CN114057777B - 一种β-咔啉衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种β-咔啉衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑咔啉衍生物及其制备方法与应用，上述β‑咔啉衍生物用于制备铱配合物；利用本发明的β‑咔啉衍生物制备得到一种新的铱配合物，其被细胞吸收速度快，对肿瘤细胞线粒体具有明显靶向作用，进而引起线粒体形态变化，诱导线粒体功能障碍，如影响线粒体膜电位、导致活性氧升高等。同时还对癌细胞表现出光毒性，与黑暗下相比，在光照后化合物对肿瘤细胞的毒性提高。最终通过诱导细胞发生凋亡来发挥抗肿瘤作用。

Description

一种β-咔啉衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物合成技术领域，具体涉及一种β-咔啉衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
近年来恶性肿瘤的死亡率与发病率在持续上升。在致癌因素的作用下，局部组织中细胞的原癌基因被激活，抑癌基因失活，从而在基因水平上失去了对细胞正常生长和凋亡的调控，最终形成原发性的肿瘤。目前，治疗恶性肿瘤的主要方法包括手术、化学治疗、放射治疗等。大多数患者被发现时已处于中晚期，化学疗法成为治疗最主要的治疗方法。基于以上现状，化疗药物的研发也受到越来越多的关注。金属配合物有着结构上的多样性、配体交换的可能性以及与生物分子靶点共价相互作用等特点，因此得到了广泛的研究。
第一代铂类抗癌试剂为顺铂。顺铂通过被动扩散进入人体细胞后，与癌细胞内的DNA结合，从而使DNA螺旋结构严重变形，最终导致DNA复制和转录过程受到抑制并促使癌细胞凋亡。铂类的抗癌药物已经在各类化学药物对各种癌症的治疗过程中占有主导地位。但是，由于肿瘤对铂类药物的抗药性降低了其疗效，从而导致治疗效果下降，且其毒副性强制约了其临床上的长期使用，因此相关技术中正在寻找其他过渡金属配合物作为潜在的抗癌试剂。近年来，相关技术中开发不同的金属抗癌药物来克服铂类化疗药物的局限性，其中过渡金属抗癌配合物金，银，钯，铜，铑，钌和铱已经涌现。
因此，需要开发一种β-咔啉衍生物，利用该β-咔啉衍生物制得的铱配合物具有优异的抗癌活性。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种β-咔啉衍生物，利用该β-咔啉衍生物制得的铱配合物具有优异的抗癌活性。
本发明还提供了上述β-咔啉衍生物的制备方法。
本发明该提供了上述β-咔啉衍生物的应用。
本发明还提供了一种铱配合物，该铱配合物具有优异的抗癌活性。
本发明还提供了上述铱配合物的制备方法。
本发明还提供了上述铱配合物的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物。
本发明第一方面提供了一种β-咔啉衍生物，其结构式如下式(Ⅶ)所示：
Figure GDA0003889943670000021
其中，X选自取代芳基或取代杂芳基；
Y选自氢或烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括C20以下的取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括苯基、萘基和蒽基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括C10以下的取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基还包括烷基苯基、烷氧基苯基、甲酰苯基、烷基酰氧基苯基和卤代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括苯氧基苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基为一取代芳基、二取代芳基或三取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中烷基为C20以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中烷基为C1～8烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中C1～8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基为一取代烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基为对甲基苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为C1～10烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为甲氧基、乙氧基和丙氧基中的一种。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为一取代烷氧基或三取代烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基包括二甲氧基苯基和三甲氧基苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述酰氧基苯基中酰氧基为C1～10酰氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述酰氧基苯基中酰氧基包括甲酰氧基、乙酰氧基和丙酰氧基中一种。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代苯基为一取代卤代苯基、二取代卤代苯基或三取代卤代苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代苯基为F代苯基、Cl代苯基或Br代苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述二取代芳基中取代基相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述三取代芳基中取代基相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述一取代卤代苯基包括氟代苯基、氯代苯基和溴代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述二取代卤代苯基包括二氟代苯基、二氯代苯基和二溴代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代苯基包括三氟甲苯基和三氟甲基氯苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括C20以下的取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括C10以下的取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳杂基中杂原子为N、S和O中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基为C5以下的含硫杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基为C5以下的含氧杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括噻吩基、联二噻吩基、三联噻吩基、吡咯基、呋喃基、吡啶基和喹啉基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述X选自如下结构中的至少一种：
Figure GDA0003889943670000031
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C20以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C10以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C1～8烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述C1～8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基中的至少一种。
本发明第二方面提供了上述β-咔啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备如式(Ⅱ)所示的化合物：
将式(Ⅰ)所示的化合物和卤代试剂添加至甲醇中反应，即得式(Ⅱ)所示的化合物；
S2、制备如式(Ⅲ)所示的化合物：
将式(Ⅱ)所示的化合物与醛类化合物在异丙醇中反应，即得式(Ⅲ)所示的化合物；
