CN114028573A - 拟杆菌属肠道菌及其代谢相关物质在制备逆转氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药用途领域，具体涉及一种包含氟尿嘧啶类药物和拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质的治疗消化系统癌症的药物组合物及其制剂和用途，其中所述拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性。另外，本发明还涉及拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质在制备逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的用途。

Description

拟杆菌属肠道菌及其代谢相关物质在制备逆转氟尿嘧啶类药 物耐药性的药物中的用途
技术领域
本发明属于医药用途领域，具体涉及一种包含氟尿嘧啶类药物和拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质的治疗消化系统癌症的药物组合物及其制剂和用途。另外，本发明还涉及拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质在制备逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的用途。
背景技术
现如今在一些不利因素与不良外部环境的影响下，癌症已成为严重危害人类健康的疾病之一，发病率在近年来正在逐步上升，其中消化系统癌症是常见的恶性肿瘤，其对于近年来逐步开展应用的免疫疗法显示预后较差。目前，除手术外，化学治疗在消化系统癌症临床综合治疗中仍然是主要手段之一。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)自1957年问世以来是一种应用广泛的化疗药物，一直以来与其衍生物一起作为消化系统肿瘤化疗的基础用药。5-FU属于胸苷酸合成酶抑制剂类药物，通过抑制胸苷酸合酶并将其代谢产物结合到核酸分子中来实现其抗癌功能，在胃癌、结直肠癌以及肝癌等多种消化系统癌症中作为一线化疗药物被广泛应用。无论使用何种化疗方案，5-FU都是不可或缺的基础用药，但是因患者易对其产生耐药性而使得5-FU总体有效率较低。
肿瘤细胞一旦产生耐药性，化疗药物对其的作用就会趋向于不敏感。即便大部分肿瘤细胞被化疗药物消灭，但残留的肿瘤细胞仍然会持续生长并导致肿瘤复发。5-FU化疗耐药包括原发性耐药和继发性耐药。5-FU原发性耐药由于胸苷酸合成酶(thymidylatesynthase)mRNA转录增加及蛋白水平升高等引起。5-FU继发性耐药原因包括催化5-FU代谢生成活性产物的酶缺失、催化5-FU分解代谢的酶活性增加、还原型叶酸底物的缺乏及某些基因过表达和突变等。研究耐药机制并且逆转耐药可以提高5-FU在消化系统肿瘤中的应用价值。虽然对于肿瘤耐药的研究已经取得了长足进步，但5-FU的获得性耐药仍是氟尿嘧啶类药物临床应用上亟待解决的问题。因此，寻找5-FU自身诱导出现的化疗耐药机制及其靶向抑制剂仍然是消化系统癌症治疗中的重要难关，在耐药性肿瘤的治疗中具有十分重要的意义。
本发明人首次发现，拟杆菌属肠道菌及其代谢相关物质在体外和体内实验中均显示出较强的肿瘤耐药逆转活性，其能够与抗肿瘤药物合用治疗产生5-FU耐药的肿瘤，为寻找新的有效的抗肿瘤药物开辟了一条新的途径。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种包含氟尿嘧啶类药物和拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质的治疗消化系统癌症的药物组合物及其制剂和用途。另外，本发明还提供了拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质在制备逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的用途。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种治疗消化系统癌症的药物组合物，所述药物组合物包含氟尿嘧啶类药物和拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质，其中所述拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性。
作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述氟尿嘧啶类药物选自以下的一种或多种：5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、氟尿苷或脱氧氟尿苷，所述氟尿嘧啶类药物在体内均转化为5-氟尿嘧啶。
所述拟杆菌属肠道菌选自以下的一种或多种：粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、化脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、普通拟杆菌(Bacteroides wdgatus)、卵圆拟杆菌(Bacteroides ovatus)、便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。
