CN114015747A - 检测hla公共表位的通用方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种直接检测HLA公共表位的通用方法,操作简便,无须做HLA基因分型,可检测HLA‑I类和HLA‑II类所有抗原的公共表位。验证试验表明,根据本发明制备的试剂盒的检测准确率为100%,为快速寻找HLA公共表位匹配的实体器官移植供者和血小板输注供者提供了一个有效工具。
Description
技术领域
本发明提供一种检测人类白细胞抗原HLA公共表位的通用检测方法,属于生物医学临床分子检测领域。
背景技术
在肾脏等实体器官移植和血小板输注前,需要对供者和患者做人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)基因分型,以便选择和患者HLA基因匹配的供者。由于HLA系统的高度遗传多态性,一般需要在数万乃至数十万供者中才能找到1例HLA匹配的供者,成为临床治疗中的主要障碍。最近发现选择HLA表位匹配的供者,可以达到和HLA基因匹配供者等同的效果,被认为是里程碑式的突破。由于HLA表位数量远远低于HLA基因数量,因此在数百例供者中就有可能找到HLA匹配的供者(表1)。HLA表位匹配为需要器官移植和血小板输注的患者开辟了一条新的康庄大道。
表1目前已经检测出来的HLA等位基因和HLA表位数量
HLA位点 | A、B、C | DRB1 | DQB1 | DPB1 |
等位基因数 | 21354 | 3701 | 1997 | 1749 |
抗体定义的表位数 | 72 | 36 | 27 | 11 |
HLA是人体免疫系统识别“自身”和“非自身”的遗传多态性标记。HLA抗原是由258~366个氨基酸所组成的蛋白质分子,其中与抗体分子结合的氨基酸组合被称为表位,它又被分为私人表位和公共表位两大类。目前检测HLA公共表位的方法一般需要先对受检者做HLA基因分型(HLA genotyping),然后转换成HLA抗原表型,再借助计算机软件指定HLA公共表位。HLA基因分型需要检测目前已知的2万8千多个HLA等位基因,费时费力,费用昂贵。因此创建一个简易快速、可以直接检测HLA表位的方法成为目前国内外的热点课题。
发明内容
本发明首次建立了一种简便快速、使用DNA样品直接检测HLA公共表位的分型技术,避免了费时费力、价格昂贵的HLA基因分型操作过程。
本发明的技术原理如下:HLA抗原表位是由HLA抗原蛋白分子氨基酸链上特定位置的氨基酸组合而成。这些氨基酸在结构上可以是连续排列(Triple表位),也可以是非连续排列(Eplet表位)。编码这些氨基酸的核苷酸序列被称为表位靶标序列(Epitop TargetSequence,简称ETS),选择与ETS紧密连锁的、HLA抗原特异性单核苷酸多态性(Antigen-Specific Single Nucleotide Polymorphism,简称AS-SNP)位点,通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)特异性扩增含有ETS的核苷酸片段,根据是否产生PCR扩增产物来判断相应的HLA公共表位。
目前使用抗体定义的HLA-I类表位数量为72个,HLA-II类表位74个。这些表位的免疫原性各不相同,大约50%左右的HLA-I类表位的ElliPro评分大于0.5。本发明可以检测如下使用抗体定义的HLA表位:
(1)HLA-ABC位点表位:21H,41T,44KM,44RMA,44RT,45KE,56R,62EE,62GE,62GK,62GRN,62LQ,62QE,62RR,65GK,65QIA,65QKR,65RNA,69AA,69TNT,70IAQ,71ATD,71SA,71TTS,73AN,73TVS,76ANT,76EG,76ESI,76ESN,76VRN,79GT,80I,80K,80N,80TLR,82LR,90D,107W,127K,131S,138K,138MI,143S,144K,144KR,144QL,144TKH,145KHA,145RT,149TAH,150AAH,151AHA,156DA,158T,161D,163EW,163LS/G,163LW,163R,163RG,163RW,166DG,173K,177KT,180E,193PL,193PV,219W,248M,253Q,267QE;
(2)HLA-DR位点表位:4Q,4R,11STS,13FE,16Y,25Q,25R,30C,30RV,37L,37YV,47F,48Q,51R,57DE,57S,57V,67LQ,70D,70DA,70QT,70R,73A,74R,77N,77T,96EV,96HK,96Y,98E,98ES,98Q,104A,108T,142M,181M;
(3)HLA-DQ位点表位:45EV,45GV,46VY,52LL,52PQ,55PP,55R,56L,57V,74S,77R,77T,84QL,87F;