S3、制备如式(Ⅳ)所示的化合物：
将式(Ⅲ)所示的化合物和碱性催化剂混合后，得混合物；
对甲基苯磺酰氯添加至所述混合物中反应，即得式(Ⅳ)所示的化合物；
S4、制备如式(Ⅴ)所示的化合物：
将式(Ⅳ)所示的化合物和无机碱添加至二甲基亚砜中反应，即得式(Ⅴ)所示的化合物；
S5、制备如式(Ⅵ)所示的化合物：
将式(Ⅴ)所示的化合物和氢氧化物添加至乙醇水溶液中反应，即得式(Ⅵ)所示的化合物；
S6、制备如式(Ⅶ)所示的化合物：
将式(Ⅵ)所示的化合物、活化剂和1,10-菲罗啉-5-氨基(Phen-NH2)添加至二氯甲烷中反应，即得式(Ⅶ)所示的化合物；
Figure GDA0003889943670000041
其中，式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)和式(Ⅶ)中的X均独立选自取代芳基或取代杂芳基；
式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)和式(Ⅶ)中的Y均独立选自氢或烷基。
本发明的实验方法优点是步骤S1～步骤S4均不需要纯化，未反应的反应物，一些杂质在后续步骤中可以直接除去。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括C20以下的取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括苯基、萘基和蒽基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括C10以下的取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基还包括烷基苯基、烷氧基苯基、甲酰苯基、烷基酰氧基苯基和卤代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括苯氧基苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基为一取代芳基、二取代芳基或三取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中烷基为C20以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中烷基为C1～8烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中C1～8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基为一取代烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基为对甲基苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为C1～10烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为甲氧基、乙氧基和丙氧基中的一种。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为一取代烷氧基或三取代烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基包括二甲氧基苯基和三甲氧基苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述酰氧基苯基中酰氧基为C1～10酰氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述酰氧基苯基中酰氧基包括甲酰氧基、乙酰氧基和丙酰氧基中一种。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代苯基为一取代卤代苯基、二取代卤代苯基或三取代卤代苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代苯基为F代苯基、Cl代苯基或Br代苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述二取代芳基中取代基相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述三取代芳基中取代基相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述一取代卤代苯基包括氟代苯基、氯代苯基和溴代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述二取代卤代苯基包括二氟代苯基、二氯代苯基和二溴代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代苯基包括三氟甲苯基和三氟甲基氯苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括C20以下的取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括C10以下的取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳杂基中杂原子为N、S和O中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基为C5以下的含硫杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基为C5以下的含氧杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括噻吩基、联二噻吩基、三联噻吩基、吡咯基、呋喃基、吡啶基和喹啉基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述X选自如下结构中的至少一种：
Figure GDA0003889943670000061
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C20以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C10以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C1～8烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述C1～8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述式(Ⅰ)所示的化合物和卤代试剂的摩尔比不小于1:1。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代试剂包括氯代试剂。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代试剂包括氯化亚砜和氯化氢中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述式(Ⅰ)所示的化合物和氯化亚砜的摩尔比不小于1:1。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述反应的温度为60℃～110℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述反应的溶剂包括苯、氯仿、四氯化碳和二氯甲烷中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述式(Ⅱ)所示的化合物与所述醛类化合物的摩尔比为1:1～1.5。
根据本发明的一些实施方式，所述醛类化合物的结构式如下式所示：
Figure GDA0003889943670000062