作为可选的方式，在上述药物组合物中，优选地，所述拟杆菌属肠道菌选自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，所述拟杆菌属肠道菌的代谢相关物质选自丁酸-S1P。
更优选地，在所述药物组合物中，拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质与氟尿嘧啶类药物的重量份数比为1:4-4:1。
另外更优选地，所述重量份数比选自1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1或4：1。
在第二个方面中，本发明提供了一种治疗消化系统癌症的药物制剂，所述药物制剂包含上述第一个方面所述的药物组合物，以及药学上可接受的载体。
作为可选的方式，在上述药物制剂中，所述药物制剂为口服制剂。
优选地，口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。
在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者上述第二个方面所述的药物制剂在制备治疗消化系统癌症的药物中的应用，所述拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性。
作为可选的方式，在上述用途中，所述消化系统癌症选自以下的一种或多种：食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌。
在第四个方面中，本发明提供了拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质在制备逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述消化系统癌症选自以下的一种或多种：食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌。
所述氟尿嘧啶类药物选自以下的一种或多种：5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、氟尿苷或脱氧氟尿苷，所述氟尿嘧啶类药物在体内均转化为5-氟尿嘧啶。
所述拟杆菌属肠道菌选自以下的一种或多种：粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、化脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、普通拟杆菌(Bacteroides wdgatus)、卵圆拟杆菌(Bacteroides ovatus)、便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。
作为可选的方式，在上述用途中，优选地，所述拟杆菌属肠道菌选自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，所述拟杆菌属肠道菌的代谢相关物质选自丁酸-S1P。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明将现有的脆弱拟杆菌制剂发掘出新的药用价值。本发明人首次发现，拟杆菌属肠道菌及其代谢相关物质在体外和体内实验中均显示出较强的肿瘤耐药逆转活性，其能够与抗肿瘤药物合用治疗产生5-FU耐药的肿瘤，显著提高了消化系统肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。因此，为寻找新的有效的抗肿瘤药物开辟了一条新的途径。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：经5-FU治疗不同预后的结直肠癌患者的菌群分布差异。
图2：经5-FU治疗不同预后的结直肠癌患者粪便样本差异最显著的菌种的富集分析。
图3：MTT检测分析脆弱拟杆菌共培养下的5-FU半数抑制浓度的示意图。体外构建培养HT-29细胞、HCT-116细胞和SW620细胞，并将其与脆弱拟杆菌共培养，加入浓度梯度5-FU(6.25μM-100μM)检测其半数抑制浓度。
图4：图示为添加PBS组与添加脆弱拟杆菌组的HCT116细胞系抑制率随5-FU浓度的变化情况。
图5：图示为添加PBS组与添加脆弱拟杆菌组的HT-29细胞系抑制率随5-FU浓度的变化情况。
图6：图示为裸鼠皮下瘤体积与给药种类之间的关系。
图7：注射脆弱拟杆菌的5-FU治疗组小鼠瘤体积显著低于对照组小鼠瘤体积，且相比于单独注射5-FU组小鼠与对照组小鼠的瘤体积差异更为显著。
图8：注射脆弱拟杆菌的5-FU治疗组小鼠体重与对照组小鼠相比降低不明显。
图9：注射脆弱拟杆菌的5-FU治疗组小鼠瘤体积显著低于对照组小鼠瘤体积，且相比于单独注射5-FU组小鼠与对照组小鼠的瘤体积差异更为显著。
图10：脆弱拟杆菌及其代谢相关物质丁酸-S1P结构可有效激活β-arrestin-1介导的偏向性信号传导，而HCT116细胞单独培养则不能诱导上述偏向性共聚物的形成。
图11：图示为添加PBS组与添加丁酸-S1P组的HCT116细胞系抑制率随5-FU浓度的变化情况。
图12：图示为添加PBS组与添加丁酸-S1P组的HT-29细胞系抑制率随5-FU浓度的变化情况。
具体实施方式