(4)HLA-DP位点表位:35FV,56A,56E,56EE,57D,69E,84DEAV,85GPM,96K,50Q,50R;
(5)HLA-II类位点表位:rq26Y,rp37FV,rqp37YA,rq37YV,rqp57A,rqp57D,rq57S,rq57V,rp58E,rp58EE,rp67IE,qp67IE,rqp67IK,rp67LK,rp67LR,rq70RK/R,rq74AV,rq75VT,qp77RV,rq77TV,rq140TV;
在本发明中,使用如下引物(表2)。
表2.SNP特异性寡核苷酸引物和内对照寡核苷酸引物序列一览表
注解:F代表正向引物,R代表反向引物。
有益效果:本发明在国内外首次建立了一种直接检测HLA-I类抗原表位、HLA-II类抗原表位以及HLA-DR,-DQ,-DP位点之间表位的新技术,无需做操作复杂、价格贵昂的HLA基因分型,极大提高了在实体器官移植和血小板输注中找到HLA表位匹配供者的机会,使更多患者受益,具有广阔的应用前景。
附图说明
附图提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是实施例1的HLA表位分型阳性反应电泳图谱;
图2是实施例2的HLA表位分型16个PCR混合液扩增图谱;
图3是实施例3的HLA表位分型阳性反应的电泳图谱;
图4是HLA表位分型技术原理图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种器官移植和血小板输注HLA表位配型方法:
检测HLA抗原表位的PCR扩增混合液的基本组分有SNP特异性寡核苷酸引物、内对照寡核苷酸引物、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和PCR缓冲液。
PCR缓冲液配方:10mM Tris-HC1(pH8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.001%(wt/vol)明胶。
HLA公共表位分型原理
采用PCR-SSP技术,使用SNP序列特异性引物,特异性扩增与SNP位点紧密连锁的编码HLA表位的核苷酸片段。如果采用常规PCR技术,可以使用凝胶电泳检测PCR扩增产物,根据是否产生PCR产物以及PCR产物片段的长度来指定相应公共表位;如果采用荧光PCR技术,可以在PCR反应体系中加入SYBR GreenⅠ等荧光染料,自动记录扩增反应结果;如果采用Taqman荧光定量PCR法,可以在PCR反应体系中加入与扩增片段序列互补的荧光标记探针。以上3种技术的比较见表3。
表3.HLA表位分型PCR扩增混合液及检测PCR产物方法一览表
PCR方法 | 常规PCR | 荧光PCR | Taqman荧光PCR |
正向和反向SNP特异性引物 | + | + | + |
正向和反向内对照引物 | + | + | + |
荧光染料 | - | + | - |
荧光标记探针 | - | - | + |
检测PCR产物方法 | 凝胶电泳 | 自动记录 | 自动记录 |
操作程序
(1)每个样品做13个PCR反应,分别与PCR扩增引物混合液Mix EP1~EP13反应;
(2)在PCR板每管中加入8微升PCR引物混合液;
(3)在每个PCR反应中加入1微升DNA样品(含0.02-0.05微克);
(4)然后加入1微升已稀释的Taq酶(含0.3-0.5单位)。一般市售Taq酶浓度为每微升5单位,使用PCR缓冲液适当稀释后使用。由于不同厂商和不同批号酶活力不尽相同,通过预筛选获得最佳稀释度,稀释范围在1:10到1:20之间。稀释后的酶不宜再用;
(5)根据PCR扩增仪的类型,加一滴石蜡油覆盖PCR反应液,或不必加石蜡油覆盖;
(6)PCR扩增程序:95℃5分钟后依次按以下程序进行30个循环:①95℃30秒:②60℃30秒;③72℃90秒;④72℃延长5分钟;⑤降温至4℃完成PCR扩增;
(7)使用0.5×TBE(或TAE)缓冲液配制浓度为2.5%琼脂糖凝胶,加入溴乙锭或其它染料;
(8)取5微升PCR产物直接点样,使用0.5×TBE(或TAE)缓冲液,100V电泳22~25分钟。采用75V低电压电泳30~35分钟条带分离更为清晰;
(9)在紫外光下拍照记录。
四、结果分析
(1)每管PCR反应都应该产生长度为796bp的内对照扩增片段;
(2)如果无扩增产物,说明PCR扩增失败或是样品DNA降解,需复试验证;
(3)根据凝胶电泳条带的长度,按照表4来指定受检样品携带的HLA表位。
表4.HLA-AB抗原交叉反应组公共表位
五、验证试验
使用国际组织相容性专题讨论会提供的已知HLA型的标准DNA样品做验证试验,结果准确率为100%。其中HLA表位分型阳性反应的电泳图谱如图1所示。
实施例2
荧光PCR HLA-I类抗原公共表位分型试剂盒。该试剂盒适用于荧光PCR扩增仪。
