CN114010759B - 一种具有睡眠改善作用的短肽凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有改善睡眠作用的短肽凝胶及其制备方法和应用，属于生物工程制品领域。其中，所述短肽凝胶由短肽DSIP或其改造短肽DSIP‑M以及凝胶成型剂组成，所述短肽DSIP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述短肽DSIP‑M的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述凝胶成型剂由去离子水、透明质酸和泊洛沙姆组成。本发明中的短肽凝胶剂具有较好的改善睡眠效果，能够减少大鼠自发活动，缩短失眠模型大鼠阈上戊巴比妥钠睡眠潜伏时间、延长睡眠时间；并显著改善睡眠障碍人群的睡眠质量。短肽凝胶剂在使用期间及停用后，所有受试者均无不良症状和皮肤过敏反应，具有较好的安全性。

Description

一种具有睡眠改善作用的短肽凝胶及其制备方法和应用

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2020年12月24日，申请号为202011543398.5，发明名称为“一种具有睡眠改善作用的短肽凝胶及其制备方法”的中国发明专利申请的优先权，上述申请的所有内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物工程制品领域，具体地，涉及一种具有睡眠改善作用的短肽凝胶及其制备方法。

背景技术

公知的，随着现代社会工作生活节奏的加快，巨大的压力导致人们进入亚健康状态，出现入睡困难、失眠以及睡眠结构紊乱等睡眠障碍。睡眠障碍是健康大敌，长期的睡眠障碍会对身体造成多种危害，严重影响生理和身心健康，主要表现为：1、破坏机体免疫力，疾病抵抗力下降；2、引发高血压、心脏病、高血脂；3、记忆力减退，头痛，头昏，耳鸣，神经衰弱等；4、情绪异常、紧张易怒、抑郁、焦虑、工作效率低，严重的还会导致悲观厌世。睡眠障碍作为顽固性疾病，一般需要长期服药。

目前改善睡眠的药物治疗方法多种多样，服用催眠药是许多顽固性失眠患者寻求最多的治疗方法，如安定(地西泮)、舒必利、三唑仑等镇静催眠药物，但这些化学药物的成瘾性和依赖性并不能完全帮助患者治疗失眠，反而会因为使患者无法脱离药物正常睡眠，而造成患者失眠问题的加重；对于中医、针灸治疗在失眠初期有可能起到一定缓解症状效果，但对于顽固性失眠和严重失眠患者，往往疗效欠佳，并不能起到治愈的效果。

近年来，肽类睡眠改善药物，特别是小分子短肽逐渐引起人们的重视。短肽在进入血液循环后能够通过多种作用机制影响中枢神经系统的功能。某些小分子短肽具有较好的生物膜穿透性和稳定性，能够通过血脑屏障进入中枢，产生拟神经肽作用，或者直接作用于神经细胞膜的受体影响包括褪黑素和5-羟色胺在内的神经内分泌和神经递质的合成和代谢，产生稳定情绪和镇静催眠的作用；另外，肽主要由氨基酸组成，小分子短肽在体内代谢分解后，部分氨基酸进入中枢后，也能够影响神经内分泌和神经递质的合成和代谢。尽管小分子短肽对中枢神经系统影响的具体分子机制尚不明确，但越来越多的研究证实小分子短肽确实具有明确的镇静催眠和情绪稳定作用。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采取的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种具有改善睡眠作用的短肽DSIP-M，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。所述短肽DSIP-M为改进的促眠短肽(Delta sleep inducing peptide，DSIP)，具体地，是在DSIP在N端乙酰化并在C端酰胺化。

本发明的第二方面提供本发明第一方面所述的短肽DSIP-M在制备用于改善睡眠的制剂中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述制剂可以是凝胶、液体、半固体等任意类型的制剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述制剂为凝胶。

本发明第三方面提供一种具有改善睡眠作用的短肽凝胶，其由本发明第一方面所述的短肽DSIP-M或氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的短肽DSIP，以及凝胶成型剂组成。