本发明人在对氟尿嘧啶类药物耐药机制的深入研究中，通过大量筛选，首次发现拟杆菌属肠道菌及其代谢相关物质具有较强的肿瘤耐药逆转活性，其能够与抗肿瘤药物合用治疗产生5-FU耐药的肿瘤，显著提高了消化系统肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。在此基础上完成了本发明。
为了便于本领域技术人员的理解，下面对本发明中涉及的主要活性成分进行描述。
如本文所用，术语“氟尿嘧啶类药物”选自以下的一种或多种：5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、氟尿苷或脱氧氟尿苷，所述氟尿嘧啶类药物在体内均转化为5-氟尿嘧啶。
如本文所用，术语“拟杆菌属”是指革兰氏染色阴性、无芽孢、专性厌氧的小杆菌。又称类杆菌属。正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道。本发明的“拟杆菌属肠道菌”选自以下的一种或多种：粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、化脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、普通拟杆菌(Bacteroides wdgatus)、卵圆拟杆菌(Bacteroides ovatus)、便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。
如本文所用，术语“脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)”是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成员，属于拟杆菌门，完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等。拟杆菌属有25个菌种，仅来自人类的有10个菌种，仅来自动物的有10个菌种，来自人和动物的有5个菌种。脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依培养基的不同和生长阶段的不同，菌体形态呈现多形性，一般条件下菌体为杆状、两端钝圆、着色深，中间色浅且不均匀，有荚膜、无芽胞、无动力，有些有空泡，菌体长短不一。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。
如本文所用，术语“丁酸-S1P”结构如以下所示，
Figure BDA0003401407540000061
本发明证明丁酸-S1P可以减少S1PR2-β-arrestin-1复合物的产生，从而引发DPD的转录下调与5-FU的耐药逆转。S1PR2-β-arrestin-1是一个具有多重功能的信号蛋白，可以发挥多种重要生理功能，促进DPYD基因在启动子区结合的上调。丁酸-S1P对逆转消化道癌症5-FU耐药的作用未见报道。
如本文所用，本发明药物组合物中的“氟尿嘧啶类药物”和“拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质”可以在同一药物制剂中施用，也可以在不同药物制剂中施用。在不同药物制剂中施用的情况下，“氟尿嘧啶类药物”和“拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质”的剂型可以是相同的，也可以是不同的。此时，“氟尿嘧啶类药物”和“拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质”的剂型使用上述活性成分临床上使用的常规剂型即可，例如，“氟尿嘧啶类药物”可以使用注射剂以及各种口服制剂，“拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质”可以使用各种口服制剂，并且，“氟尿嘧啶类药物”和“拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质”可以同时或顺序施用。
如本文所用，本发明药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。优选地，本发明的剂型为片剂或胶囊剂。
如本文所用，本发明的“药学上可接受的载体”是指药物制剂领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、色素、矫味剂、溶剂、表面活性剂中的一种或几种。
本发明所述填充剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述助悬剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
优选地，可以将本发明的药物制成各种固体口服制剂、液体口服制剂等。药剂学可接受的口服剂固体制剂有：普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂等。
上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。
在上文所述的医药用途中，对于“氟尿嘧啶类药物”和“拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质”的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。例如，将对小鼠或大鼠的治疗方案应用于人体上，所有药物对人的有效剂量可以通过该药物对小鼠或大鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员而言也是容易实现的。