根据本发明的一些实施方式，所述X选自取代芳基或取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述醛类化合物包括苯甲醛。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述反应的温度为80℃～120℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述式(Ⅱ)所示的化合物与所述醛类化合物的摩尔比为1:1～1.5。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述溶剂包括异丙醇、甲醇和乙腈中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述碱性催化剂包括吡啶、三乙胺、碳酸钾和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(CAS号：6674-22-2)中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述式(Ⅲ)所示的化合物与所述碱性催化剂的摩尔比为1:4～10。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述式(Ⅲ)所示的化合物与所述碳酸钾的摩尔比为1:4～8。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述式(Ⅲ)所示的化合物与所述吡啶的摩尔比为1:0.4～1。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述式(Ⅲ)所示的化合物与所述对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:0.8～1.5。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述对甲基苯磺酰氯的添加温度为0℃以下。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述对甲基苯磺酰氯的添加温度为-10℃～0℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述反应的温度为20℃～30℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述式(Ⅳ)所示的化合物与所述无机碱的摩尔比为1:4～8。
根据本发明的一些实施方式，所述无机碱包括碳酸盐和碱金属氢氧化物。
根据本发明的一些实施方式，所述碳酸盐包括碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱金属氢氧化物包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述反应的温度为85℃～125℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述反应的pH为8～12。
根据本发明的一些实施方式，步骤S5所述氢氧化物包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S5中所述乙醇水溶液的体积分数为30％～40％。
根据本发明的一些实施方式，步骤S5中所述乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为1:2。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述反应的温度为85℃～125℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述反应的pH为10～14。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述反应后需调节pH为3～6。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述式(Ⅴ)所示的化合物与所述活化剂的摩尔比为1:2～18。
根据本发明的一些实施方式，所述活化剂包括1-羟基苯并三唑(CAS号：2592-95-2，HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(CAS号：94790-37-1，HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(CAS号：125700-67-6，TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(CAS号：7087-68-5，DIEA)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(CAS号：7084-11-9，EDCI)中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述式(Ⅴ)所示的化合物与所述1-羟基苯并三唑的摩尔比为1:2～6。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述式(Ⅴ)所示的化合物与所述N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:3～8。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述式(Ⅴ)所示的化合物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:2～3。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述式(Ⅴ)所示的化合物与1,10-菲罗啉-5-氨基的摩尔比为1:1～2。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述反应的温度为20℃～30℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S6中所述反应的时间为20h～28h。
本发明第三方面提供了上述β-咔啉衍生物在制备铱配合物中的应用。
本发明第四方面提供了一种铱配合物，结构式如下式(Ⅸ)所示：
Figure GDA0003889943670000081
其中，式(Ⅸ)中的X均独立选自取代芳基或取代杂芳基；
式(Ⅸ)中的Y均独立选自氢或烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括C20以下的取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括苯基、萘基和蒽基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括C10以下的取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基还包括烷基苯基、烷氧基苯基、甲酰苯基、烷基酰氧基苯基和卤代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基包括苯氧基苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳基为一取代芳基、二取代芳基或三取代芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中烷基为C20以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中烷基为C1～8烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基中C1～8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基为一取代烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基苯基为对甲基苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为C1～10烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为甲氧基、乙氧基和丙氧基中的一种。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基中烷氧基为一取代烷氧基或三取代烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基苯基包括二甲氧基苯基和三甲氧基苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述酰氧基苯基中酰氧基为C1～10酰氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述酰氧基苯基中酰氧基包括甲酰氧基、乙酰氧基和丙酰氧基中一种。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代苯基为一取代卤代苯基、二取代卤代苯基或三取代卤代苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述卤代苯基为F代苯基、Cl代苯基或Br代苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述二取代芳基中取代基相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述三取代芳基中取代基相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述一取代卤代苯基包括氟代苯基、氯代苯基和溴代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述二取代卤代苯基包括二氟代苯基、二氯代苯基和二溴代苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代苯基包括三氟甲苯基和三氟甲基氯苯基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括C20以下的取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括C10以下的取代杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代芳杂基中杂原子为N、S和O中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基为C5以下的含硫杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基为C5以下的含氧杂芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述取代杂芳基包括噻吩基、联二噻吩基、三联噻吩基、吡咯基、呋喃基、吡啶基和喹啉基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述X选自如下结构中的至少一种：