一、试剂盒含有试剂
(1)检测HLA抗原表位的PCR扩增混合液。该混合液基本组分有SNP特异性寡核苷酸引物、内对照寡核苷酸引物、dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和MgCl2。
(2)PCR缓冲液配方:甲酚红钠2.5×10-5g/L、PCR Buffer 71.5%、dNTP 5.7%、甘油4.3%、SYBR GreenⅠ0.01%、灭菌去离子水17.9%。
二、HLA表位分型原理
采用荧光PCR技术,在PCR反应体系中加入SYBR GreenⅠ荧光染料,扩增的双股DNA产物与SYBR GreenⅠ结合,进行实时荧光PCR扩增及熔解曲线反应,当引物序列与待测序列互补时,通过PCR反应将目的片段复制与放大。再通过熔解曲线的荧光信号与温度变化,检测特异性产物在双链解离50%时的温度。
三、操作程序
(1)每个样品做16个PCR反应,分别取2微升PCR扩增引物混合液HLA Mix1-16至96孔板板底。
(2)PCR工作液配制:PCR缓冲液管中加入500微升去离子水,再加入10微升Taq酶(5U/微升),充分混合均匀。
(3)取10微升PCR工作液至PCR扩增引物混合液中。
(4)再向每个PCR反应孔中加入1微升待测DNA样品(浓度:40-70ng/微升)混合。
(5)封膜或滴加一滴石蜡油覆盖PCR反应液。
(6)PCR反应体系见表5。
表5.PCR反应体系和配制
组分名称 | 加量(微升/孔) | 配制16孔用量(微升) |
不同HLA PCR扩增混合液 | 2 | 32 |
PCR工作液 | 10 | 160 |
DNA样品 | 1 | 16 |
总体积 | 13 | 208 |
(7)PCR扩增程序:①96℃3分钟1个循环;②96℃20秒,68℃1分钟5个循环;③96℃20秒,65℃45秒,72℃30秒10个循环;④96℃20秒,62℃45秒,72℃30秒15个循环;(⑤72℃2分钟1个循环。
(8)熔解曲线采集,每秒升温0.4℃,每0.5℃采集1次荧光值,采集范围60-95℃。
四、结果分析
(1)内对照作为成功扩增的质控手段,在对应温度区间出现良好的扩增曲线和熔解曲线,否则该反应孔失败;
(2)阳性判断值:当该孔具有阳性判断值范围的Tm,且波峰的相对高度大于等于1时,判定阳性;
(3)阴性判断值(内对照)的Tm,且不具有阳性判断值时,判定为阴性;
(4)按照表6指定表位。
表6.PCR扩增产物及内参和阳性Tm对照表
PCR混合液 | CREG公共表位 | 内参Tm(℃) | 阳性Tm(℃) |
FL1 | A1C | 76-81 | 83-87 |
FL2 | A1C | 76-81 | 84-87 |
FL3 | A2C | 76-81 | 85-87 |
FL4 | A2C | 76-81 | 85-87 |
FL5 | 10C | 76-81 | 85-88 |
FL6 | 10C | 76-81 | 84-87 |
FL7 | B5C | 76-81 | 83-87 |
FL8 | B5C | 76-81 | 85-87 |
FL9 | B5C | 76-81 | 86-89 |
FL10 | B7C | 76-81 | 85-88 |
FL11 | B7C | 76-81 | 85-88 |
FL12 | B7C | 76-81 | 86-89 |
FL13 | B8C | 76-81 | 83-87 |
FL14 | B8C | 76-81 | 85-88 |
FL15 | B12C | 76-81 | 83-87 |
FL16 | B12C | 76-81 | 84-87 |
五、验证试验
使用国际组织相容性专题讨论会提供的已知HLA型的标准DNA样品做验证试验,结果准确率为100%。其中HLA表位分型阳性反应图谱如图2所示。
实施例3
PCR-SSP HLA-DQ抗原公共表位分型试剂盒,用于器官移植HLA表位配型。该试剂盒适用于一般的PCR扩增仪。
一、试剂盒含有试剂
(1)检测HLA抗原表位的PCR扩增混合液。该混合液基本组分有SNP特异性寡核苷酸引物、内对照寡核苷酸引物、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和PCR缓冲液。
(2)PCR缓冲液配方:10mM Tris-HC1(pH8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.001%(wt/vol)明胶;
二、HLA表位分型原理
采用PCR-SSP技术,使用SNP序列特异性引物,特异性扩增与SNP位点紧密连锁的编码HLA表位的核苷酸片段。如果采用常规PCR技术,可以使用凝胶电泳检测PCR扩增产物,根据是否产生PCR产物以及PCR产物片段的长度来指定相应表位;
三、操作程序
