合剂和待测水样顶开第三单向板209g 后流至反应腔206w内，按压第一反应按压柱213至底多次，AChE-AuNPs-抗体溶液通过液压顶开第一反应单向板209c，松开第一反应按压柱213时，液压变小，第一反应单向板209c 贴合在第一反应通道206g口表面不回液，按压第二反应按压柱212至底多次，Fe3O4-抗原溶液通过液压顶开第二反应单向板209d，松开第二反应按压柱212时，液压变小，第二反应单向板209d复位，第二反应单向板209d贴在第二反应通道206h口表面不能回液，静置，静置结束按压第三反应按压柱214至底多次，清水通过液压顶开第三反应单向板209e，松开第三反应按压柱214液压变小，第三反应按压柱214贴在第三反应通道206i口表面不能回液，按压使清水装满反应腔206w，混合液通过液压顶开出液单向板209h进入废液腔206n，磁珠被磁铁216吸附，不会被水流冲走，松开第三反应按压柱214，液压变小，第三反应单向板209e贴在第三反应通道206i口表面不能回液，出液单向板209h贴合在第五通道206v 口表面不能回液，按压第四反应按压柱215至底多次，Ach溶液通过液压顶开第四反应单向板209f，松开第四反应单向板209f液压变小，第四反应单向板209f贴在第四反应通道206j 口表面不能回液，按压使Ach溶液装满反应腔206w，大量混合液经液压顶开出液单向板209h 进入废液腔206n，松开第四反应按压柱215，出液单向板209h贴合在第五通道206v口表面，第四反应单向板209f复位贴合在第四反应通道206j口表面。
本实施例中，各个单向板均具有弹性；第二层芯片本体209上开有三个电极孔，工作电极211、参比电极208和对电极210的上端分别伸进经三个电极孔伸进反应腔206w内，工作电极211、参比电极208和对电极210的下端抵触在第二层芯片本体209的下侧，反应腔206w下端在各个电极的作用下封闭，检测仪100内设有与金属探头103电连接的用于检测电压大小的电压检测器(如何实现电压的检测为现有技术，在此不赘述)。
实施例2
为本发明的第二个实施例，与第一个实施例的不同之处在于，该实施例提供了一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其包括以下步骤：
打开进液密封盖204，将待测水样滴入进液槽207d，关闭进液密封盖204后静置1min；
按压第一按压柱203和第二按压柱202，将待测水样和螯合剂混合反应生成螯合物，进入反应池的待测液为17.2～18.2μL，进入反应池的螯合剂为18.1～18.5μL；
按压第一反应按压柱213至底5-6次，进入反应池的AChE-AuNPs-抗体溶液为77.1～80.2 μL，松开第一反应按压柱213；
按压第二反应按压柱212至底3-4次，进入反应池的Fe3O4-抗原溶液为22.2～22.9μL，松开第二反应按压柱212，静置5min；
按压第三反应按压柱214至底5-6次，进入反应腔206w的清水为139～142μL，松开第三反应按压柱214；
按压第四反应按压柱215至底8-10次，进入反应腔206w内的Ach溶液144～149μL，反应池混合液清液中几乎都为Ach溶液，静置10min；
将检测盒移动至检测仪100对应槽位，向上合上检测板102，使三个金属探头103与各个电极对应，检测仪100通过测得的电压和ph值之间的关系、ph变化和镉离子浓度间的关系*(如图1和图2)，得到镉离子浓度，实现待测水样中镉离子浓度的检测。
其中，螯合剂存储腔206b内存储有螯合剂19.8～20.2μL，待测水样存储腔206a内存储有待测水样19.8～20.2μL，第一反应存储腔206p内存储有AChE-AuNPs-抗体溶液79.2～82.3 μL，第三反应存储腔206q内存储有清水142～146μL，第四反应存储腔206r内存储有25 mmol/L Ach溶液157～161μL。
实施例3
为本发明的第三个实施例，与第1和第2个实施例的不同之处在于，该实施例提供了制备螯合剂的方法，其包括以下步骤：
将10mmol/L的乙二胺四乙酸溶液以1：10的比例倒入pH为7.4的0.01mol/L HEPES缓冲溶液中，混合均匀，用作游离镉离子的螯合剂。
实施例4
为本发明的第四个实施例，与第1～3任一实施例的不同之处在于，该实施例提供了制备AChE-AuNPs-抗体溶液的方法，其包括以下步骤：
向锥形瓶中分别倒入5mL的1mol/L氯金酸溶液和195mL水。利用高速磁力搅拌加热至沸腾，在沸腾7～8min后迅速加入10g/L的柠檬酸三钠溶液4mL；
加热20min后，搅拌约10min，冷却到室温后，4℃保存备用；
取10μL的0.1mol/L碳酸钾溶液，倒入1mL上述制得的AuNPs溶液，混合均匀作为 C液备用；