Figure GDA0003889943670000091
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C20以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C10以下的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基包括C1～8烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述C1～8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基中的至少一种。
铱元素，原子序数为77，原子量为192.22，属于元素周期表VIII族过渡元素。铱的合金具有极高的熔点和抗腐蚀性等特点，常应用于航天、生物和医药行业。金属铱(III)离子可以与O^O，C^N和N^N的双齿配体形成稳定配合物。相比于经典金属配合物类的抗肿瘤药顺铂，铱(Ⅲ)配合物具有稳定性高和水溶性好，优异的磷光性能、配位点多等特点、这些优点为配合物的结构设计提供了多种选择，其中通过本发明的β-咔啉衍生物配体改造合成例具有较好抗肿瘤活性铱(Ⅲ)配合物。此外，根据其磷光寿命长、对氧气敏感的特点，该配合物作为光敏剂用于光动力治疗中。
本发明的铱配合物(Ⅲ)为八面体结构。
根据本发明的一些实施方式，所述铱配合物为环金属化β-咔啉类铱配合物。
根据本发明的一些实施方式，所述铱配合物的主配体为所述β-咔啉衍生物。
根据本发明的一些实施方式，所述铱配合物的辅助配体为2-苯基吡啶(ppy)、2-(2,4-二氟苯基)吡啶(dfppy)、7,8-苯并喹啉(bzq)、2-苯基喹啉(2pq)、2-苯基苯并噻唑(pbt)和2-(2-噻吩基)吡啶(thpy)中的至少一种。
本发明第五方面提供了上述铱配合物的制备方法，包括以下步骤：
S01、制备如式(Ⅷ)所示的化合物：
将铱盐和辅助配体反应，制得如式(Ⅷ)所示的化合物；
S02、制备如式(Ⅸ)所示的化合物：
将如式(Ⅷ)所示的化合物和如式(Ⅶ)所示的化合物反应后，再加入六氟磷酸盐，即得式(Ⅸ)所示的化合物；
Figure GDA0003889943670000101
其中，式(Ⅸ)中的X均独立选自取代芳基或取代杂芳基；
式(Ⅸ)中的Y均独立选自氢或烷基。
根据本发明的一些实施方式，步骤S01中所述铱盐与所述辅助配体的摩尔比为1:2～5。
根据本发明的一些实施方式，步骤S01中所述铱盐包括氯化铱。
根据本发明的一些实施方式，步骤S01中所述反应的温度为100℃～150℃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S01中所述反应的溶剂为乙二醇-乙醚(CAS号：110-80-5)水溶液。
根据发明的一些实施方式，所述乙二醇-乙醚水溶液中乙二醇-乙醚和水的体积比为2～3:1。
根据本发明的一些实施方式，步骤S01中所述反应的时间为10h～24h。
根据本发明的一些实施方式，步骤S02中所述反应的溶剂为二氯甲烷甲醇溶液。
根据本发明的一些实施方式，步骤S02中所述反应的溶剂为二氯甲烷甲醇溶液中二氯甲烷的体积分数为30％～40％。
根据发明的一些实施方式，所述二氯甲烷甲醇溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为2:1。
根据本发明的一些实施方式，步骤S02中所述反应的气氛包括氦气、氖气、氩气和氪气中的一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S02中所述六氟磷酸盐包括六氟磷酸钠和六氟磷酸钾中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S02中所述六氟磷酸盐需配制为饱和溶液。
根据本发明的一些实施方式，所述药学上可接受的辅料包括药用载体。
根据本发明的一些实施方式，所述药用载体为药学领域常规的药物载体。
根据本发明的一些实施方式，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述赋形剂包括水。
根据本发明的一些实施方式，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述黏合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述湿润剂包括甘油。
根据本发明的一些实施方式，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述吸收促进剂包括季铵化合物。
根据本发明的一些实施方式，所述表面活性剂包括十六烷醇。
根据本发明的一些实施方式，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，本发明所述药理学上容许的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐。
根据本发明的一些实施方式，所述无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱土金属包括钙和镁中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为本领域常规的各种剂型。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为固体、半固体或液体的形式。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为水溶液、非水溶液或混悬液。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、干浸膏剂、注射剂或输注剂。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的给药方式可以为本领域常规的给药方式，包括但不限于注射给药或口服给药。
根据本发明的一些实施方式，所述注射给药可以为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
根据本发明至少一种实施方式，具备如下有益效果：
利用本发明的β-咔啉衍生物制备得到的铱配合物，对线粒体具有靶向作用，同时还对癌细胞表现出显著的光毒性，光照下毒性较强，抗肿瘤效果更加明显。
本发明的铱配合物还对肿瘤细胞具有诱导其凋亡的功能。
本发明的铱配合物合成条件温和，抗肿瘤效果显著，作用机理新颖，故其可成为抗肿瘤的潜在药物。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的化合物7(PPβC)的核磁图谱。
图2为本发明实施例2中制得的化合物9([Ir(ppy)2PPβC](PF6))的紫外吸收光谱。
图3为本发明实施例2中制得的化合物9([Ir(ppy)2PPβC](PF6))的荧光光谱。
图4为本发明实施例2中制得的化合物9([Ir(ppy)2PPβC](PF6))的核磁谱图。
图5为本发明实施例3中制得的化合物11([Ir(dfppy)2PPβC](PF6))的紫外吸收光谱。
图6为本发明实施例3中制得的化合物11([Ir(dfppy)2PPβC](PF6))的荧光光谱。
图7为本发明实施例3中制得的化合物11([Ir(dfppy)2PPβC](PF6))的核磁谱图。
图8为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的紫外吸收光谱。
图9为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的荧光光谱。
图10为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的核磁谱图。
