CN114015762A - 强直性脊柱炎诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

强直性脊柱炎诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于强直性脊柱炎治疗诊断的试剂盒及其应用，所述的试剂盒用于对受试者体液、细胞和/或组织内抗CCP抗体、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA‑B27的表达量、和/或蛋白质标记物对应的抗体、和/或蛋白质标记物对应的mRNA的qPCR引物和/或探针进行检测。本发明所选标志物皆有较好的敏感性和特异性。本发明所选的标志物可采用常规的ELISA试剂进行检测，便于临床应用。本发明所选的标志物，联合检测的情况下可以达到更好的敏感性和特异性。

Description

强直性脊柱炎诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种强直性脊柱炎诊断试剂盒及其应用。
背景技术
AS在我国的发病率约为0.26％。发病者多见于青少年，主要累及骶骼关节、脊柱、脊柱软组织及四肢关节，主要症状是腰、骶及下肢关节疼痛，僵直不适等[13]。在起病10年内即可出现严重的关节功能障碍。当脊柱、骶髂关节和髋关节发生强直性病变后，病情即不可逆转。AS可严重影响患者的身心健康和生活质量，目前国内外尚缺乏特效的药物治疗，深入对AS的发病机制研究是改善治疗效果的关键。家系分析提示：在HLA-B27阳性的AS 患者一级亲属中，HLA-B27阳性者占31.1％，其危险性高出正常家庭对照组的10.8倍。 HLA-27是目前发现和AS关联性最强的基因，在AS易感性中的作用约为16％。流行病学调查显示中国人HLA-B27阳性率在AS患者高达85.5％～95％，而正常群体中仅为2-6％[13, 14]。目前已在AS患者检测到多种B27的亚型包括：B*2701、B*2702、B*2703、B*2704、 B*2707和B*2710等几十中等位基因。有文献报道，欧美人AS患者与B*2705、B*2702有关，亚洲人种AS患者与B*2705、B*2704、B*2707有关，B*2703仅见于西非AS患者[15, 16]。B*2704为中国汉族人群的最优势的等位基因，亦与AS呈强相关。目前比较肯定的易感基因有B*2705、B*2704、B*2702，而B*2701和B*2710与AS的关系需进一步证实。有文献报道B*2703和B*2707与AS呈负相关[17]。B*2706被认为是一种保护性基因，该亚型在泰国人群中显示出极大的保护基因，在新加坡华人中也呈保护性，研究AS相关和不相关B27亚型的差异，有助于了解HLA-B27在AS发病机制中的实际作用。在AS的诊断中， HLA-B27检测对有效提高AS诊断及鉴别诊断的可靠性具有重要的辅助诊断价值[18]，但是还有10％的AS患者HLA-B27阴性，使这部分AS的诊断困难增加。发现优于B27且与 AS强关联的遗传标志，也是目前研究的重点。
HLA-B27是具有高度多态性的人类白细胞抗原B座位上的一个等位基因，它是AS的临床诊断依据之一。1973年Brewerton和Schlosstein分别证实HLA-B27阳性与强直性脊柱炎AS有强相关性。这是目前唯一有临床价值的血型相关抗原。这在迄今已知的HLA与疾病具有最强和最典型的关联。HLA-B27基因是HLA-I类分子B位点上的等位基因，相对分子量约56kda，位于人的第六号染色体的短臂上(6P)，由6个外显子和7个内含子组成，编码分子量为44×103的糖蛋白。HLA-B27等位基因呈多态性，它们之间仅是一个或数个氨基酸的差别，且主要集中在αl、α2结构区内。到2002年WHO正式命名的HLA-B27等位基因达到了24个，即B*2701-B*2725，其中不包括B*2722等位基因在内(研究表明，B*2722 与B*2706亚型具有相同的基因序列，因此在2002年4月B*2722作为一个正式的WHO等位基因被删除，以致在B*2701到B*2725这一组等位基因中出现了裂孔现象)。目前被正式命名的就有75多个(2701、2721、2723～2736)[20]，各亚型氨基酸的改变主要集中发生在 11个位点上，编码20多种蛋白产物。大量的研究资料表明B27基因具有复杂的多态性和区域性，AS的患病率各地报道的结果不大相同，患者与人群对比的研究，提示HLA-B27抗原的频率随不同地区、不同种族而有差异。B*2705在人群中广泛分布，B*2702主要分布在欧美人中，B*2704常见于东方人，B*2707发现分布在印度和东南亚人群中，这些基因亚型都与AS相关。亚洲人与B2705、B*2704、B*2706、B*2707相关，其中B*2704约占45％。在中国汉族正常人群中，B2704和B2705构成了B27的优势亚型，尤以B*2704分布最为广泛，频率最高，占54.8％，且与AS成强相关[21]；B2705占41.1％。