CN114053270B - 泛素结合酶e2t的小分子抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及泛素结合酶E2T(UBE2T)的小分子抑制剂及其在治疗癌症中的应用。

Description

泛素结合酶E2T的小分子抑制剂
技术领域
本发明涉及泛素结合酶E2T(UBE2T)的小分子抑制剂及其在治疗癌症中的应用。
发明背景
泛素结合酶E2T(UBE2T)属于泛素结合酶E2家族成员，最早在范可尼贫血的相关研究中发现，作为范可尼信号通路重要成员参与DNA损伤修复。UBE2T晶体结构已知，它定位于染色体chrl q32.1，它的开放阅读框(ORF)由6个外显子和5个内含子构成，在染色体上的跨度为10.3kb，具有一个特征性保守的结构域，有一个保守的第86位半胱氨酸残基为其活性位点，可与泛素分子形成硫酯键，其C末端具有延伸序列，与UBE2T定位于细胞核有关。研究报道UBE2T在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、骨髓瘤及胃癌等多种癌症的发生发展中起着重要作用。目前已经报道的UBE2T底物蛋白有FANCD2和BRCA1等，已有根据其晶体结构设计合成针对UBE2T的小分子化合物。
RACK1是一种高度保守的细胞内衔接蛋白，与G蛋白β亚单位同源。RACK1能与大量蛋白质直接作用或者作为更大的复合物的部分与其作用。作为支架蛋白，RACK1参与整合来自不同的信号转导途径的信息，对于基本的细胞活动至关重要，比如细胞增殖、转录和蛋白质合成以及不同的神经功能。目前尚未报道过UBE2T与RACK1之间的关联。
仍然需要针对UBE2T的抑制剂，以用于有效地治疗癌症。
发明内容
本发明发现了与UBE2T结合的新的底物蛋白，并从小分子化合物库找到了有效抑制UBE2T的化合物。
具体地，本发明发现UBE2T与RACK1结合，并催化RACK1的泛素化。
具体地，本发明还发现式(I)的化合物(未简明起见，在本文中也称为M435-1279)能够抑制UBE2T催化RACK1的泛素化的活性：
Figure GDA0004212057510000011
因此，在一个方面，本发明涉及式(I)的化合物用于结合并抑制泛素结合酶E2T(UBE2T)的活性的用途：
Figure GDA0004212057510000021
在具体的实施方案中，式(I)的化合物结合并抑制UBE2T的催化RACK1的泛素化的活性。
在其他方面，本发明还涉及式(I)的化合物的衍生物结合并抑制泛素结合酶E2T(UBE2T)的活性。
如本文所用，术语“衍生物”意指通过物理或化学过程从指定化合物衍生的相似化合物。衍生物可以使用标准程序来制备，所述标准程序是合成有机化学领域的技术人员已知的并且例如由J.March,“Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms andStructure(《高等有机化学：反应、机制及结构》)”,第4版(纽约：Wiley-Interscience,1992)描述。举例来说，碱加成盐是使用常规手段从化合物制备而来的，包括使化合物的一个或多个游离羟基与合适的碱反应。本领域技术人员知晓，能够获得式(I)的化合物的衍生物而基本上不改变其功能。
如本文所用，术语“泛素化”是指泛素(一类低分子量的蛋白质)分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程(参见例如Harrigan,J.A.等人，Deubiquitylating enzymes and drug discovery:Emerging opportunities.Nature Reviews Drug Discovery,17(1),57–77)。这些特殊的酶包括泛素激活酶(E1)、结合酶(E2)、连结酶(E3)和降解酶等。泛素结合酶E2T(UBE2T)属于泛素结合酶E2家族成员。
在另一个方面，本发明涉及式(I)的化合物及其衍生物在制备用于治疗患者的UBE2T相关的疾病的药物中的用途
Figure GDA0004212057510000022
Figure GDA0004212057510000031
其中式(I)的化合物结合并抑制UBE2T的活性。
在具体的实施方案中，式(I)的化合物结合并抑制UBE2T的催化RACK1的泛素化的活性。
如本文所用，术语“UBE2T相关的疾病”是指由于UBE2T的过量表达而直接或间接导致的疾病。这样的疾病包括例如范可尼贫血和癌症。癌症可以选自例如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、骨髓瘤及胃癌(参见例如Hao J等人，Elevated expression of UBE2Tin lung cancer tumors and cell lines.Tumour Biol.2008；29:195–203；Ueki T等人，Ubiquitination and downregulation of BRCA1 by ubiquitin-conjugating enzymeE2Toverexpression in human breast cancer cells.Cancer Res.2009；69:8752–8760；Mingxin Wen等人，Elevated expression of UBE2T exhibits oncogenic properties inhuman prostate cancer.Oncotarget.2015；6:25226-25239)。在优选的实施方案中，癌症选自胃癌。