(1)每个样品做6个PCR反应,分别与PCR扩增引物混合液Mix EQ1~EQ6反应;
(2)在PCR板每管中加入8微升PCR引物混合液;
(3)在每个PCR反应中加入1微升DNA样品(含0.02-0.05微克);
(4)然后加入1微升已稀释的Taq酶(含0.3-0.5单位)。一般市售Taq酶浓度为每微升5单位,使用PCR缓冲液适当稀释后使用。由于不同厂商和不同批号酶活力不尽相同,通过预筛选获得最佳稀释度,稀释范围在1:10到1:20之间。稀释后的酶不宜再用;
(5)根据PCR扩增仪的类型,加一滴石蜡油覆盖PCR反应液,或不加石蜡油覆盖;
(6)PCR扩增程序:95℃5分钟后依次按以下程序进行30个循环:①95℃30秒:②60℃30秒;③72℃90秒;④72℃延长5分钟;⑤降温至4℃完成PCR扩增;
(7)使用0.5×TBE(或TAE)缓冲液配制浓度为2.5%琼脂糖凝胶,加入溴乙锭或其它染料;
(8)取5微升PCR产物直接点样,使用0.5×TBE(或TAE)缓冲液,100V电泳22~25分钟。采用75V低电压电泳30~35分钟条带分离更为清晰;
(9)在紫外光下拍照记录。
四、结果分析
(1)每管PCR反应都应该产生长度为429bp的内对照扩增片段;
(2)如果无扩增产物,说明PCR扩增失败或是样品DNA降解,需复试验证;
(3)根据凝胶电泳条带的长度,按照表7来指定受检样品携带的HLA表位。
表7.HLA-DQ抗原表位
PCR混合液 | 产物长度(bp) | 携带表位的HLA抗原 |
EQ1 | 164 | DQ2 |
EQ2 | 207 | DQ4,5 |
EQ3 | 214 | DQ5 |
EQ4 | 184 | DQ2,DQ5,DQ6 |
EQ5 | 190 | DQ7 |
EQ6 | 252 | DQ4,DQ5,DQ6,DQ8,DQ9 |
五、验证试验
使用国际组织相容性专题讨论会提供的已知HLA型的标准DNA样品做验证试验,结果准确率为100%。其中HLA表位分型阳性反应的电泳图谱如图3所示。
HLA-B抗原表位41T由氨基酸序列第45位置上的蛋氨酸(M)和第46位置上的赖氨酸(K)所组成,编码这2个相邻氨基酸的核苷酸序列为ATGGCG(表位靶标序列ETS)。选择2个与ETS紧密连锁的抗原特异性单核苷酸多态性位点SNP c.144C和SNP c.272C,ETS在这2个AS-SNP位点之间,并且与这2个AS-SNP位点保持连锁不平衡。使用一对正向和反向序列特异性引物(Sequence Specific Primmer,SSP),通过PCR反应特异性扩增包含ETS的DNA片段,从而达到检测41T表位的目的,其原理如图4所示。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明原理之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏中济万泰生物医药有限公司
<120> 检测HLA公共表位的通用方法及其应用
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagcaggagg ggccgttcgc 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctctcagctg ctccgggact a 21
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cacagatcta caaggcggcg tac 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctccaacttg cgctgcctgt ac 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctccaacttg cgctgcctgt ac 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgtgttccg gtcccaatcc cgat 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttgtggcagc ttaagtttca gtgc 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gccgctgcac tgtgatcggg act 23
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcctgtggca gcctaactat gc 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccgcgcctgc tccagtcgat g 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tacttccata accaggagct cga 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aggtgtccac cgcggccgac gg 22