B*2706在AS阳性病人已在中国发现；与其他亚型相比，B2706和B2709被认为与AS相关性差或具有保护作用 [22]；但因在人群中的频率低，所以这种非相关性不是绝对的，因而B*2706、B*2709与AS 关系有待进一步研究。B*2707在亚洲人群(印度、中国、泰国)中可检测到，但出现频率较低。B*2722被证实只存在于东南亚人中，该亚型可能起源于中国的B*2704，随着人群迁徙至东亚和南亚。我国少年强直性脊柱炎人群的HLA-B27基因亚型主要由B*2702、B*2704、 B*2705组成。其它基因亚型可能是被检出后由于出现频率低等原因而少见报道。
对于16～25岁青年，尤其是青年男性。强直性脊柱炎一般起病比较隐匿，早期可无任何临床症状，有些病人在早期可表现出轻度的全身症状，如乏力、消瘦、长期或间断低热、厌食、轻度贫血等。由于病情较轻，病人大多不能早期发现，致使病情延误，失去最佳治疗时机。目前临床上用于强直性脊柱炎诊断、治疗跟踪的常用蛋白质标志物为血沉(ESR)、C- 反应蛋白(CRP)两项炎症指标。然而ESR和CRP是临床实践和试验中十分常用的疾病活动度标志物，敏感度和特异度都较低，且不能全面反映强直性脊柱炎的疾病进程。此外，仅 40-50％强直性脊柱炎患者的CRP或ESR水平是升高的，ESR或CRP水平正常并不能排除 AS活动状态。除了CRP、ESR以外，已有多项研究报道了与强直性脊柱炎疾病活动度有关的生物标志物，如IL-6、IL-17、MMP3、OPG等，但这些标志物存在临床检测困难、与治疗反应无关等缺陷。另外强直性脊柱炎是一个多因素参与的复杂疾病，单个标志物检测未必能很好反映疾病治疗状况，因此，亟需寻找新的可用于早期诊断、治疗跟踪的标志物。
发明内容
本发明是为了解决上述不足，提供了一种检测强直性脊柱炎的试剂盒及其应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及一种用于强直性脊柱炎治疗跟踪与监测的试剂盒，所述的试剂盒用于对受试者体液、细胞和/或组织内抗CCP抗体、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA-B27的表达量、和/或蛋白质标记物对应的抗体、和/或蛋白质标记物对应的mRNA的qPCR引物和/或探针进行检测。
抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP抗体)是以合成的环化瓜氨酸多肽(CCP)为抗原的自身抗体，对类风湿关节炎(RA)具有较高的敏感性和特异性，是RA早期诊断的一个高度特异指标，但现有技术没有将其与HLA-B27联合用于诊断强直性脊柱炎的报道。临床多采用酶联免疫吸附法检测(ELISA)。
在本发明的一个优选实施方式中，所述体液和组织包括外周血、血清、血浆、关节滑液、尿液、泪液、外周血单个核细胞、淋巴细胞、成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞、韧带组织、肌腱组织、骨组织、肌肉组织和/或脂肪组织。
在本发明的一个优选实施方式中，试剂盒采用的检测方法为微流孔、illumina、化学发光法、ELISA、荧光定量PCR、芯片或磁珠法、微流控芯片、化学发光法、ELISA、荧光定量PCR。
本发明另一方面涉及抗CCP抗体、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA-B27联合用于制备诊断强直性脊柱炎的诊断试剂盒的用途。
在本发明的一个优选实施方式中，所述诊断试剂盒中含有分别用于测定抗CCP抗体、I 型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA-B27的ELISA试剂。
有益效果
本发明所选标志物皆有较好的敏感性和特异性。本发明所选的标志物可采用常规的 ELISA试剂进行检测，便于临床应用。本发明所选的标志物，联合检测的情况下可以达到更好的敏感性和特异性。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例
(1)样本收集和提取
强直性脊柱炎患者均来自温州医科大学附属第一医院，采集AS患者(40例)和HLA-B27 检测阳性但是无AS症状的正常对照(40例)的全血标本,室温放置小时内3000g离心5分钟,吸取上清液转移至无菌EP管，分装后于-80℃保存至检测前。
强直性脊柱炎患者与健康受试者的入组标准如下：
