CN114042193A - 一种注射用交联透明质酸钠凝胶填充剂 - Google Patents

一种注射用交联透明质酸钠凝胶填充剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，包括交联透明质酸纳、手性氨基酸衍生物和甘油，本发明通过手性氨基酸衍生物具有优异的生物相容性，保湿能力强，手性氨基酸衍生物分子与水分子在氢键作用下组装形成手性螺旋纳米纤维结构，手性纳米结构可促进真皮层成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌，从而使填充部位被新生自体组织代替，达到长效和自然美容的效果。

Description

一种注射用交联透明质酸钠凝胶填充剂
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种注射用交联透明质酸钠凝胶填充剂。
背景技术
透明质酸是细胞外基质的主要成分之一，是一种非硫酸化的糖胺聚糖，由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的重复双糖单元组成。由于其独特的理化性质，透明质酸作为填充剂广泛应用于微整形及皱纹、疤痕和面部轮廓缺陷的治疗。未经修饰或非交联的透明质酸填充剂机械强度较低，会在体内快速迁移以及降解，半衰期很短，在皮肤或关节存留不超过1天，难以维持理想的填充效果。
双相透明质酸填充剂是目前市场上应用最广泛的产品，由交联透明质酸粒子和未交联的透明质酸混合制备而成。非交联透明质酸具有粘弹性，而交联透明质酸具有高弹性和较强的稳定性及对酶解的抗性，可以长时间维持其形状。
专利ZL201611138968.6提供了一种注射用交联透明质酸凝胶及其制备方法，将透明质酸分别溶解在含不同交联剂含量的NaOH溶液中，得到交联度不同的透明质酸凝胶，然后按一定比例将两者混匀，得到梯度交联的透明质酸凝胶。与单一交联凝胶相比，梯度交联凝胶具备高内聚性、高粘弹性，填充能力强，减少了凝胶移位的发生。制备的凝胶分子间网络更加紧密，凝胶结构更加稳定，抗酶解性能明显增强，可以在体内维持更长时间，然而该专利并未涉及透明质酸填充剂对填充组织修复的作用。
现有技术制备的透明质酸凝胶在促进自体细胞再生和胶原蛋白分泌方面存在不足，而且体内保留时间仍不能满足需求。
发明内容
针对以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，该复合材料不但保留了透明质酸原有的优良效果，同时其结构更加稳定，能够促进真皮层成纤维细胞增殖，实现自体胶原填充修复。
一种注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，包括交联透明质酸纳、手性氨基酸衍生物，甘油。
所述手性氨基酸衍生物的结构式如式I所示：
Figure BDA0003367787140000021
所述手性氨基酸衍生物采用以下步骤制得：
S1、取苯丙氨酸甲酯盐酸盐、1,4-苯二甲酰氯、三乙胺溶于无水二氯甲烷溶液，搅拌均匀；
S2、减压蒸发反应溶液，将残留固体溶于乙醇，抽滤收集不溶的固体物；
S3、将步骤S2获得固体物溶于甲醇形成悬液，加入氢氧化钠溶液搅拌至溶液澄清，减压蒸发收集残留固体并重溶于水，加入盐酸至溶液pH≤3，抽滤溶液收集不溶物；将所述不溶物加入到二乙二醇溶液中，加适量浓盐酸，130～140℃搅拌反应2～4小时；获得所述手性氨基酸衍生物溶液；
S4、将步骤S3获得溶液加入蒸馏水，抽滤收集沉淀，经清洗干燥获得所述氨基酸衍生物。
在此范围内能够形成手性纤维网络，有利于促进胶原蛋白分泌以及提高透明质酸抗酶解性能。当手性氨基酸衍生物浓度低于0.5mg/mL时，不能形成有效的纤维网络，不利于改善交联透明质酸钠凝胶复合填充剂的稳定性和抗酶解性能。当手性氨基酸衍生物浓度高于2mg/mL时，降低了交联透明质酸钠凝胶复合填充剂的可注射性。
所述交联透明质酸钠采用以下步骤制得：
S1.将透明质酸钠粉末溶解在氢氧化钠溶液中，所得溶液中透明质酸钠的质量分数为5～20％；
S2.加入体积分数为步骤1所得溶液1～5％的交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在35℃～50℃条件下反应8～24小时，获得透明质酸钠胶块；将所述透明质酸钠胶块清洗纯化；采用100～400目筛网过滤、干燥，获得交联透明质酸钠。
优选的，所述交联透明质酸钠采用以下步骤制得：
步骤1、称取透明质酸钠粉末，溶解在1wt.％的氢氧化钠溶液中，所得溶液中透明质酸钠的质量分数为10％，搅拌至溶解；
步骤2、逐滴加入步骤S1所得溶液的体积分数为1～5％交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，在40℃条件下充分反应24小时；反应结束后取出透明质酸钠胶块用蒸馏水清洗纯化；采用100～400目筛网过滤，制得凝胶微粒；最后将交联的透明质酸凝胶钠微粒冷冻干燥。
优选的，所述手性氨基酸衍生物采用以下步骤制得：
取苯丙氨酸甲酯盐酸盐、1,4-苯二甲酰氯、三乙胺溶于无水二氯甲烷溶液，充分搅拌24小时；减压蒸发反应溶液，将残留固体溶于乙醇，抽滤收集不溶物；将所获得固体溶于甲醇形成悬液，加入2mol/L氢氧化钠溶液搅拌至溶液澄清，减压蒸发收集残留固体并重溶于水，逐滴加入3mol/L盐酸至溶液pH至小于3，抽滤溶液收集不溶物；将上述不溶物加入到二乙二醇溶液中，滴加适量浓盐酸，135℃搅拌反应4小时；反应结束后加入蒸馏水，形成凝胶状沉淀，抽滤收集沉淀，经清洗干燥即可获得手性氨基酸衍生物。