在本发明的一些实施方案中，所述凝胶成型剂由去离子水、透明质酸和泊洛沙姆组成。在本发明的一些优选实施方案中，所述凝胶成型剂中，所述透明质酸的质量分数为0.3～0.5％；所述泊洛沙姆的质量分数为15～25％。在本发明的一些具体实施方案中，所述凝胶成型剂中，所述透明质酸的质量分数为0.3％；所述泊洛沙姆的质量分数为15％。

在本发明的一些实施方案中，所述短肽DSIP-M或所述短肽DSIP与所述凝胶成型剂的比例为1mg～5mg:8～10mL，即1mg:1.6～10mL。

本发明第四方面提供本发明第三方面所述的具有改善睡眠作用的短肽凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1，获得所述短肽DSIP-M或所述短肽DSIP，

S2，获得由去离子水、透明质酸和泊洛沙姆组成的凝胶成型剂，

S3，将所述短肽DSIP-M或所述短肽DSIP以及所述凝胶成型剂分开储存，也可以置于可以随用随混合的容器或者装置中，或者

将所述短肽DSIP-M或所述短肽DSIP添加入所述凝胶成型剂中，边加边搅拌。

在本发明的一些实施方案中，在室温在进行添加并搅拌，搅拌速度控制300～500rpm。

在本发明中，所述促进睡眠是指能够：

(1)减少动物自发活动，

(2)缩短个体睡眠潜伏时间，

(3)延长个体睡眠时间，和/或

(4)提高失眠个体的睡眠质量。

在本发明的一些实施方案中，所述个体为哺乳动物，在本发明的一些优选实施方案如此，所述个体为人。

在本发明的一些实施方案中，所述睡眠质量可以依据任意本领域用来评价睡眠好坏的定性的或定量的标准进行评价。

本发明的有益效果

本发明的短肽DSIP和DSIP-M与凝胶成型剂制备用于改善睡眠的短肽凝胶，对睡眠的改善效果十分显著。

本发明的短肽凝胶剂能够显著降低实验动物的自发活动，缩短失眠模型动物睡眠潜伏时间，和/或延长失眠模型动物的睡眠时间，对失眠模型动物有明显的诱导睡眠的作用。

本发明的短肽凝胶剂对人体受试者有明显的改善睡眠的效果，且受试者在连续使用2周内及停用后2周内，无皮肤刺激性，无皮肤过敏反应，不会损害身体，具有较好的安全性。受试者停用短肽凝胶剂后2周内，未出现失眠、嗜睡、睡眠时间短、睡眠多梦、早醒、入睡困难等不良影响，说明该短肽凝胶剂对人体睡眠状态不会产生依赖性或其它负面或有害性影响。

本发明的短肽DSIP-M与DSIP相比，具有更好的睡眠改善效果。

本发明的短肽DSIP-M和DSIP与凝胶成型剂制备用于改善睡眠的短肽凝胶，均对睡眠的改善效果十分显著。其中本发明的DSIP-M短肽凝胶与DSIP短肽凝胶剂相比，DSIP-M短肽凝胶具有更好的睡眠改善效果。

附图说明

图1示出了本发明促眠短肽DISP和改进的促眠短肽DISP-M的分子结构图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1.DSIP促眠短肽凝胶的制备

本实施例提供一种具有睡眠改善作用的DSIP短肽凝胶及其制备方法。

本实施例中，DSIP促眠短肽凝胶由促眠短肽DSIP和凝胶成型剂组成。其中，促眠短肽的氨基酸序列为Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu(SEQ ID No.1)，结构式如图1所示，凝胶成型剂的重量百分比如下：透明质酸0.3％，泊洛沙姆15％，余量为去离子水。按DSIP：凝胶成型剂为5mg：10mL(5mg/10mL)，于常温下搅拌混合均匀，即得到促眠短肽凝胶。

