CN114026993A

CN114026993A - 一种快速评价藜麦穗发芽抗性的方法

Info

Publication number: CN114026993A
Application number: CN202111345333.4A
Authority: CN
Inventors: 殷辉; 赵晓军; 陈亚蕾; 周建涛; 任璐; 秦楠; 吕红
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-11-15
Also published as: CN114026993B

Abstract

本发明公开了一种快速评价藜麦穗发芽抗性的方法，包括如下步骤：制备籽粒萌发培养基、制备水活度不同的培养基、采集成熟藜麦穗、籽粒发芽试验、籽粒发芽测定、抗性评价。本发明的穗发芽抗性综合指数（RI）加权了藜麦籽粒在不同水活度情况下发芽率能更为客观的反应藜麦品种对穗发芽的抗性，具有结果精准、省时省力，重复性好、稳定可靠等特点。

Description

一种快速评价藜麦穗发芽抗性的方法

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种快速评价藜麦穗发芽抗性的方法。

背景技术

近年来，藜麦风靡全球。基于其应对气候变化、维护粮食安全及营养特性优异等潜力，联合国宣布2013年为国际藜麦年。目前，全球种植藜麦的国家约90个，遍布世界各大洲。藜麦产业在我国的发展势头强劲，已经成为小杂粮作物的后起之秀，主要种植省份有甘肃、内蒙古、山西、云南、青海、河北等。预计到2025年，国内藜麦消费需求将超10万吨，藜麦也势必会成为重要得粮食作物。随着种植面积的扩大，藜麦穗发芽日趋严重，严重影响着藜麦产业的发展。研究发现，由于藜麦籽粒小（千粒重约2.5～4.5 g），胚芽十分发达、种皮薄且易溶于水，籽粒成熟后，遇雨极易发芽。2019-2021年调研发现，藜麦穗发芽是一种普遍现象，特别是在收获季节遇到阴雨天气，严重的地块穗发芽率达到75％~90%。穗发芽严重影响产量和品质，造成藜麦的收储困难以及商品藜麦的价格下降。藜麦种植区收获季节的气候属于不可控制因素，种植穗发芽抗性品种是防治穗发芽的根本措施。如何快速鉴定优质抗穗发芽的藜麦种质资源是当前藜麦工作者关注的焦点之一。因此精准鉴定、系统理清穗发芽抗性持续期长的藜麦品种不仅十分必要，而且极为迫切。

目前鉴定藜麦穗发芽抗性的方法主要有田间延期收获法、整穗发芽法、籽粒发芽法等，然而这些方法存在的问题主要有：（1）田间延期收获法和整穗发芽法由于藜麦植株高大、穗型巨大（达到1.5 m~2.0 m品种比比皆是），实际操作中都有局限性，很难精准控制实验的精度、数据重复性低。（2）传统整穗发芽法和籽粒发芽法，每次只能做一个湿度梯度，不能模拟不同的湿度梯度；加之试验期间容易腐烂、滋生杂菌，为整个实验带来很多不确定因素。（3）传统评价是将藜麦整体放入人工气候培养箱，然而绝大多数人工气候培养箱的湿度误差较大，导致抗病性鉴定不准确。（4）自然界中穗发芽是一个动态的过程，环境中能被藜麦籽粒利用的自由水是动态的，而不是一层不变。然而，传统评价方法v是将环境中自由水固定在一个值进行评价，不能精准评价藜麦籽粒对环境可中利用自由水的敏感性，湿度很难精准控制、结果重现性低。因此，如何精准控制藜麦籽粒可利用的自由水对于鉴定穗发芽抗性至关重要。鉴于上述缺陷，亟待研发一种结果精准、时间短、稳定可靠的评价藜麦穗发芽抗性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速评价藜麦穗发芽抗性的方法，以解决背景技术中提出的问题。为实现上述目的，本发明公开的技术方案如下：

