CN114028938B - 一株耐高温除氨菌的筛选及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物及异位发酵床领域，具体是涉及一株耐高温的除氨苍白空气芽孢杆菌及应用。申请人从异位发酵床垫料中筛选到一株能够在高温下（50℃）除氨的苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus），该菌属于噬热菌，不具有淀粉酶活性，且具有较强的除氨能力。在异位发酵床试验中，苍白空气芽孢杆菌N‑1的添加降低了异位发酵床86.1%的氨气排放量，具有较好的除氨效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及异位发酵床领域，具体是涉及一株耐高温的除氨苍白空气芽孢杆菌及应用。
背景技术
随着我国生猪养殖集约化、规模化程度的不断提高，猪场粪污处理与生态环境治理之间的关系也愈发微妙。在猪肉产能满足社会需要的同时，更需要兼顾生猪养殖所产生的一系列环境问题。
在猪场粪污处理方面，除了好氧堆肥、沼气生产、污水深度处理等技术外，异位发酵床技术是另一种行之有效的粪污处理技术。异位发酵床主要通过微生物代谢作用，使喷洒在床体上的粪污分解成微生物需要的营养元素，同时产生水和二氧化碳，从而实现猪场粪污的无害化处理。相较于堆肥而言，异位发酵床能连续处理猪场产生的粪污，且所需设备和操作工艺相对简单，具有良好的实用性和推广性。
苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus)曾经被归类于Geobacillus属，但随后的研究表明其生理生化特征区别于Geobacillus属，因此被重新定义为Aeribacillus属。此外，苍白空气芽孢杆菌多能耐受极端环境(高温、高盐)，一些还能产生高温淀粉酶。有研究利用产高温淀粉酶的苍白空气芽孢杆菌与其他菌株制成复合菌剂后，应用于异位发酵床并取得一定的效果，利用的苍白空气芽孢杆菌能够在异位发酵床运行过程中水解粪污中的淀粉类物质 (CN2017108899264)。
与堆肥类似，在异位发酵床的运行过程中，粪污中大量未被消化的蛋白质、氨基酸在产气菌的作用下很快被分解为NH3、挥发性硫化物、挥发性脂肪酸等刺激性气体，其中氨气是主要的恶臭气体之一。因此，有效降低异位发酵床氨气的排放将极大改善猪场环境。
目前尚未有关于苍白空气芽孢杆菌除氨的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种能高效去除异位发酵床或堆肥中产生的氨气的苍白空气芽孢杆菌，所述菌株已于2021年9月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti strain)N-1，保藏编号：CCTCC NO：M20211204地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
本发明的另一个目的在于提供了苍白空气芽孢杆菌((Aeribacillus compostistrain))N-1在除氨中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus)N-1的获得：
本发明的菌株筛选源于自然发酵的异位发酵床的新鲜垫料，于50℃环境下培养筛选，保留高温环境下氨氮去除率最高的菌株(24h氨氮去除率52.9％)。经过16S rDNA比对，其与苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus strain)高度相似，因此命名为苍白空气芽孢杆菌N-1，所述菌株已于2021年9月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti strain)N-1，保藏编号：CCTCC NO：M20211204地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
经过革兰氏染色表明，其属于革兰氏阳性菌，杆状或柱状，菌落呈乳白色不透明，无淀粉酶活性；可用LB培养基在50～60℃环境震荡培养制成菌液。
苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti strain)N-1在除氨中的应用，包括在异位发酵床或堆肥中降低氨气排放量，控制臭气排放。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的苍白空气芽孢杆菌N-1具有耐受极端环境的能力，更适合异位发酵床长期高温、高盐的发酵环境。
本发明首次报道苍白空气芽孢杆菌没有产淀粉酶的能力，但具有除氨作用，可用于降低发酵过程中的氨气排放量，控制臭气排放。
附图说明
图1为分离菌株对氨氮去除能力测定示意图；