图11为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的细胞吸收图。
图12为本发明实施例4的[Ir(bzq)2PPβC](PF6)的EdU染色检测细胞增殖结果(放大倍数为20倍)。
图13为本发明实施方式中制得的[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)的溶酶体共定位实验结果(放大倍数为60倍)。
图14为本发明实施方式中制得的[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)的线粒体共定位实验结果(放大倍数为100倍)。
图15为本发明实施方式中制得的[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)的DCF与线粒体的共定位测试结果(放大倍数为100倍)。
图16为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的JC-1染色实验结果(放大倍数为20倍)。
图17为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))处理后细胞的透射电镜图。
图18为抑制剂和本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))对细胞活力的影响。
图19为本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的Annexin V染色结果(放大倍数为100倍)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下面详细描述本发明的具体实施例。
本发明实施例中室温(Room Temperature，rt)若无特别说明，则均为25℃±2℃。
实施例1
本实施例为一种β-咔啉衍生物的制备方法，包括以下步骤:
S1、制备化合物2：
Figure GDA0003889943670000131
将色氨酸(化合物1，0.82g，4mmol)溶于20mL甲醇，冰浴下滴加氯化亚砜(0.29mL，4mmol)，在100℃下冷凝回流7h，所得溶液减压蒸馏除去溶剂，乙酸乙酯漂洗，抽滤，烘干后得到0.98g白色粉末(化合物2)，产率96.4％。
S2、制备化合物3：
Figure GDA0003889943670000132
在反应管中加入化合物2(1.019g，4mmol)，再加入苯甲醛(408μL，4mmol)，溶于15mL异丙醇中，在氩气保护下90℃加热回流10h，所得液体减压蒸馏除去溶剂，加苯搅拌，抽滤，烘干得到1.12g淡黄色固体(化合物3)，产率91.8％。
S3、制备化合物4(P-N-Ts-4H-βC)：
Figure GDA0003889943670000141
将化合物3(1.23g，4mmol)溶于二氯甲烷中，-8℃下加入350μL吡啶和对甲基苯磺酰氯(CAS号：98-59-9，TsCl，0.76g，4mmol)，撤去冷冻后室温搅拌4h，减压蒸馏除去溶剂，减压蒸馏除去溶剂，用10mL质量分数为10％碳酸钾溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，石油醚淋洗，抽滤，得到1.67g黄色固体(化合物4(P-N-Ts-4H-βC))，产率90.8％。
S4、制备化合物5：
Figure GDA0003889943670000142
将P-N-Ts-4H-βC(1.84g，4mmol)溶于二甲基亚砜中，加入碳酸钾(0.69g，5mmol)，100℃加热回流5h，反应结束后降至室温，加入水100mL，放置过夜，搅拌抽滤，水漂洗，干燥得到1.00g产物(化合物5)，产率83.3％。
S5、制备化合物6：
Figure GDA0003889943670000143
将化合物5(1.21g，4mmol)溶于甲醇：水(V/V＝1：2)(乙醇10mL，水20mL)，加入氢氧化钠(0.40g，12mmol)，100℃冷凝回流，反应后的溶液用5M HCl调节pH为5，抽滤，干燥得到0.96g黄色固体(化合物6(PβCA))，产率83.5％。
S6、制备化合物7(PPβC)：
Figure GDA0003889943670000144
将化合物6(1.15g，4mmol)加入HOBT(1-羟基苯并三唑，CAS号：2592-95-2，0.81g，6mmol)、DIEA(N,N-二异丙基乙胺，CAS号：7087-68-5，400μL)，1,10-菲罗啉-5-氨基(CAS号：54258-41-2，phen-NH2，0.78g，4mmol)，室温反应2h后加入EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，CAS号：25952-53-8，1.15g，6mmol)，继续室温下反应21h，减压旋蒸，用水漂洗后抽滤，干燥后粗产物过硅胶柱纯化，即得1.53g化合物7(PPβC，N-5-(1,10-邻菲罗啉)-1-苯基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺)，产率82.3％。
化合物7(PPβC)的核磁共振氢谱见图1，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.04(s,1H),11.16(s,1H),9.17(dd,J＝4.3,1.6Hz,1H),9.08(dd,J＝4.3,1.7Hz,1H),9.04(s,1H),8.61–8.48(m,3H),8.46(s,1H),8.40–8.29(m,2H),7.87(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),7.79(dd,J＝8.1,4.3Hz,1H),7.73(q,J＝8.1,7.6Hz,3H),7.64(q,J＝7.5Hz,2H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H).
实施例2
本实施例为一种铱配合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备化合物8：
Figure GDA0003889943670000151
将IrCl3·nH2O(1.192g，2mmol)和ppy(0.62g，4mmol)以摩尔比1:2加入到乙二醇-乙醚和水的混合溶液(3：1，v/v)中，加热回流24h，过滤，粗产物过硅胶柱即得0.90g Ir2(ppy)4Cl2(化合物8)，产率84.0％。
S2、制备化合物9：
Figure GDA0003889943670000152
将Ir2(ppy)4Cl2(化合物8，2.054g，2mmol)和PPβC(化合物7，1.86g，4mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2：1，v/v)的混合溶液中，在氩气保护下回流4h，反应结束后待溶液冷却至室温，旋蒸除去CH2Cl2后转移至烧杯，向该溶液中加入20mL KPF6饱和水溶液。冰箱4℃冷却过夜后过滤收集，并真空干燥，纯化得到3.60g[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(化合物9)，产率81.1％。
本实施例中制得的化合物9([Ir(ppy)2PPβC](PF6))的紫外吸收光谱见图2，在275nm处强度比较大的高峰为配体之间的电荷跃迁引起，353nm左右的吸收带通常被认定为配体内的π—π*的跃迁。
本实施例中制得的化合物9([Ir(ppy)2PPβC](PF6))的荧光光谱见图3，在405nm激发下最大发射波长为586nm。
本实施例中制得的化合物9([Ir(ppy)2PPβC](PF6))的核磁谱图见图4，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.11(s,1H),11.36(s,1H),9.08(s,1H),8.94(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),8.92–8.88(m,1H),8.87(s,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.34–8.25(m,5H),8.17–8.15(m,1H),8.15–8.11(m,1H),8.04(dd,J＝8.3,5.0Hz,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,2H),7.93–7.85(m,4H),7.75(d,J＝8.2Hz,1H),7.67(d,J＝7.3Hz,1H),7.52(t,J＝4.6Hz,2H),7.37(s,2H),7.11–7.06(m,2H),7.03(t,J＝6.7Hz,2H),7.00–6.94(m,2H),6.33(d,J＝7.4Hz,2H).