本发明的快速评价藜麦穗发芽抗性的方法，具体步骤为：

（1）制备籽粒萌发培养基：每1 L的蒸馏水中加入2%~5%质量的藜麦籽粒壳，熬煮25~30 min，然后过滤取上清液，在上清液中加14~17 g琼脂加热溶解，分装于三角瓶，121℃高压灭菌15~20 min，冷却后在0~4℃下冷藏，备用。

（2）制备水活度不同的培养基：将步骤（1）准备好的籽粒萌发培养基加热融化、再冷却至40~50℃时，取100 ml培养基装于200-500ml的无菌三角瓶，重复6次，再在6个三角瓶中分别添加0、14.3、19.3、21.8、29.3和34.3 ml的甘油，趁热充分搅拌混匀，制成水活度分别为1.00、0.98、0.96、094、0.92、0.90的六种不同水活度的培养基，将配置好的培养基趁热倒入直径90 mm的培养皿中，每个培养皿倒8~12 mL，每个水活度重复3~5次。

（3）采集成熟藜麦穗：随机抽取成熟度一致的每个藜麦品种的5~8个单株藜麦主穗，完整剥出藜麦籽粒，尤其不能损坏籽粒壳，每个主穗选取籽粒400-500 粒，取的藜麦籽粒大小、重量尽可能一致，然后将藜麦籽粒浸泡于75%的乙醇10 ~15 s，再无菌水清洗5~7次，用无菌滤纸吸干藜麦籽粒表面残留的无菌水，备用。

（4）籽粒发芽试验：将步骤（3）处理后的藜麦籽粒放分别置于步骤（2）制备的六种水活度培养基，每皿放60~80粒，每个水活度重复3~5次，用封口膜将培养皿封好，将其置于25℃的培养箱中避光培养48~72 h。

（5）籽粒发芽测定：籽粒发芽试验后，以芽长达到种子长度一半为发芽标准，分别统计不同水活度培养基上发芽的籽粒数，计算不同水活度培养基上的发芽率：

发芽率 =（同一水活度培养基发芽的总籽粒数/总籽粒数）×100%。

（6）抗性评价：采用穗发芽抗性综合指数（RI）评估穗发芽抗性，穗发芽抗性综合指数（RI）是一个0.0~1.0的数字。

穗发芽抗性综合指数：

其中：Ci =1~6，Ci表示不同水活度的籽粒萌发培养基的级别，分别是：水活度为0.90时，籽粒萌发培养基级别为C1级；水活度为0.92时，籽粒萌发培养基级别为C2级；水活度为0.94时，籽粒萌发培养基级别为C3级；水活度为0.96时，籽粒萌发培养基级别为C4级；水活度为0.98时，籽粒萌发培养基级别为C5级；水活度为1.00时，籽粒萌发培养基级别为C6级。

Fi为第Ci级水活度培养基相应的发芽率(%)。

依据穗发芽抗性综合指数（RI）确定藜麦品种对穗发芽的抗性，分别是：（1）抗性综合指数（RI）=0时为免疫，抗性综合指数 0＜RI≤0.1时为高抗，抗性综合指数 0.1＜RI≤0.15时为中抗，抗性综合指数 0.15＜RI≤0.3时为低抗，抗性综合指数 0.3＜RI≤0.5时为低感，抗性综合指数 0.5＜RI≤0.8时为中感，抗性综合指数 0.8＜RI时为高感。

本发明具有以下有益效果:

1、穗发芽通常是雨后2~3天内严重发生，然而雨后48~72 h 藜麦穗籽粒环境中可利用的自由水是动态的。传统的整穗发芽法是在一个恒定的环境中评估，使其结果有其局限性。在自然界，藜麦穗发芽是一个动态过程，环境中可利用的自由水在动态变化，不同部位的籽粒所处的湿度环境的不一样，造成的穗发芽也是不同的，如果使用同一个标准去衡量存在误差，不能客观反应事物的本质。因此，本发明采用穗发芽抗性综合指数（RI）评估穗发芽抗性，穗发芽抗性综合指数（RI）加权了藜麦籽粒在不同水活度情况下发芽率（充分模拟了自然界中动态变化的自由水），能更为客观的反应藜麦品种对穗发芽的抗性。