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtttcttgga gcaggttacc tgga 24
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgcagtagtt gtccaccgga act 23
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctgtggcag ggtaagtacg t 21
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cccgtagttg tgtctgcagg acg 23
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agtactctac gggtgagtca agct 24
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctgcagtagg tgtccaccat gcgac 25
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gccttcccaa ccattccccc tgg 23
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcacggattt ctgttgtgtt t 21
Claims (8)
1.检测HLA公共表位的通用方法,其特征在于,根据编码HLA抗原公共表位的核苷酸序列以及与该序列紧密连锁的HLA抗原特异性单核苷酸多态性位点,通过聚合酶链反应特异性扩增多态性位点的核苷酸片段,根据是否产生PCR扩增产物来判断相应的HLA公共表位。
2.如权利要求1所述的检测HLA公共表位的通用方法,其特征在于,所述的HLA抗原公共表位为72个HLA-Ⅰ类和74个HLA-Ⅱ类表位以及HLA-DR,-DQ和-DP位点之间的所有类型的公共表位。
3.HLA公共表位检测通用引物组,其特征在于,包括SEQ ID No.1-38所含的19对引物,用于检测HLA-Ⅰ类、HLA-Ⅱ类以及HLA-DR,-DQ和-DP位点之间的公共表位。
4.如权利要求3所述的HLA公共表位检测通用引物组,其特征在于,还包括内参引物对,内参引物对的序列如SEQ ID No.39-40。
5.权利要求3或4所述的引物组在HLA公共表位检测通用方法中的应用。
6.权利要求1或2所述的HLA公共表位检测通用方法,在实体器官移植中选择HLA公共表位匹配的器官供者或在血小板输注中选择HLA公共表位匹配的血小板供者中的应用。
7.权利要求3或4所述的所述的引物组在实体器官移植中选择HLA公共表位匹配的器官供者或在血小板输注中选择HLA公共表位匹配的血小板供者中的应用。
8.HLA公共表位分型检测试剂,其特征在于,包含有权利要求3或4所述的引物组。
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Citations (3)
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WO1994009367A1 (en) * | 1992-10-16 | 1994-04-28 | Sangstat Medical Corporation | Alloantigen enhancement assay |
WO2011030159A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | King's College London | Method using hla epitope determination |
CN110964799A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板表面抗原hpa与hla-ab基因分型的试剂盒 |
-
2021
- 2021-11-23 CN CN202111391009.6A patent/CN114015747A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Title |
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邓晶等: "HLA抗体引起血小板输注无效的探讨", 《广东医学》 * |
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