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
除非另外说明，否则本发明中涉及的百分比和份数均为重量百分比和重量份数。
除非另有说明，否则以下实验采用SPSS20.0统计软件进行原始数据整理和分析，并用GraphPad Prism 8.0软件对实验数据进行汇总和作图。实验数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示多组间的差异比较，通过正态检验后采用单因素方差分析(One-Way-ANOVA)进行两组间比较，服从正态分布采用独立样本t检验(Independent-Samples TTest)。
实施例1：经5-FU治疗不同预后的结直肠癌患者的菌群分布差异
收集北京大学第一医院胃肠外科初诊收治，经肠镜、组织病理学确诊的5-FU治疗复发的结直肠癌患者和5-FU治疗预后理想的结直肠癌患者粪便样本各10例。其中患者年龄18-75岁，男女不限，受试者清楚了解研究目的，愿意且能够遵守要求完成研究，并签署伦理委员会审批通过的知情同意书。取样前至少1个月没有使用过任何抗生素治疗。
将上述样本进行16sRNA测序，分析两组样本菌群分布差异(见图1)。对上述粪便样本差异最显著的菌种进行富集分析，发现5-FU治疗预后理想的结直肠癌患者粪便样本中的脆弱拟杆菌相比于5-FU治疗复发的结直肠癌患者显著升高(见图2)。
实施例2：脆弱拟杆菌可使5-FU对HCT116和HT-29细胞的抑制率显著升高
采用CCK8法对HCT116细胞(
Figure BDA0003401407540000091
-247TM)和HT-29细胞(
Figure BDA0003401407540000092
-38TM)进行浓度梯度5-FU给药并测定其抑制率，简要的实验流程如图3所示。
通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定评估5-FU作用下各组的HCT116和HT-29细胞存活率：将各组细胞以2×103/孔的细胞密度接种在96孔板中并培养24h后(每孔加入100μL)，分别加入浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μM的5-FU稀释液。孵育24h后，向每孔内加入10μL的CCK-8试剂，并在37℃和5％CO2中孵育30min。利用酶标仪测量450nm处的吸光度值，计算各组细胞存活率以比较各组细胞对5-FU治疗的敏感性。
细胞存活率(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(未加药)-OD(空白)]×100
OD(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度。
OD(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度。
OD(未加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
结果显示，利用CCK8法检测得到两种细胞对不同浓度梯度5-FU抑癌作用的敏感性差异，计算分析对照组HCT116和HT-29细胞的5-FU半数抑制浓度(IC50)分别为37.12±1.48μM和4.21±0.31μM；而脆弱拟杆菌共培养(脆弱拟杆菌购自ATCC，货号25285TM，实施例2中体外实验使用的脆弱拟杆菌用量为100MOI)组HCT116和HT-29细胞5-FU的IC50分别为6.23±0.87μM和7.42±0.93μM(分别见图4和图5)，即脆弱拟杆菌共培养可有效提升部分结直肠癌肿瘤细胞对5-FU治疗的敏感性。
具体地，随着5-FU浓度的增加，添加PBS进行培养的HCT116细胞系与添加脆弱拟杆菌进行培养的HCT116细胞系抑制率均上升，其中添加脆弱拟杆菌组抑制率随5-FU浓度增加升高更为显著，在5-FU浓度为12.5μM时即可达到80％(见图4)。随着5-FU浓度的增加，添加PBS进行培养的HT-29细胞系与添加脆弱拟杆菌进行培养的HT-29细胞系抑制率均上升，其中添加脆弱拟杆菌组抑制率升高随5-FU浓度增加更为显著，抑制效果更为明显，在5-FU浓度为12.5μM时抑制率即稳定达到90％(见图5)。
实施例3：脆弱拟杆菌可对5-FU抑制裸鼠腋下瘤增殖起一定增强作用
取6-8周体重相近的健康裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，BALB/c裸鼠)进行肿瘤细胞HCT116的腋下接种，待其瘤体积增至1000mm3左右，再将瘤块组织均匀接种于24只裸鼠腋下，饲养1周后进行各组裸鼠腋下的肿瘤增殖。待皮下肿瘤组织增至近相同大小体积(约50mm3)后，开始对生理盐水溶剂组、5-FU单用组(5mg/kg)、脆弱拟杆菌单用组(每只动物8×107CFU)、5-FU+脆弱拟杆菌联用组(5mg/kg，每只动物8×107CFU)小鼠分别进行每周5次的尾静脉给药和灌胃接种。对各组小鼠取材前进行裸鼠活体拍照见图6，如图中所示单独注射脆弱拟杆菌组小鼠瘤块大小与对照组小鼠瘤块大小差异不明显，单独注射5-FU组小鼠瘤块大小肉眼可见小于对照组小鼠瘤块大小，注射脆弱拟杆菌的5-FU治疗组小鼠瘤块体积小于单独注射5-FU组小鼠瘤块大小，且明显小于对照组小鼠。