由图可知，24h培养基铵态氮去除效率最高的菌株为N-1。
图2为苍白空气芽孢杆菌N-1的生长形态(A)、淀粉酶活性(B)和革兰氏染色(C)图，该菌株在含有0.2％淀粉的平板培养基上无水解透明圈，即无淀粉酶活性。
图3为苍白空气芽孢杆菌N-1在不同温度(A)、pH(B)、氯化钠(C)下的生长情况，由图可知，该菌株在30～40℃时生长缓慢，属于嗜热菌，其最适生长温度为60℃，这也意味着该菌株能适应长期高温的异位发酵床环境。
图4为异位发酵床运行过程的温度变化示意图。
图5为异位发酵床运行过程的含水率变化示意图。
图6为异位发酵床运行过程pH变化示意图。
表明异位发酵床成功启动并正常运行，异位发酵床含水率的快速升高是由于密闭环境下水蒸汽无法排除所致。
图7为异位发酵床运行过程中氨气排放情况。
图8为异位发酵床运行过程中氨气累积排放情况示意图；
由图可知，与CK组相比，苍白空气芽孢杆菌N-1的添加极大的降低了异位发酵床运行过程中的氨气排放，氨气去除效率为86.1％。
具体实施方式
本发明技术方案中，所述试剂如未特别说明，均为分析纯(国药)；所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。
培养基中铵态氮测定采用靛酚蓝比色法测定。
试验中氨气采用2％硼酸吸收后，用经过标定后的0.02M盐酸滴定。
1L富集及选择培养基：硫酸铵0.50g；琥珀酸钠5.62g；磷酸氢二钾0.25g；硫酸镁0.125g；氯化钠0.125g；微量元素培养液1mL；水定容至1L后，调节pH 7.2，固体培养基则加入15g琼脂。
1L微量元素液：七水合硫酸锌0.10g；六水合氯化钴0.16g；五水合硫酸铜0.15g；一水合硫酸锰0.10g；硼酸0.02g；二水钼酸钠0.02g；六水氯化镍0.05g；六水氯化铁0.16g；定容至1L。
实施例1：
苍白空气芽孢杆菌N-1的分离纯化与鉴定：
1、异位发酵床垫料的取样及除氨菌的富集培养
异位发酵床垫料来源于实验室前期自然发酵的猪粪水异位发酵床高温期垫料。取10g 异位发酵床垫料于250mL无菌三角瓶，加入灭菌的液体富集培养基100mL，50℃恒温震荡培养驯化3天，随后取10mL培养液再次接种于100mL液体富集培养基中，反复3次。
2、除氨菌的分离筛选
取10mL上述富集培养液于90mL无菌生理盐水中，充分震荡，形成混合菌液。采用倍比稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的细菌悬液，每个梯度取100uL细菌悬液涂布于固体选择培养基中，3个重复。将培养皿倒置于50℃培养箱中，每天观察菌落形态。
待菌落长至肉眼可辨别的大小时，挑取具有典型形态的不同菌落于液体富集培养基中培养，在固体选择培养基中画线纯化，得到纯化菌株。
3、筛选菌株除氨性能的初步测定
用接种环挑取单个菌株于无菌液体富集培养基中，50℃220rpm/min震荡培养24h，取培养液按照1％的接种量接种至新的无菌液体富集培养基中，每株菌三个重复，同时做一空白对照。震荡培养24h，用靛酚蓝比色法测定培养基中铵态氮含量，计算各菌株对培养基铵态氮的去除效率。
4、目的菌株的鉴定
如图1所示，经过24h高温培养后，N-1菌株的除氨效率为52.9％，因此将其作为目的菌株。
使用细菌DNA基因组提取试剂盒提取N-1菌株的基因组DNA(购买于武汉三倍体生物科技有限公司)，使用通用引物27F/1492R引物扩增N-1菌株的16S rDNA(由武汉擎科新业科技有限公司合成)。引物序列：正向引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。片段长度1465bp。
PCR扩增反应体系：总体系50μL，包括1.1×T3 Super PCR Mix 44μL(购买于武汉擎科新业科技有限公司)，上下游引物各2μL，DNA模板2μL。PCR反应条件见表1。
表1 PCR反应条件
取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经成像检测，条带明亮，片段大小与预期一致；将余下40μL PCR产物送至武汉擎科新业科技有限公司测序。待测序结果返回后，将结果输入美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Nucleotide BLAST进行序列比对，结果表明，该菌株与苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus)相似度达99％。
该菌在固体培养基上呈乳白色，不透明状(图2中A)；将苍白空气芽孢杆菌N-1以平板划线法接种于0.2％淀粉的培养基上，48h后滴加碘液，无水解透明圈(图2中B)，说明本发明的苍白空气芽孢杆菌并不代谢生产淀粉酶；对该菌进行革兰氏染色，表明该菌为革兰氏阳性菌，显微镜观察为杆状或柱状(图2中C)。