实施例3
本实施例为一种铱配合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备化合物10：
Figure GDA0003889943670000161
将IrCl3·nH2O(1.192g，2mmol)和dfppy(0.76g，4mmol)以摩尔比1：2加入到乙二醇-乙醚和水的混合溶液(3：1，v/v)中，加热回流24h，过滤即得0.91gIr2(dfppy)4Cl2(化合物10)，产率75.0％。
S2、制备化合物11：
Figure GDA0003889943670000162
将Ir2(dfppy)4Cl2(2.432g，2mmol)和化合物7(1.86g，4mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2：1，v/v)的混合溶液中，在氩气保护下回流4h，反应结束后待溶液冷却至室温，旋蒸除去CH2Cl2后转移至烧杯，向该溶液中加入20mL KPF6饱和水溶液。冰箱4℃冷却过夜后过滤收集，并真空干燥，纯化得到4.1g[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(化合物11)，产率86.6％。
本实施例中制得的化合物11([Ir(dfppy)2PPβC](PF6))的紫外吸收光谱见图5，在250～500nm范围内有两个吸收带，第一个吸收带在281nm附近，第二个吸收带在325～375nm之间，这两个吸收带都是配体内(intraligand(IL))的π-π*的跃迁。
本实施例中制得的化合物11([Ir(dfppy)2PPβC](PF6))的荧光光谱见图6，在405nm激发下最大发射波长为525nm。
本实施例中制得的化合物11([Ir(dfppy)2PPβC](PF6))的核磁谱图见图7，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.09(s,1H),11.40(s,1H),9.08(s,1H),8.97(dd,J＝13.1,8.3Hz,2H),8.90(s,1H),8.51(s,1H),8.38(s,1H),8.34(d,J＝7.4Hz,4H),8.29–8.24(m,1H),8.14(dd,J＝8.5,5.1Hz,1H),8.00(d,J＝7.1Hz,3H),7.75(s,1H),7.73–7.62(m,4H),7.59(d,J＝6.1Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,1H),7.16–7.08(m,2H),7.04(s,2H),5.75(dd,J＝8.3,2.4Hz,2H).
实施例4
本实施例为一种铱配合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备化合物12：
Figure GDA0003889943670000171
将IrCl3·nH2O(1.192g，2mmol)和bzq(0.72g，4mmol)以摩尔比1：2加入到乙二醇-乙醚和水的混合溶液(3：1，v/v)中，加热回流24h，过滤，硅胶柱纯化即得0.98g Ir2(bzq)4Cl2(化合物12)，产率83.7％。
S2、制备化合物13：
Figure GDA0003889943670000172
将Ir2(bzq)4Cl2(2.545g，2mmol)和PPβC(1.86g，4mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2：1，v/v)的混合溶液中，在氩气保护下回流4h，反应结束后待溶液冷却至室温，旋蒸除去CH2Cl2后转移至烧杯，向该溶液中加入20mL KPF6饱和水溶液。冰箱4℃冷却过夜后过滤收集，并真空干燥后纯化得到4.0g[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(化合物13)，产率86.4％，纯度98.9％。
本实施例中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的紫外吸收光谱见图8，在225～500nm范围内有两个吸收带，第一个吸收带在250～300nm区域，第二个吸收带在340nm附近，这两个吸收带通常指认为配体内(intraligand(IL))的π-π*的跃迁。
本实施例中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的荧光光谱见图9，在405nm激发下最大发射波长为587nm。
本实施例中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的核磁谱图见图10，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.08(s,1H),11.39(s,1H),9.07(s,1H),8.90(s,3H),8.57–8.50(m,3H),8.34–8.31(m,2H),8.26(dd,J＝5.0,1.2Hz,1H),8.13(dd,J＝5.1,1.3Hz,1H),8.04–7.99(m,5H),7.96–7.93(m,1H),7.91(d,J＝3.2Hz,1H),7.89(d,J＝3.3Hz,1H),7.75(s,1H),7.68(d,J＝7.6Hz,3H),7.60(d,J＝7.7Hz,3H),7.48(ddd,J＝8.1,5.4,1.3Hz,2H),7.40–7.36(m,1H),7.25(s,2H),6.35(dd,J＝7.2,3.6Hz,2H).