向抗体中加入的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，稀释至6mg/L后取1mL作为D液备用；
将C液倒入D液，室温下摇床孵育50min；
向混合液中加入100μL的100g/L的BSA溶液，继续摇床孵育2h；
将混合物倒入离心管中以8000r/min离心25min；
沉淀物重悬于含有50g/L pH为8.0海藻糖的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液中，4℃保存备用；
取1g/L的AChE溶液20μL，倒入100μL的AuNPs-抗体溶液，混合均匀后在黑暗环境中摇床孵育2h，以7000r/min转速离心10min后弃去上清液，重复离心3次，将沉淀物重悬于100μL超纯水备用。
实施例5
为本发明的第五个实施例，与第1～4任一实施例的不同之处在于，本实施例提供了制备Fe3O4-抗原的方法，其包括以下步骤：
在烧杯中加入5mL乙二醇，称取0.4g乙酸钠加入烧杯，搅拌至溶解，称取0.17g六水和氯化铁，加入烧杯，继续搅拌至完全溶解；
向混合液中加入0.125g聚乙二醇，搅拌2h使其充分溶解；
取用聚四氟乙烯内胆容器，置于不锈钢反应釜中，将上述溶液全部倒到聚四氟乙烯内胆容器，将反应釜置于200℃油浴锅中加热10h；
等反应釜冷却后，用无水乙醇和超纯水分别洗涤3次得到的黑色产物，将洗涤后的产物移置无水乙醇中保存备用；
将800μL pH为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液倒入20μL的0.1g/L镉-抗原溶液，作为A液；
在离心管中分别加入250μL制备的Fe3O4溶液、30μL的0.6g/L1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和30μL的0.4g/L硫代羟基琥珀酰亚胺溶液，均匀混合后作为B液；
室温下摇床孵育混合均匀的A、B液1h，制得Fe3O4-抗原。倒入离心管，以6500r/min转速离心10min；
用pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤产物，将沉淀物复溶于1mL的10g/L的BSA溶液中，并放4℃保存备用。
实施例6
为本发明的第六个实施例，本实施例与实施例1～实施例5的不同之处在于，本实施例提供了制备工作电极211的方法，其包括以下步骤：
用细砂纸打磨Ag丝，以除去Ag表面的氧化膜层，再用擦镜纸抛光，然后在2mol/L的NaOH溶液中用超声清洗10min，再用乙醇和蒸馏水各超声洗1遍并置于烘箱内烘干，将 Ag丝封装制备成微电极；
向水中加入25mg的IrCl4，在磁力搅拌器上搅拌15min，充分溶解后加入0.25mL的30％ H2O2溶液，继续搅拌15min，再加入二水合草酸，同样搅拌15min，最后通过加入K2CO3调节pH至10.5，将得到的黄色溶液放置于密闭容器内，室温保存；
将微电极、参比电极208和对电极210，在-0.40～1.0V范围内的电解液中循环扫描，直到使银丝表面镀上均匀的氧化铱膜层，室温保存。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：其包括以下步骤，
将待测水样注入检测芯片中的待测水样存储腔(206a)；
检测芯片中的螯合剂存储腔(206b)和待测水样存储腔(206a)分别同时输出螯合剂和待测水样，待测水样和螯合剂混合反应后生成螯合物，螯合物进入检测芯片的反应腔(206w)；
依次将存储在检测芯片中的AChE-AuNPs-抗体溶液和Fe3O4-抗原分别挤入反应腔(206w)内，与螯合物反应；
静置2min，磁分离后，存储在检测芯片中的清水挤入反应腔(206w)，洗去上浮的清液，上浮的清液进入废液腔(206n)；
将存储在检测芯片中的Ach溶液挤入反应腔(206w)，使Ach溶液充满反应池，大量混合液被进入废液腔(206n)；
检测仪(100)检测插入反应腔(206w)内的电极组件的电压，得到电压和ph值的关系以及ph变化和镉离子浓度的关系，实现待测水样中镉离子浓度的检测。
2.如权利要求1所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：所述电极组件包括相互独立的工作电极(211)、参比电极(208)和对电极(210)。
3.如权利要求2所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：检测前制备好螯合剂、AChE-AuNPs-抗体溶液、Fe3O4-抗原和工作电极(211)。