所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将手性氨基酸衍生物溶于甘油，制成第一溶液；
步骤2、将交联透明质酸钠溶于水，制成第二溶液；
步骤3、将第一溶液和第二溶液进行混合，混合液中透明质酸钠终浓度10～80mg/mL，手性氨基酸衍生物终浓度0.5～2mg/mL；充分搅拌，静置后获得注射透明质酸钠凝胶复合填充剂。
所述步骤1中，手性氨基酸衍生物与甘油的用量比为0.5-2mg:50μL；
所述步骤2中，所述交联透明质酸凝胶钠与水的用量比为20-80mg:1mL。
所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂在医学美容、皮肤填充、除皱塑形及肌肤修复中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果在于：
一、手性氨基酸衍生物具有优异的生物相容性，保湿能力强，手性氨基酸衍生物分子与水分子在氢键作用下组装形成手性螺旋纳米纤维结构，该手性纳米纤维可促进真皮层成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌，从而使填充部位被新生自体组织代替，达到长效和自然美容的效果。
二、手性氨基酸衍生物分子可以自组装形成水凝胶，同时手性氨基酸衍生物分子的酰胺键与透明质酸的羟基形成氢键作用，构建双网络系统，进一步增加透明质酸凝胶的粘弹性、稳定性和抗酶解性能，在体内维持更长时间。
三、本申请手性氨基酸衍生物分子的加入，明显提高了凝胶填充剂的存储模量，有更好的塑形效果。
四、本申请添加手性氨基酸衍生物分子衍生物凝胶分子的交联透明质酸钠凝胶复合填充剂具有促进自体胶原蛋白分泌的作用，能够达到长效和自然美容的效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1实施例和对比例的细胞培养增殖能力检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
下述实施例中，水为蒸馏水或去离子水经蒸馏所得的水，故又称重蒸馏水。
实施例1
手性氨基酸衍生物的制备：
取苯丙氨酸甲酯盐酸盐3.0g、1,4-苯二甲酰氯1.3g、三乙胺6mL溶于100mL无水二氯甲烷溶液，充分搅拌24小时；减压蒸发反应溶液，将残留固体溶于100mL乙醇，抽滤收集不溶物；将所获得固体溶于80mL甲醇形成悬液，加入5mL氢氧化钠溶液搅拌至溶液澄清，减压蒸发收集残留固体并重溶于500mL水，逐滴加入20mL盐酸至溶液pH值小于3，抽滤溶液收集不溶物；将上述不溶物加入到80mL二乙二醇溶液中，滴加适量0.5mL浓盐酸，130℃搅拌反应4小时；反应结束后加入蒸馏水，形成凝胶状沉淀，抽滤收集沉淀，经清洗干燥即可获得手性氨基酸衍生物分子。
实施例2
手性氨基酸衍生物的制备：
取苯丙氨酸甲酯盐酸盐6.0g、1,4-苯二甲酰氯2.6g、三乙胺10mL溶于150mL无水二氯甲烷溶液，充分搅拌24小时；减压蒸发反应溶液，将残留固体溶于100mL乙醇，抽滤收集不溶物；将所获得固体溶于80mL甲醇形成悬液，加入10mL氢氧化钠溶液搅拌至溶液澄清，减压蒸发收集残留固体并重溶于1000mL水，逐滴加入30mL盐酸至溶液pH值小于3，抽滤溶液收集不溶物；将上述不溶物加入到100mL二乙二醇溶液中，滴加适量浓盐酸，140℃搅拌反应2小时；反应结束后加入蒸馏水，形成凝胶状沉淀，抽滤收集沉淀，经清洗干燥即可获得手性氨基酸衍生物分子。
实施例3
交联的透明质酸钠的制备：
称取1克的透明质酸钠粉末，加入到100毫升质量分数1％的氢氧化钠溶液中搅拌至溶解；逐滴加入1毫升1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在35℃条件下充分反应8小时；反应结束后取出透明质酸钠胶块用蒸馏水清洗纯化；采用100目筛网过滤，制得凝胶微粒；最后将交联的透明质酸钠凝胶微粒冷冻干燥。
实施例4
交联的透明质酸钠的制备：
称取1克的透明质酸钠粉末，加入到100毫升质量分数2％的氢氧化钠溶液中搅拌至溶解；逐滴加入5毫升1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在40℃条件下充分反应24小时；反应结束后取出透明质酸钠胶块用蒸馏水清洗纯化；采用400目筛网过滤，制得凝胶微粒；最后将交联的透明质酸钠凝胶微粒冷冻干燥。
实施例5
交联的透明质酸钠的制备：
称取1克的透明质酸钠粉末，加入到100毫升质量分数3％的氢氧化钠溶液中搅拌至溶解；逐滴加入3毫升1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在50℃条件下充分反应16小时；反应结束后取出透明质酸钠胶块用蒸馏水清洗纯化；采用200目筛网过滤，制得凝胶微粒；最后将交联的透明质酸钠凝胶微粒冷冻干燥。
实施例6
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶10mg溶于1mL水，称取0.5mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例7