处死小鼠后，取出的各组瘤块大小再进行差异比较(图7)。图示为裸鼠瘤重与给药种类之间的关系。注射脆弱拟杆菌的5-FU治疗组小鼠瘤体积相比于对照组小鼠瘤体积降低了52.32％，具有极显著差异。而单独注射脆弱拟杆菌组小鼠瘤体积减小了4.77％，无显著差异；单独注射5-FU组小鼠瘤体积减小了22.36％，没有注射脆弱拟杆菌的5-FU治疗组小鼠瘤体积降低显著。
上述结果表明，脆弱拟杆菌单独治疗效果甚微，5mg/kg尾静脉注射5-FU单独治疗具有较低程度的抑制作用，而8×107CFU脆弱拟杆菌在体内表现出非常突出的5-FU耐药逆转作用，提示脆弱拟杆菌可作为潜在新型逆转5-FU耐药的生物制剂。
实施例4：脆弱拟杆菌可对5-FU的毒副作用进行有效减弱并提升5-FU在小鼠体内抑瘤率
为验证脆弱拟杆菌在体内的5-FU耐药逆转作用，取裸鼠进行HCT116肿瘤细胞的腋下接种。将1000mm3左右的瘤块组织均匀接种于24只裸鼠腋下后，对各组裸鼠饲养1周并进行腋下的肿瘤增殖。待皮下肿瘤组织增至近约50mm3后，开始对四组小鼠分别进行每周5次的尾静脉给药和灌胃接种。在连续给药的24天里，每天记录裸鼠体重(图8)和肿瘤体积(图9)，绘制出体重变化曲线和肿瘤体积变化曲线。
结果显示，如图8所示，5mg/kg 5-FU单独治疗组的小鼠体重持续下降，8×107CFU脆弱拟杆菌单独治疗组的小鼠体重持续上升，生理盐水溶剂组与5-FU+脆弱拟杆菌联用组(5mg/kg，8×107CFU)体重下降后又有回升，在给药24天后与对照组小鼠体重基本持平。结果发现，如图9所示，HCT116细胞在四组小鼠的皮下接种均有较为显著的肿瘤增殖，取材前最后一次测算各组小鼠瘤体积，其中脆弱拟杆菌单独治疗组具有0.87％的抑制率，而5-FU单独治疗组具有18.44％的抑制率，最后5-FU+脆弱拟杆菌联用方案可将体内抑瘤率提高至49.42％。
实施例5：脆弱拟杆菌共培养或丁酸-S1P结构可有效诱导S1PR2-β-arrestin-1复合物的形成
将脆弱拟杆菌与丁酸-S1P加至HCT116结直肠肿瘤细胞培养液中，通过CO-IP实验检测其偏向性转导共聚物S1PR2-β-arrestin-1的形成。
在实验中使用的丁酸-S1P的制备方法包括通过Boc保护下的丁酸与S1P在DMAP、EDCI缩合条件下发生酰胺化缩合反应，再以TFA脱除Boc保护得到化合物丁酸-S1P，并通过LC-MS及核磁共振氢谱和碳谱鉴定分析上述结构及纯度。
移去培养基，按每1.0×105个HCT116细胞150μL的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至EP管内并加入20μL结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液(4℃，14000g，10min)，置于冰上备用。将免疫沉淀磁珠漩涡振荡1min，使磁珠充分振荡重悬；取25μL磁珠悬液置于1.5mL EP管中。加入200μL结合缓冲液洗涤，进行磁性分离，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清，再加入200μL结合缓冲液。用结合缓冲液稀释抗体样品，在本实验中使用的抗体为S1PR2(Abcam，ab235919)和β-arrestin-1(Abcam，ab32099)抗体，将抗体配制成终浓度为5-50μg/mL抗体工作液，置于冰上备用。将磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液；加入200μL抗体工作液，迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管，15min后进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200μL结合缓冲液洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管。加入200μL待测细胞裂解液，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管10min，使抗原与抗体充分结合，将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200μL洗涤缓冲液洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁性分离器上取下EP管，再重复洗涤两次。最后加入200μL洗涤缓冲液，用移液器将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5mL EP管中，并执行磁性分离，移弃上清。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入20μL洗脱缓冲液混合均匀，室温孵育10min。然后执行磁性分离，收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于Western Blotting验证。
结果显示，脆弱拟杆菌与其代谢相关物质丁酸-S1P结构可有效激活S1PR2与β-arrestin-1结合形成聚合物(图11)。
实施例6：丁酸-S1P可使5-FU对HCT116和HT-29细胞的抑制率显著升高
实验方法参见实施例2。丁酸-S1P的制备方法见实施例5。