4.如权利要求3所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：制备所述螯合剂的步骤具体为，
将10mmol/L的乙二胺四乙酸溶液以1：10的比例倒入pH为7.4的0.01mol/L HEPES缓冲溶液中，混合均匀，用作游离镉离子的螯合剂。
5.如权利要求3所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：制备所述AChE-AuNPs-抗体溶液的步骤具体为，
向锥形瓶中分别倒入5mL的1mol/L氯金酸溶液和195mL水。利用高速磁力搅拌加热至沸腾，在沸腾7～8min后迅速加入10g/L的柠檬酸三钠溶液4mL；
加热20min后，搅拌约10min，冷却到室温后，4℃保存备用；
取10μL的0.1mol/L碳酸钾溶液，倒入1mL上述制得的AuNPs溶液，混合均匀作为C液备用；
向抗体中加入的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，稀释至6mg/L后取1mL作为D液备用；
将C液倒入D液，室温下摇床孵育50min；
向混合液中加入100μL的100g/L的BSA溶液，继续摇床孵育2h；
将混合物倒入离心管中以8000r/min离心25min；
沉淀物重悬于含有50g/L pH为8.0海藻糖的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液中，4℃保存备用；
取1g/L的AChE溶液20μL，倒入100μL的AuNPs-抗体溶液，混合均匀后在黑暗环境中摇床孵育2h，以7000r/min转速离心10min后弃去上清液，重复离心3次，将沉淀物重悬于100μL超纯水备用。
6.如权利要求3～5任一项所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：制备所述Fe3O4-抗原的步骤具体为，
在烧杯中加入5mL乙二醇，称取0.4g乙酸钠加入烧杯，搅拌至溶解，称取0.17g六水和氯化铁，加入烧杯，继续搅拌至完全溶解；
向混合液中加入0.125g聚乙二醇，搅拌2h使其充分溶解；
取用聚四氟乙烯内胆容器，置于不锈钢反应釜中，将上述溶液全部倒到聚四氟乙烯内胆容器，将反应釜置于200℃油浴锅中加热10h；
等反应釜冷却后，用无水乙醇和超纯水分别洗涤3次得到的黑色产物，将洗涤后的产物移置无水乙醇中保存备用；
将800μL pH为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液倒入20μL的0.1g/L镉-抗原溶液，作为A液；
在离心管中分别加入250μL制备的Fe3O4溶液、30μL的0.6g/L1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和30μL的0.4g/L硫代羟基琥珀酰亚胺溶液，均匀混合后作为B液；
室温下摇床孵育混合均匀的A、B液1h，制得Fe3O4-抗原。倒入离心管，以6500r/min转速离心10min；
用pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤产物，将沉淀物复溶于1mL的10g/L的BSA溶液中，并放4℃保存备用。
7.如权利要求3～5任一项所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：制备所述工作电极(211)的步骤具体为，
用细砂纸打磨Ag丝，以除去Ag表面的氧化膜层，再用擦镜纸抛光，然后在2mol/L的NaOH溶液中用超声清洗10min，再用乙醇和蒸馏水各超声洗1遍并置于烘箱内烘干，将Ag丝封装制备成微电极；
向水中加入25mg的IrCl4，在磁力搅拌器上搅拌15min，充分溶解后加入0.25mL的30％H2O2溶液，继续搅拌15min，再加入二水合草酸，同样搅拌15min，最后通过加入K2CO3调节pH至10.5，将得到的黄色溶液放置于密闭容器内，室温保存；
将微电极、参比电极(208)和对电极(210)，在-0.40～1.0V范围内的电解液中循环扫描，直到使银丝表面镀上均匀的氧化铱膜层，室温保存。
8.如权利要求1～5任一项所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法，其特征在于：所述检测仪(100)包括检测壳体(101)，所述检测壳体(101)上开有安装槽，所述检测壳体(101)经安装槽可滑动地连接有检测盒，所述检测芯片连接在检测盒内，检测壳体(101)上连接有能转动的检测板(102)，所述检测板(102)上连接有能贴合在电极组件外侧且分别与工作电极(211)、参比电极(208)和对电极(210)一一对应的金属探头(103)。