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取0.5mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例8
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶40mg，溶于1mL水，称取0.5mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例9
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶60mg，溶于1mL水，称取0.5mg实施例2制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例10
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶80mg，溶于1mL水，称取0.5mg实施例2制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例11
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取1mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例12
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取2mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例13
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶40mg，溶于1mL水，称取1mg实施例2制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例14
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取2mg实施例2制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例15
称取实施例5制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取1mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例16
称取实施例4制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取1mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例17
称取实施例4制备的交联透明质酸钠凝胶40mg，溶于1mL水，称取1mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例18
称取实施例5制备的交联透明质酸钠凝胶80mg，溶于1mL水，称取0.5mg实施例2制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例19
称取实施例5制备的交联透明质酸钠凝胶80mg，溶于1mL水，称取1mg实施例2制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例20
称取实施例4制备的交联透明质酸钠凝胶80mg，溶于1mL水，称取1mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
实施例21
称取实施例4制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，称取2mg实施例1制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射交联透明质酸钠凝胶复合填充剂。
对比例1
不添加手性氨基酸衍生物分子
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶20mg，溶于1mL水，制备成可注射透明质酸填充剂。
对比例2
不添加手性氨基酸衍生物分子
称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶40mg，溶于1mL水，制备成可注射透明质酸填充剂。
对比例3
不添加手性氨基酸衍生物分子
称取实施例4制备的交联透明质酸钠凝胶80mg，溶于1mL水，制备成可注射透明质酸填充剂。
对比例4
手性氨基酸衍生物分子为酪氨酸手性氨基酸衍生物分子
酪氨酸手性氨基酸衍生物分子制备方法同实施例1，不同之处在于，将苯丙氨酸甲酯盐酸盐替换为酪氨酸甲酯盐酸盐。称取实施例3制备的交联透明质酸钠凝胶10mg溶于1mL水，称取0.5mg对比例4制备的手性氨基酸衍生物分子溶于50μL甘油，与上述透明质酸钠溶液充分混合，制备成可注射复合填充剂。
实施例5-20主要考察填充剂各组分含量及交联透明质酸交联程度对其性质的影响，开展以下试验。
一、粘弹性评价
将各实施例及对比例制备的凝胶用Marvern Kinexus Lab+旋转流变仪测定凝胶的粘弹性，记录1Hz频率下的存储模量(G')和损耗模量(G")。各实施例和对比例的测试结果如下表所示：
Figure BDA0003367787140000081