结果显示，利用CCK8法检测得到HCT116和HT-29两种细胞对不同浓度梯度5-FU抑癌作用的敏感性差异，计算分析对照组HCT116和HT-29细胞的5-FU半数抑制浓度(IC50)分别为36.38±1.13μM和4.55±0.12μM；而丁酸-S1P(20μM)组HCT116和HT-29细胞5-FU的IC50分别为6.44±0.69μM和1.02±0.23μM(分别见图11和图12)，即丁酸-S1P可有效提升结直肠癌肿瘤细胞对5-FU治疗的敏感性。
综上所述，过往研究已经证明，S1PR2-β-arrestin-1复合物可引发DPD的转录上调。本发明人运用脆弱拟杆菌制剂灌胃小鼠模型首次发现，小鼠肠道中存在的大量脆弱拟杆菌会使结直肠癌细胞对5-FU治疗敏感性提高，表现为脆弱拟杆菌制剂试验组小鼠相比于对照组小鼠在结直肠癌造模后对同等剂量的5-FU治疗缓解效果更为明显。本发明还发现脆弱拟杆菌制剂试验组小鼠的DPD表达量明显降低，并且找到此调控机制主要为脆弱拟杆菌分泌代谢物丁酸与肿瘤细胞自分泌产生的S1P结合，通过丁酸化反应生成丁酸-S1P，作为偏向性配体的丁酸-S1P结构可以抑制下游S1PR2-β-arrestin-1复合物的形成，引发DPD的转录下调，最终导致结直肠肿瘤组织胞内5-FU含量升高而引发耐药逆转。以上内容说明脆弱拟杆菌或是解决5-FU耐药问题的有效方法。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种治疗消化系统癌症的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含氟尿嘧啶类药物和拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质，其中所述拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述氟尿嘧啶类药物选自以下的一种或多种：5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、氟尿苷或脱氧氟尿苷，所述氟尿嘧啶类药物在体内均转化为5-氟尿嘧啶；所述拟杆菌属肠道菌选自以下的一种或多种：粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、化脓拟杆菌(Bacteroidespyogenes)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、普通拟杆菌(Bacteroideswdgatus)、卵圆拟杆菌(Bacteroides ovatus)、便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述拟杆菌属肠道菌选自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，所述拟杆菌属肠道菌的代谢相关物质选自丁酸-S1P。
4.一种治疗消化系统癌症的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂包含权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，以及药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂为口服制剂，优选地，口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。
6.权利要求1至3中任一项所述的药物组合物或者权利要求4或权利要求5中任一项所述的药物制剂在制备治疗消化系统癌症的药物中的应用，其特征在于：所述拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述消化系统癌症选自以下的一种或多种：食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌。
8.拟杆菌属肠道菌或其代谢相关物质在制备逆转消化系统癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其特征在于：所述消化系统癌症选自以下的一种或多种：食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌；所述氟尿嘧啶类药物选自以下的一种或多种：5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、氟尿苷或脱氧氟尿苷，所述氟尿嘧啶类药物在体内均转化为5-氟尿嘧啶；所述拟杆菌属肠道菌选自以下的一种或多种：粪拟杆菌(Bacteroidescaccae)、吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、化脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、普通拟杆菌(Bacteroideswdgatus)、卵圆拟杆菌(Bacteroidesovatus)、便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)或单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。
10.权利要求8或权利要求9所述的用途，其特征在于：所述拟杆菌属肠道菌选自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，所述拟杆菌属肠道菌的代谢相关物质选自丁酸-S1P。
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