2、对于一些植株高大、穗型巨大（达到1.5 m~2.0 m品种比比皆是），实际操作中整穗发芽法都有局限性，加之很难精准控制实验的精度、数据重复性低。而本发明通过不同水活度培养基上鉴定籽粒发芽，能达到准确评价种质资源穗发芽抗性的目的，数据更科学、重复性更高。

3、本发明适用于在数量庞大的种质资源中快速筛选鉴定抗穗发芽品种，省时省力，且能避免人为误差。

4、由于藜麦单株穗型巨大，籽粒繁多，使用传统穗发芽抗性评价法（田间延期收获法、整穗发芽法），统计量局大、准确性差。本发明精准控制藜麦籽粒数量和规模，数据准确、重复性高，更能准确反应其田间抗性。

5、本发明采用在培养基中添加甘油，甘油将培养基中自由水附着，使被附着的水无法被藜麦籽粒利用。设置了不同的系列水活度，充分模拟了藜麦成熟期自然界中动态变化的自由水，将自由水的值精确至小数点后2位，重复性好、精度高。

6、藜麦籽粒小（千粒重约2.5～4.5 g），胚芽十分发达、种皮薄且易溶于水，传统整穗评估不同处理之间发芽率差异不显著，不能准确揭示环境中自由水对穗发芽的影响。本发明可精确控制藜麦籽粒环境中可利用自由水，不同处理之间穗发芽抗性综合指数（RI）差异显著、能准确评估其抗性。

7、相比同类方法，本发明采用手工剥出藜麦籽粒，但不要破坏籽粒表面的壳，将其置于藜麦籽粒壳营养液做的培养基，更接近藜麦籽粒在田间的生长环境，评估更准确。

实施例1

利用本发明方法评价藜麦品系407的穗发芽抗性，步骤如下：

（1）制备籽粒萌发培养基：称取20 g藜麦籽粒壳加蒸馏水1 L熬煮30 min，然后过滤取上清液，在上清液中加15 g琼脂加热溶解，溶解后定容至1 L，分装于三角瓶，121℃高压灭菌15 min、冷却后冷藏（4℃）备用。

（2）制备水活度不同的培养基：将步骤（1）准备好的籽粒萌发培养基加热融化、再冷却至40~50℃时，取100 ml培养基装于500ml的无菌三角瓶，重复6次，再在6个三角瓶中分别添加0、14.3、19.3、21.8、29.3和34.3 ml的甘油，趁热充分搅拌混匀，制成水活度分别为1.00、0.98、0.96、094、0.92、0.90的六种不同水活度的培养基，配制完成后，所有培养基的水活度使用水活度仪（Pawkit meter，Decagon）测量校正；不准确的重新配制，将配置好的培养基趁热倒入直径90 mm的培养皿中，每个培养皿倒8~10 mL，每个水活度重复5次，共30个培养皿。

（3）采集成熟藜麦穗：随机抽取成熟度一致的藜麦品系407的5个单株藜麦主穗，完整剥出藜麦籽粒，尤其不能损坏籽粒壳，每个主穗选取籽粒500粒，取的藜麦籽粒大小、重量尽可能一致，然后将藜麦籽粒浸泡于75%的乙醇15 s，再无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干藜麦籽粒表面残留的无菌水，备用。

（4）籽粒发芽试验：将步骤（3）处理后的藜麦籽粒以每皿放60粒标准分别置于步骤（2）制备的30个培养皿中，用封口膜将培养皿封好，将其置于25℃的培养箱中避光培养72h。

（5）籽粒发芽测定：籽粒发芽试验后，以芽长达到种子长度一半为发芽标准，分别统计不同水活度培养基上发芽的籽粒数，计算不同水活度培养基上的发芽率：发芽率 =（同一水活度培养基发芽的总籽粒数/总籽粒数）×100%。统计结果见表1。