9.使用权利要求1～5任一项所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法进行检测淡水中重金属的方法，其特征在于：所述检测芯片包括第一层芯片本体(206)，所述第一层芯片本体(206)下侧连接有第二层芯片本体(209)，所述第一层芯片本体(206)朝上的一端开有连接槽(206s)，所述第一层芯片本体(206)的连接槽(206s)内连接有第三层芯片本体(207)，所述第三层芯片本体(207)朝上的一端开有进液槽(207d)，第三层芯片本体(207)的底部开有与进液槽(207d)连通的进液孔(207b)，所述第三层芯片本体(207)朝下的一端设有出液通道(206t)，所述出液通道(206t)的一端与进液孔(207b)连通，所述连接槽(206s)下侧的第三层芯片本体(207)朝上的一端开有进液通道(207c)和防回流槽(206u)，所述进液通道(207c)的一端与出液通道(206t)的另一端相接，所述防回流槽(206u)的上侧与进液通道(207c)的上侧齐平，进液通道(207c)与防回流槽(206u)的一端相接，所述防回流槽(206u)远离进液通道(207c)一端的第一层芯片本体(206)上开有出液孔(206k)，所述第一层芯片本体(206)朝下的一端开有待测水样存储腔(206a)，待测水样存储腔(206a)的一端与出液孔(206k)连通，所述待测水样存储腔(206a)远离出液孔(206k)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端设有第一通道(206f)，所述第一通道(206f)远离待测水样存储腔(206a)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端开有第一单向槽(206l)，第一单向槽(206l)远离第一通道(206f)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端设有第二通道(206e)，所述第二通道(206e)远离第一单向槽(206l)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端开有第二单向槽(206m)，所述第二单向槽(206m)远离第二通道(206e)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端设有第三通道(206d)，所述第三通道(206d)远离第二单向槽(206m)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端开有螯合剂存储腔(206b)，第一层芯片本体(206)朝下的一端还设有与第二通道(206e)相接的第四通道(206c)，所述第四通道(206c)远离第二通道(206e)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端设有反应腔(206w)，第一层芯片本体(206)朝上的一端连接有与反应腔(206w)所在位置对应的磁铁(216)，所述反应腔(206w)外周的第一层芯片本体(206)朝下的一端设有第五通道且排布有若干第六通道，所述第五通道远离反应腔(206w)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端开有废液腔(206n)，所述第六通道远离反应腔(206w)一端的第一层芯片本体(206)朝下的一端开有反应液存储腔。
10.使用权利要求9所述的基于纳米颗粒酶联增敏的镉离子微流控检测方法进行检测淡水水质的方法，其特征在于：所述第三层芯片本体(207)朝下的一端设有伸进防回流槽(206u)内的防回流板，初始状态下，所述防回流板和进液通道(207c)之间具有进液缝隙，向下挤压与待测水样存储腔(206a)所在位置相对应的第一层芯片本体(206)时，所述防回流板紧密贴合在出液通道(206t)与防回流槽(206u)相接的第一层芯片本体(206)上且覆盖出液通道(206t)，所述第二层芯片本体(209)朝上的一端设有伸进第一单向槽(206l)内的第一单向板(209b)和伸进第二单向槽(206m)内的第二单向板(209a)，初始状态下，所述第一单向板(209b)紧密贴合在第一通道(206f)远离待测水样存储腔(206a)一端的第一层芯片本体(206)上且覆盖第一通道(206f)，所述第二单向板(209a)紧密贴合在第三通道(206d)远离螯合剂存储腔(206b)一端的第一层芯片本体(206)上且覆盖第三通道(206d)。
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