附图说明
图1显示了UBE2T与RACK1结合并催化其泛素化。
图2显示了M435-1279与UBE2T的结合能力。
图3显示了M435-1279抑制UBE2T对RACK1的泛素化。
图4a显示了M435-1279治疗胃癌的克隆形成实验。
图4b显示了M435-1279治疗胃癌的Transweel实验。
图4c-e显示了M435-1279治疗胃癌的肿瘤生长实验。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于举例说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实验材料和方法
细胞系和培养
体外培养的人胃癌细胞株(HGC-27、MKN-45、AGS等)和293T细胞购自中国科学院细胞库。所有细胞系均在补充有10％胎牛血清、青霉素(100mg/ml)和链霉素(100mg/ml)的Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)中培养，并在37摄氏度下于5％CO2的潮湿箱中孵育。当细胞达到75-80％融合时，将它们用PBS中的0.25％胰蛋白酶/2.21mM EDTA传代。
质粒构建与转染
按照以下步骤构建质粒：首先，通过KOD酶系统(KFX-101T，TOYOBO，日本)的PCR获得基因的插入片段，使用特定的限制性酶切出相应的载体，然后使用DNA凝胶提取试剂盒(DP103，天根，中国)纯化DNA。其次，通过Gibson系统连接基因片段和载体。第三，将产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后涂板，选择单克隆菌落PCR。最后，提取质粒并对其进行测序(Plasmid Miniprep试剂盒，天根，中国)。质粒及相应载体、引物序列见下表1：
Figure GDA0004212057510000041
将1x106个HEK-293T细胞接种在6-孔平板中用于转染，16h后，用脂质体2000(1ul)转染质粒(1ug)。
免疫印迹法
用60ul的裂解缓冲液(1M Tris(PH7.4)、10％Triton-100、1M NaCl、0.5M EDTA和dd H2O)在冰中裂解细胞(2x106)10分钟，然后以12000转/分钟的速度离心10分钟以去除碎片和细胞核。用SDS缓冲液在95℃下煮沸5min，最后用样品进行western blot分析。本研究所用抗体信息见下表2：
表2：抗体信息
Figure GDA0004212057510000051
免疫沉淀和免疫共沉淀
用PBS洗涤MG132(10uM，8h，133407-82-6，Abmole，USA)处理的细胞(2×107)并在1ml裂解缓冲液中裂解。以12000转/分的速度离心裂解5分钟以去除碎片和细胞核。用30ul的Flag抗体凝胶珠(SLBZ1501，SIGMA，USA)在4℃孵育2小时，然后用裂解缓冲液洗涤4次，用100ul的洗脱缓冲液(PH＝3.5)洗脱，中和，并进行质谱鉴定。
免疫共沉淀，使用1毫升的裂解缓冲液对细胞(1×107)进行裂解。其中50ul作为全细胞裂解液，其余裂解用20ul的Flag抗体凝胶珠在4℃孵育2小时，然后用裂解缓冲液洗涤，用50ul的洗脱缓冲液(PH＝3.5)洗脱，中和后用SDS缓冲液在95℃煮沸5分钟，最后用western blot进行检测。
体内泛素化试验
将表达HA-泛素、无标签-UBE2T和flag-RACK1的细胞用裂解缓冲液裂解，然后用flag凝胶珠在4℃孵育2小时，洗涤、洗脱、中和和煮沸后，用western blot法检测。
体外泛素化试验
首先，在含有UBE1(100ng)、UBE2T(500ng)、RACK1(1ug)和泛素(5ug)的溶液中加入2ul反应缓冲液(10x)。加入2ul的Mg-ATP(10x)溶液，用ddH2O使体积达到20ul。然后在37℃下孵育反应2小时，然后加入停止缓冲液和SDS缓冲液。最后，煮沸5分钟，进行western blot分析。
微量热泳动实验
MST实验是在一个整体NT.115系统(NanoTemper Technologies GmbH，德国)上进行的，该系统用于量化UBE2T和RACK1之间的相互作用，以及UBE2T和M435-1279之间的相互作用。UBE2T用制造商的标签试剂盒(MonolithTM RED-NHS，NanoTemper TechnologiesGmbH，德国)标记，UBE2T溶液在130mM NaHCO3(pH 8.3)中制备，含有50mM NaCl的RACK1溶液在10mM PBS(pH 7.4)中制备。在测定UBE2T-RACK相互作用时，UBE2T的浓度为200nm，RACK1的滴定范围为61nm～2μM，UBE2T与RACK1的混合溶液中含有0.05％ Tween20。在用M435-1279测量UBE2T时，标记的UBE2T的浓度为100nm，未标记的M435-1279在10M M PBS二甲基亚砜(DMSO)中制备，最终浓度为M435-1279，范围为31nM至0.5μM。将样品加入整体毛细血管(MO L022，以及随后进行的MST分析。所得值分别与RACK1和M435-1279浓度进行了标准化和绘图。然后用单点模型拟合曲线确定离解常数。