（6）抗性评价：采用穗发芽抗性综合指数（RI）评估穗发芽抗性，穗发芽抗性综合指数计算公式：

其中Ci =1~6，Ci表示不同水活度的籽粒萌发培养基的级别；Fi为第Ci级水活度培养基相应的发芽率(%)。

试验计算结果是品系407的RI值为0.76，表明该品种对穗发芽抗性为中感品种。

实施例2

利用本发明方法评价和比较藜麦品系103、317和326三个藜麦品种的穗发芽抗性。步骤如下：

（1）制备籽粒萌发培养基：同实施例1。

（2）制备水活度不同的培养基：方法同实施例，但重复三次，共90个培养皿。

（3）采集成熟藜麦穗：随机抽取成熟度一致的藜麦品系103、品系317、品系326三个品种的各5个单株藜麦主穗，其他同实施例1。

（4）籽粒发芽试验：同实施例1，三个品种重复三次。

（5）籽粒发芽测定：统计结果见表2。

试验计算结果是品系103的RI值为0.47，表明该品种对穗发芽的抗性为低感品种；品系317的RI值为0.86，表明该品种对穗发芽的抗性为高感品种；品系326的RI值为0.62，表明该品种对穗发芽的抗性为中感品种；仅就藜麦品种对穗发芽的抗性而言，品系103优于品系326，品系317最差。

Claims

1.一种快速评价藜麦穗发芽抗性的方法，具体步骤为：

（1）制备籽粒萌发培养基：每1 L的蒸馏水中加入2%~5%质量的藜麦籽粒壳，熬煮25~30min，然后过滤取上清液，在上清液中加14~17 g琼脂加热溶解，分装于三角瓶，121℃高压灭菌15~20 min，冷却后在0~4℃下冷藏，备用；

（2）制备水活度不同的培养基：将步骤（1）准备好的籽粒萌发培养基加热融化、再冷却至40~50℃时，取100 ml培养基装于200-500ml的无菌三角瓶，重复6次，再在6个三角瓶中分别添加0、14.3、19.3、21.8、29.3和34.3 ml的甘油，趁热充分搅拌混匀，制成水活度分别为1.00、0.98、0.96、094、0.92、0.90的六种不同水活度的培养基，将配置好的培养基趁热倒入直径90 mm的培养皿中，每个培养皿倒8~12 mL，每个水活度重复3~5次；

（3）采集成熟藜麦穗：随机抽取成熟度一致的每个藜麦品种的5~8个单株藜麦主穗，完整剥出藜麦籽粒，尤其不能损坏籽粒壳，每个主穗选取籽粒400-500 粒，取的藜麦籽粒大小、重量尽可能一致，然后将藜麦籽粒浸泡于75%的乙醇10 ~15 s，再无菌水清洗5~7次，用无菌滤纸吸干藜麦籽粒表面残留的无菌水，备用；

（4）籽粒发芽试验：将步骤（3）处理后的藜麦籽粒放分别置于步骤（2）制备的六种水活度培养基，每皿放60~80粒，每个水活度重复3~5次，用封口膜将培养皿封好，将其置于25℃的培养箱中避光培养48~72 h；

发芽率 =（同一水活度培养基发芽的总籽粒数/总籽粒数）×100%；

（6）抗性评价：采用穗发芽抗性综合指数（RI）评估穗发芽抗性，穗发芽抗性综合指数（RI）是一个0.0~1.0的数字；

穗发芽抗性综合指数：

其中：Ci =1~6，Ci表示不同水活度的籽粒萌发培养基的级别，分别是：水活度为0.90时，籽粒萌发培养基级别为C1级；水活度为0.92时，籽粒萌发培养基级别为C2级；水活度为0.94时，籽粒萌发培养基级别为C3级；水活度为0.96时，籽粒萌发培养基级别为C4级；水活度为0.98时，籽粒萌发培养基级别为C5级；水活度为1.00时，籽粒萌发培养基级别为C6级；

Fi为第Ci级水活度培养基相应的发芽率(%)；