测试例
生物活性实验
对实施例2～4中的制得的化合物[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)和[Ir(bzq)2PPβC](PF6)的细胞毒性进行试验，试验方法如下：
细胞毒性实验采用MTT法测定：取处于对数生长期的A549(肺癌细胞系)、HeLa(海拉细胞系)、HepG-2(肝癌组织细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞系)和BEAS-2B(人正常肺上皮细胞)细胞以5×103/孔均匀接种于96孔板，预培养24h。待细胞贴壁，更换培养基，分别以浓度梯度的方式加入[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(DMSO(二甲基亚砜)处理组作为对照组(Control)，不接种细胞组作为空白组)。孵育完成后，加入MTT于96孔板中于37℃孵育4h，随后小心吸出培养液，室温下加入150μL/孔DMSO溶解甲臜，震荡摇匀后，采用酶标仪于570nm波长处测定OD值，并计算细胞存活率。并测得[Ir(bzq)2PPβC](PF6)在有无光照下的细胞毒性。
Figure GDA0003889943670000181
重复三次独立实验后，使用SPSS16.0求半数抑制浓度(Half-inhibitoryconcentration，IC50)。
本发明实施例2～4中制得铱配合物(咔啉类环金属铱配合物)的细胞毒性试验数据和本发明实施例4中制得铱配合物(咔啉类环金属铱配合物)的光毒性试验数据如下表1和2所示：
表1本发明实施例2～4中制得的咔啉类环金属铱配合物的细胞毒性试验结果
Figure GDA0003889943670000182
表2本发明实施例4中制得的咔啉类环金属铱配合物的光照毒性试验结果
Figure GDA0003889943670000183
PI(光毒性指数)＝IC50(暗)/IC50(光)。
本发明实施方式中的环金属铱配合物[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)对肺癌、宫颈癌、肝癌和乳腺癌等癌细胞的IC50较低，有明显的抗肿瘤活性。其中[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)抗肿瘤效果最好，选择此化合物测试其光照后毒性，结果显示，与黑暗处理相比，光照后毒性增强，表现出光毒性。
细胞吸收实验
将细胞接种于60mm组织培养皿中培养12h，然后用配合物处理不同时间，然后收集细胞，用PBS洗涤、离心、去上清，获得细胞沉淀。将沉淀用3mL浓硝酸和1mL双氧水消化24h，然后用超纯水定容至5mL，最后，用ICP-MS检测细胞中配合物的含量，结果用每106细胞中含有的金属铱的质量(g)来表示。
测量细胞吸收时间时选取细胞毒性最好的[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)，图11表明细胞内铱的吸收总剂量以时间依赖性的方式增加，在2.5h左右，吸收量达到最大值。
EdU染色检测细胞增殖
取对数生长期的A549细胞均匀接种在24孔板中，待细胞贴壁后加入配合物培养12h，弃掉培养基，将EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，CAS号：61135-33-9)稀释后加入板中，培养24h，PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤，质量分数为4％多聚甲醛固定，质量分数为3％BSA(牛血清白蛋白)洗涤，0.5％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚，CAS号：9002-93-1)渗透，20min后，3％BSA洗涤，加入Click-it反应混合液，避光孵育30min，3％BSA洗涤，Hoechst 33342(双苯并咪唑H 33342三盐酸盐，CAS号：875756-97-1)避光染色10min，PBS洗涤，显微镜下观察拍照。
EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中，简单、快速准确地检测出细胞增殖情况。Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞毒性较低，常用于细胞核染色或者常规的DNA染色。EdU染色后新复制的DNA呈红色，Hoechst 33342染色后细胞核呈蓝色。如图12所示，与对照组相比，随着铱配合物浓度的升高，A549细胞红色荧光减弱效果越强，表明处理组[Ir(bzq)2PPβC](PF6)使DNA复制减少。
线粒体共定位
i.溶酶体染色追踪实验：
取对数生长的A549细胞接种于Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)和[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(浓度为1μM)，继续孵育6h。去除培养液，加入Lyso-Tracker Green工作液(溶酶体绿色荧光探针)，37℃孵育30min。去除工作液，加入37℃新鲜的细胞培养液，共聚焦激光显微镜下观察。
ii.线粒体染色追踪实验：
取对数生长的A549细胞接种于Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)和[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(浓度为1μM)，继续孵育6h。去除培养液，加入Mito-Tracker Red CMX Ros工作液(线粒体红色荧光探针)，37℃孵育30min。去除工作液，加入37℃新鲜的细胞培养液，共聚焦激光显微镜下观察。
本发明实施方式中制得的[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)和[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)的溶酶体染色结果见图13，从图13中得知[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)与溶酶体不共定位。
本发明实施方式中制得的[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)的线粒体染色结果见图14，从图14中得知[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)与线粒体共定位。
[Ir(ppy)2PPβC](PF6)的共定位系数为0.87；[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)共定位系数为0.89，[Ir(bzq)2PPβC](PF6)共定位系数为0.92，表明所合成的三种环金属铱配合物均能够靶向线粒体，且[Ir(bzq)2PPβC](PF6)靶向效果最佳。
DCF(2',7'-二氯荧光素，CAS号：76-54-0)与线粒体共定位实验