强直性脊柱炎患者：根据1984年美国纽约修订标准符合放射学标准和l项以上临床标准，可诊断为强直性脊柱炎：1、临床标准：①腰痛、僵3个月以上，活动改善，休息无改善；②腰椎额状面和矢状面活动受限；③胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人；2、放射学标准(1966年AS纽约标准)：①0级：正常；②Ⅰ级：可疑变化；③Ⅱ级：轻度异常，可见局限性侵蚀、硬化，但无关节间隙的改变；④Ⅲ级：明显异常，为中度或进展性骶髂关节炎，伴有以下1项或1项以上改变(侵蚀、硬化、关节间隙增宽或狭窄，或部分强直)；⑤Ⅳ级：严重异常，完全性关节强直；放射学标准为双侧骶髂关节炎≥2级或单侧骶髂关节炎 3～4级。每名患者至少患有6个月强直性脊柱炎，未接受过任何形式的物理或医学治疗，无其他疾病。
健康人受试者：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病。无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内。
(2)主要实验试剂和实验方法：
抗CCP抗体检测试剂盒由上海中南富纯生物技术有限公司替公司，采用ELISA方法严格按照使用说明书操作。结果判断采用标准曲线：将CCP IgG强阳性标准品用样品稀释液作倍比稀释(其浓度分别为1600/400/200/50U)，加上弱阳性标准品(浓度25U)和试剂空白(样品稀释液)绘制标准曲线，样品吸光度值(OD)值通过标准曲线计算出相应的抗体浓度，＜25U为阴性，≥25U为阳性。
I型胶原交联氨基末端肽(NTx)检测使用上海丰翔生物公司的试剂盒，应用ELISA方法检测血清中I型胶原交联氨基末端肽的水平，小于200ug/L为阳性，≥200ug/L为阳性，
HLA-B27检测试剂盒来自于美国贝克曼库尔特有限公司，按照说明书操作，并按照说明书记载的标准判断阳性或阴性。
(3)实验结果
1、目标蛋白在强直性脊柱炎患者与健康受试者血清中的丰度差异
训练集中，与健康受试者比，强直性脊柱炎患者血清抗CCP抗体与I型胶原交联氨基末端肽(NTx)的绝对含量上调，测定结果如下表所示。
组别 抗CCP抗体(U) I型胶原交联氨基末端肽(NTx)(ug/L)
强直性脊柱炎患者 56.3±8.9 370±45
HLA-B27阳性健康受试者 12.6±6.5 135±36
2、抗CCP抗体和I型胶原交联氨基末端肽(NTx)与HLA-B27配合的灵敏度和特异性
表2目标蛋白单独诊断区分健康受试者和强直性脊柱炎患者灵敏度和特异性
Figure RE-GDA0003453181780000051
上述实验结果表明抗CCP抗体和I型胶原交联氨基末端肽与HLA-B27P联合用于诊断强直性脊柱炎时，准确度比HLA-B27独立诊断强直性脊柱炎的准确度显著提高，高达95.0％，取得了出人意料的效果。因此，可以将抗CCP抗体和I型胶原交联氨基末端肽与HLA-B27P联合用于制成诊断强直性脊柱炎的试剂盒，该试剂盒中包括用于测定抗CCP抗体和I型胶原交联氨基末端肽与HLA-B27P含量的ELISA试剂。
因此，可以将抗CCP抗体和I型胶原交联氨基末端肽与HLA-B27P联合用于制成诊断强直性脊柱炎的试剂盒，该试剂盒中包括分别用于测定血清中抗CCP抗体和I型胶原交联氨基末端肽与HLA-B27P含量的ELISA试剂。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (5)

1.一种用于强直性脊柱炎治疗跟踪与监测的试剂盒，所述的试剂盒用于对受试者体液、细胞和/或组织内抗CCP抗体、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA-B27的表达量、和/或蛋白质标记物对应的抗体、和/或蛋白质标记物对应的mRNA的qPCR引物和/或探针进行检测。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述体液和组织包括外周血、血清、血浆、关节滑液、尿液、泪液、外周血单个核细胞、淋巴细胞、成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞、韧带组织、肌腱组织、骨组织、肌肉组织和/或脂肪组织。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，试剂盒采用的检测方法为微流孔、illumina、化学发光法、ELISA、荧光定量PCR、芯片或磁珠法、微流控芯片、化学发光法、ELISA、荧光定量PCR。
4.抗CCP抗体、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA-B27联合用于制备诊断强直性脊柱炎的诊断试剂盒的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，所述诊断试剂盒中含有分别用于测定抗CCP抗体、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及HLA-B27的ELISA试剂。
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