Figure BDA0003367787140000091
结果表明，随着交联剂用量增加，有助于提高填充剂的存储模量，手性氨基酸衍生物分子加入，明显提高了凝胶填充剂的存储模量，有更好的塑形效果。对比例4添加酪氨酸手性酪氨酸衍生物分子的复合填充剂，由于分子氢键作用差异，不能形成有效的手性纤维网络，对透明质酸凝胶的存储模量没有提高作用，存储模量与未添加手性氨基酸衍生物分子的透明质酸填充剂(对比例1)没有明显差别，远低于添加相同含量手性苯丙氨酸衍生物分子的交联透明质酸钠凝胶复合填充剂(实施例6)。
二、抗酶解性能评价
精密称取实施例6-21及对比例凝胶填充剂0.5g，加入2mL的磷酸盐缓冲液(0.lmol/L，pH7.0)和2mL透明质酸酶液(600U/mL)，混合均匀后，置于42℃水浴中，不同酶解时间点取50μL混合液稀释至3mL，用Thermo Evolution201紫外分光光度计测定232nm处的吸光度值，吸光度值不再变化的时间即为酶解时间。
各实施例和对比例的酶解时间如下表所示：
Figure BDA0003367787140000092
Figure BDA0003367787140000101
结果表明，透明质酸交联程度越高，酶解时间越长。手性氨基酸衍生物分子进一步提高了交联透明质酸的稳定性和抗酶解能力，使填充剂能够在体内保留更长时间。
三、细胞增殖评价
选取实施例6，16，21和对比例1进行L-929成纤维细胞培养，采用MTT法检测培养1，3，5天的细胞吸光度。
各实施例和对比例的细胞增殖如图1所示。结果显示，加入手性氨基酸衍生物分子明显促进细胞增殖。
四、细胞分泌胶原蛋白含量评价
选取实施例6，16，21和对比例1进行细胞培养7天，采用胶原蛋白ELISA试剂盒测定总胶原含量。
各实施例和对比例胶原蛋白含量如下表所示：
Figure BDA0003367787140000102
结果表明，添加手性氨基酸衍生物分子的交联透明质酸钠凝胶复合填充剂具有促进自体胶原蛋白分泌的作用，能够达到长效和自然美容的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，其特征在于，包括交联透明质酸纳、手性氨基酸衍生物和甘油。
2.根据权利要求1所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，其特征在于，所述手性氨基酸衍生物的结构式如式I所示：
Figure FDA0003367787130000011
3.根据权利要求1所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，其特征在于，所述手性氨基酸衍生物采用以下步骤制得：
S1、取苯丙氨酸甲酯盐酸盐、1,4-苯二甲酰氯、三乙胺溶于无水二氯甲烷溶液，搅拌均匀；
S2、减压蒸发反应溶液，将残留固体溶于乙醇，抽滤收集不溶的固体物；
S3、将步骤S2获得固体物溶于甲醇形成悬液，加入氢氧化钠溶液搅拌至溶液澄清，减压蒸发收集残留固体并重溶于水，加入盐酸至溶液pH≤3，抽滤溶液收集不溶物；将所述不溶物加入到二乙二醇溶液中，加适量浓盐酸，130～140℃搅拌反应2～4小时；获得所述手性氨基酸衍生物溶液；
S4、将步骤S3获得溶液加入蒸馏水，抽滤收集沉淀，经清洗干燥获得所述手性氨基酸衍生物。
4.根据权利要求1所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，其特征在于，所述交联透明质酸钠采用以下步骤制得：
S1.将透明质酸钠粉末溶解在氢氧化钠溶液中，所得溶液中透明质酸钠的质量分数为5～20％；
S2.加入体积分数为步骤S1所得溶液的1～5％的交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在35℃～50℃条件下反应8～24小时，获得透明质酸钠胶块；将所述透明质酸钠胶块清洗纯化；采用100～400目筛网过滤、干燥，获得交联透明质酸钠。
5.根据权利要求4所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂，其特征在于，步骤S1中，用于溶解透明质酸钠粉末的氢氧化钠溶液的浓度为1％～3％。
6.一种如权利要求1～5中任一项所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将手性氨基酸衍生物溶于甘油，制成第一溶液；
步骤2、将交联透明质酸钠溶于水，制成第二溶液；
步骤3、将第一溶液和第二溶液进行混合制备成混合溶液，充分搅拌，静置后获得注射透明质酸钠复合填充剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述手性氨基酸衍生物与甘油的用量比为0.5-2mg:50μL；步骤2中，所述交联透明质酸钠与水的用量比为20-80mg:1mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，混合液中透明质酸钠终浓度10～80mg/mL。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，手性氨基酸衍生物终浓度0.5～2mg/mL。
10.一种权利要求1-9中任一项所述的注射用交联透明质酸钠凝胶复合填充剂在医学美容、皮肤填充、除皱塑形或肌肤修复中的应用。
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