克隆形成
用集落形成法检测细胞增殖能力。1000个细胞接种于35mm培养皿中，14天后用0.1％结晶紫染色。
Transweel实验
实验材料：Transwell小室；基质胶，提前12h将基质胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜；上层培养液，上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05％-0.2％BSA；下层培养液；下层培养液采用含5％－10％FBS的培养基；细胞培养板，用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用，下面就以24孔板为例。
实验步骤：
1.铺基质胶：在4℃条件下将基质胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1：8比例稀释(其稀释比例需要摸索，选择一个细胞穿过适中的浓度即可)，取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h，使其聚合成凝胶；
2.细胞培养：取对数生长期的待测细胞，并用PBS洗涤，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1-10x105/ml；
3.接种细胞：在24孔板下室一般加入500-650μL含5％-10％FBS或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液100－200μL加入上室，最后放入培养箱中培养12-48h。
4.细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭基质胶和上室内的细胞。取新的24孔板加入4％多聚甲醛600μL，将小室放入后固定20-30min。
5.细胞染色及计数：弃固定液，用0.1-％0.2％结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。
动物研究
BALB/C裸鼠购自北京查尔斯河公司。将4×106个MKN-45细胞悬浮于100ul的PBS和100ul的基质凝胶中，用于瘤内注射。当肿瘤大小达到75-100mm3时，将M435-1279溶解于0.9％ NaCl以5mg/kg/天的量进行瘤内注射，以0.9％NaCl作为对照。每天用卡尺测量一次肿瘤体积。所有涉及小鼠的程序和实验方案均经兰州大学第二医院伦理委员会批准。
实施例1：M435-1279结合并抑制UBE2T的活性
向HEK-293T细胞中转染Flag-UBE2T、HA-RACK1，用5’GFP(Flag标记的GFP)作为对照，通过免疫共沉淀实验验证UBE2T与RACK1互相结合(图1a)，并通过转染固定量的RACK1与不同量的UBE2T进行Western blotting检测，发现转入UBE2T量越多，RACK1的蛋白水平越低，证明UBE2T可降解RACK1(图1b)。向HEK-293T细胞中转染Flag-RACK1、无标签的UBE2T以及HA-标记的不同突变的泛素链，发现K48R突变的泛素链不能被泛素化，所以UBE2T对RACK1的作用是依赖于K48链的(介导降解)(图1c)。
通过微量热泳动实验(图2)测试UBE2T与M435-1279的结合能力，KD值为50.5微摩尔。
向HEK-293T细胞中转染Flag-RACK1、无标签的UBE2T以及HA-泛素并加入M435-1279，进行免疫共沉淀，发现加入M435-1279能显著抑制UBE2T对RACK1的泛素化(图3)。
实施例2：M435-1279治疗胃癌
克隆形成实验(图4a)证明在胃癌细胞中HGC27、AGS中加入M435-1279后，克隆形成能力明显减弱。Transweel实验(图4b)证明在癌细胞中HGC27、AGS中加入M435-1279后，侵袭能力明显减弱。用胃癌细胞MKN45种植至裸鼠皮下，待瘤子长到80mm3时，用M435-1279进行瘤内注射(5mg/kg/天)，并以DMSO作为对照，发现注射M435-1279的小鼠，瘤子生长速度明显减慢(图4c-e)。
总之,M435-1279可以显著抑制胃癌的进展。
Figure IDA0002618281700000011
Figure IDA0002618281700000021
Figure IDA0002618281700000031

Claims (2)

1.式(I)所示的化合物在制备用于治疗UBE2T相关疾病的药物中的用途：
Figure FDA0004228088980000011
其中，式(I)所示的化合物结合并抑制UBE2T的活性；
所述UBE2T相关疾病为胃癌。
2.如权利要求1的用途，其特征在于，所述活性是UBE2T催化RACK1的泛素化的活性。
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