取对数生长的A549细胞接种于Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入1μM[Ir(ppy)2PPβC](PF6)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)和[Ir(bzq)2PPβC](PF6)，继续孵育3h，用稀释后的DCFH-DA(二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯，CAS号：4091-99-0)和Mito-Tracker Red CMX Ros工作液(线粒体红色荧光探针)染色30min，去除工作液，加入37℃新鲜的细胞培养液，共聚焦激光显微镜下观察。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH(二氯二氢荧光素，CAS号：106070-31-9)。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF(2',7'-二氯荧光素)。
本发明实施方式中制得的[Ir(ppy)2PPβC](PF6)(实施例2)、[Ir(dfppy)2PPβC](PF6)(实施例3)、[Ir(bzq)2PPβC](PF6)(实施例4)的DCF与线粒体的共定位测试结果见图15，如图15所示DCF荧光大量聚集的部位与线粒体的荧光明显重合，说明活性氧是从线粒体产生的。
线粒体膜电位的检测
取对数生长的A549细胞接种于Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入不同浓度[Ir(bzq)2PPβC](PF6)，继续孵育6h或12h(浓度为IC50值)。去除培养液，加入JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide，CAS号：21527-78-6)工作液，37℃孵育15min～20min。去除工作液，加入37℃新鲜的细胞培养液，共聚焦激光显微镜下观察。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位ΔΨm的理想荧光探针。在正常细胞中，线粒体膜电位较高，JC-1以多聚体(aggregates)的形式聚集在线粒体内，呈现红色荧光；而在线粒体功能受损的细胞中，线粒体膜电位较低，JC-1以单体(monomer)的形式分散在线粒体内，呈现绿色荧光。
本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的JC-1染色实验结果见图16，由图16可以得出随着药物浓度和时间的增加细胞内绿色荧光明显增强，而红色荧光相应减弱。这种转变说明线粒体膜电位受损。
透射电镜拍摄
细胞接种于10cm皿中，培养24h长到约80％，加入0.5μM[Ir(bzq)2PPβC](PF6)处理24h，收集细胞，800rpm离心6min，清洗1次～2次得到细胞沉淀，缓慢滴加800μL戊二醛，4℃下保存，电镜检测。
本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))处理后的细胞透射电镜图见图17(右侧图为左侧图的方框中的放大图)，在图17中显示出，与对照组(control)相比，加药组细胞线粒体结构发生变化，整体体积变小。表明药物作用于线粒体，导致其结构发生变化。
抑制剂对药物作用的影响
细胞接种于96孔板，培养24小时，加入不同抑制剂(3-MA(CAS号：5142-23-4；3-甲基腺嘌呤)：1mM；Z-VAD-FMK(CAS号：187389-52-2，N-苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-门冬氨酰氟甲基酮)：25μM；Necrostatin-1(5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮，CAS:4311-88-0)：60μM)1h后加入0.5μM[Ir(bzq)2PPβC](PF6)，对照组只加入相同浓度的[Ir(bzq)2PPβC](PF6)，作用24h后加入MTT孵育4h，随后小心吸出培养液，室温下加入150μL/孔DMSO溶解甲臜，震荡摇匀后，采用酶标仪于570nm波长处测定OD值，并计算细胞存活率。
不同抑制剂和本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的对比结果见图18，从图18得知：与只加[Ir(bzq)2PPβC](PF6)的对比，Z-VAD-FMK能够抑制细胞死亡，其他两种无效果，故表明[Ir(bzq)2PPβC](PF6)诱导了细胞发生凋亡。
Annexin V染色实验
取对数生长的A549细胞接种于Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入不同浓度[Ir(bzq)2PPβC](PF6)，顺铂做对照，继续孵育24h。去除培养液，加入annexin V工作液，37℃孵育20min。去除工作液，加入37℃新鲜的细胞培养液，共聚焦激光显微镜下观察。
Annexin V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对膜磷脂酰丝氨酸(PS)有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将Annexin V标记荧光来识别早期的细胞凋亡。
本发明实施例4中制得的化合物13([Ir(bzq)2PPβC](PF6))的Annexin V染色结果见图19，如图19所示，铱配合物处理的细胞和顺铂细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)均被染色，表明化合物13诱导了细胞凋亡。
综上所述，利用本发明的β-咔啉衍生物制备得到的铱配合物，对线粒体具有靶向作用，诱导了细胞线粒体功能障碍，进而可以引起细胞发生凋亡。该配合物易被细胞摄取，而且还具有光毒性，经过光照后其毒性增强。本发明的铱配合物合成条件温和，抗肿瘤效果显著，作用机理新颖，故其可成为抗肿瘤的潜在药物。
上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (5)

1.一种铱配合物，其特征在于：所述铱配合物的结构式如式(Ⅸ)所示：
Figure FDA0003889943660000011
其中，式(Ⅸ)中的X均独立选自苯基；
式(Ⅸ)中的Y均独立选自氢。
2.一种制备如权利要求1所述的铱配合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S01、制备如式(Ⅷ)所示的化合物：
将铱盐和辅助配体反应，制得如式(Ⅷ)所示的化合物；
S02、制备如式(Ⅸ)所示的化合物：
将如式(Ⅷ)所示的化合物和如式(Ⅶ)所示的化合物反应后，再加入六氟磷酸盐，即得式(Ⅸ)所示的化合物；
Figure FDA0003889943660000012
Figure FDA0003889943660000021
其中，式(Ⅸ)中的X均独立选自苯基；
式(Ⅸ)中的Y均独立选自氢。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述铱盐选自氯化铱。
4.一种如权利要求1所述的铱配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种抗肿瘤药物，其特征在于：制备原料包括如权利要求1所述的铱配合物及药学上可接受的辅料。
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