所述菌株已于2021年9月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti strain)N-1，保藏编号：CCTCC NO：M20211204地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
实施例2：
苍白空气芽孢杆菌N-1最适生长环境的确定：
配制LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g。
1、温度对苍白空气芽孢杆菌N-1生长的影响
LB培养基(调节pH为7.2)经分装灭菌后，接种1％的苍白空气芽孢杆菌N-1菌液，每组做一空白，分别置于30、40、50、60、70℃环境，220rmp/min培养24h，测定OD600。
结果如图3中A所示。
2、pH对苍白空气芽孢杆菌N-1生长的影响(图3中B)
LB培养基经分装并分别调节pH为5、6、7、8、9、10后，灭菌，接种1％的苍白空气芽孢杆菌N-1菌液，每组做一空白，置于60℃环境，220rmp/min培养24h，测定OD600。
结果如图3中B所示。
3、氯化钠浓度对苍白空气芽孢杆菌N-1生长的影响(图3中C)
按照氯化钠含量分别为0、3、6、9、12、15％配制LB培养基，分装灭菌后，接种1％的苍白空气芽孢杆菌N-1菌液，每组做一空白，置于60℃环境，220rmp/min培养24h，测定OD600。
经测定，苍白空气芽孢杆菌N-1的最适生长温度为50-60℃，在pH为7-8时生长较好，能够耐受6％的氯化钠(图3)；以上指标表明苍白空气芽孢杆菌N-1能适应异位发酵床的环境。
在最适生长条件下，即含氯化钠1％的LB培养基，pH＝8.0，发酵温度＝60℃的发酵条件下，以220rpm/min震荡培养24h后，该苍白空气芽孢杆菌N-1的发酵液活菌数在1.45×108～ 2.02×108cfu/mL之间。
实施例3：
苍白空气芽孢杆菌N-1对异位发酵床氨气的去除试验：
1、气体收集装置：
利用厚度为5cm的发泡板搭建异位发酵床的保温层，在保温层内放置30cm×30cm×58cm 的发酵桶。发酵桶上方设计进气口和出气口，进气口分别连接空气泵和气流计，出气口连接盛有2％硼酸的250mL三角瓶。
产生的氨气使用2％硼酸吸收后，用已经标定的0.02M盐酸滴定。
2、异位发酵床的制作：
取2200g已经粉碎的玉米秸秆(1cm筛)，加入鲜粪1800g，水1000g，CK组不添加任何菌剂，处理组加入1.01×1011cfu的苍白空气芽孢杆菌N-1，调节含水率约50％，混匀后，分装于发酵装置。
3、异位发酵床的管理：
异位发酵床的常规操作，在第1、4、7、10、13天进行粪污添加。
如图4所示，异位发酵床成功启动后，处理组和CK组温度逐渐升高，达到50℃以上。在异位发酵床运行的前10天，处理组和CK组运行温度并无差异；但随着粪污的持续添加，第10天后，处理组温度高于CK组，这可能由于苍白空气芽孢杆菌N-1更适合当前高含水率和高pH的发酵环境所致。
如图5所示，随着发酵的进行，异位发酵床含水率持续上升，可能由于该气体收集装置是密闭状态，异位发酵床产生的水蒸气无法排出所致，但在整个试验过程中，异位发酵床含水率基本在正常范围内。
如图6所示，随着发酵的进行，异位发酵床pH逐渐上升，并维持在9左右。苍白空气芽孢杆菌N-1添加后，异位发酵床pH高于CK组，这可能由于苍白空气芽孢杆菌N-1的添加改变的异位发酵床的微生物群落结构所致。
如图7所示，异位发酵床氨气在第二天开始产生，且苍白空气芽孢杆菌N-1添加大大降低了氨气的排放量。CK组氨气的排放在第4天时达到最高峰，排放量高达15.08mg；苍白空气芽孢杆菌组氨气的排放在第5天时达到最高峰，排放量为2.53mg。氨气排量的计算公式为：
氨气(mg)＝(V末-V初)×C盐酸×0.017×1000 V末-V初：消耗盐酸的体积，单位mL
C盐酸：经标定过的盐酸浓度，单位mol/L 0.017：氨气的毫克当量数
如图8所示，在整个异位发酵过程中，氨气排放逐渐累积。CK组氨气排放累计为43.61mg；苍白空气芽孢杆菌组氨气的排放累计为6.06mg。苍白空气芽孢杆菌N-1的添加有效控制了异位发酵床氨气的排放，氨气去除效率为86.1％。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (2)
1. 一株分离的苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus），所述苍白空气芽孢杆菌的保藏编号为：CCTCC NO：M20211204。
2.权利要求1所述的苍白空气芽孢杆菌在降低异位发酵床发酵氨气排放中的应用。
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