具体制备过程如下：

第一步，制备DSIP：

DSIP短肽按照设计序列交由吉尔生化(上海)有限公司，采用固态合成法合成或基因工程制备并纯化(>98％)，冷冻封装；

第二步，制备凝胶成型剂：

按上述配方将透明质酸、泊洛沙姆和常温的去离子水混合均匀，然后微过滤去除杂质，封装；

第三步，DSIP和凝胶成型剂分开于2-8℃密封避光保存，使用时二者以DSIP：凝胶成型剂为5mg：10mL(5mg/10mL)的比例混合，混合方式为DSIP向凝胶成型剂中添加，于常温下搅拌混合均匀，搅拌速度300～500rpm，即得到促眠短肽凝胶，于2-8℃密封避光保存。

实施例2DSIP-M促眠短肽凝胶的制备

本实施例提供一种具有睡眠改善作用的DSIP-M短肽凝胶及其制备方法。

本实施例中，DSIP-M促眠短肽凝胶由改进的促眠短肽DSIP-M和凝胶成型剂组成。其中，改进的促眠短肽DSIP-M为实施例1中DSIP在N端乙酰化并在C端酰胺化，氨基酸序列为Ac-Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu-NH₂(SEQ ID No.2)，结构式如图1所示，凝胶成型剂的重量百分比如下：透明质酸0.3％，泊洛沙姆15％，余量为去离子水。按DSIP-M：凝胶成型剂为5mg：10mL(5mg/10mL)，于常温下搅拌混合均匀，即得到促眠短肽凝胶。

具体制备过程如下：

第一步，制备DSIP-M：

DSIP-M短肽按照设计序列交由吉尔生化(上海)有限公司，采用固态合成法合成或基因工程制备并纯化(>98％)，在N端进行乙酰化并在C端进行酰胺化后得到DSIP-M，冷冻封装；

第二步，制备凝胶成型剂：

按上述配方将透明质酸、泊洛沙姆和常温的去离子水混合均匀，然后微过滤去除杂质，封装；

第三步，DSIP-M和凝胶成型剂分开于2-8℃密封避光保存，使用时二者以DSIP-M：凝胶成型剂为5mg：10mL(5mg/10mL)的比例混合，混合方式为DSIP-M向凝胶成型剂中添加，于常温下搅拌混合均匀，搅拌速度300-500rpm，即得到促眠短肽凝胶。

为了监测短肽凝胶剂的助眠效果，实施例3～实施例5参考药效学的评价方法，对实施例1制备的DSIP促眠短肽凝胶和实施例2制备的DSIP-M促眠短肽凝胶进行了大鼠动物实验。

实施例3短肽凝胶剂对大鼠自主运动的影响

取体重(200±20)g大鼠SD(长沙市天勤生物技术有限公司，SPF级，许可证号：SCXK(湘)2019-0013)，耳根部大椎穴部位脱毛，随机分成4组，每组16只。

第1组为空白组，即不做任何处理的大鼠；

第2组为空白凝胶剂组，即利用不添加短肽的凝胶成型剂处理，凝胶成型剂利用实施例1或实施例2的方法进行制备；

第3组为DSIP短肽凝胶组，利用实施例1制备的DSIP促眠短肽凝胶进行处理；

第4组为DSIP-M短肽凝胶组，利用实施例2制备的DSIP-M促眠短肽凝胶进行处理；

实验时，根据分组在每组大鼠耳根后部大椎穴脱毛区域用软胶棒涂抹相应的凝胶剂共1g，两边耳根部各0.5g，涂抹后并用软胶棒按摩3min至形成薄膜后缓慢吸收。按摩完计时开始，伊丽莎白圈固定保护给药位置后，将大鼠放回笼内，记录65min的大鼠活动情况，并对30-40min内每只大鼠的直立运动次数予以统计；统计标准为以大鼠两前肢同时离地计数为1次。实验结果如下表1所示。

表1短肽凝胶剂对大鼠自主运动的观测结果

组别	30-40min自主活动
		1	18.5±14.2
2	19.2±11.7
		3	9.8±4.5*
4	6.6±3.0**#

*p<0.05**p<0.01与1组相比；#p<0.05与第3组相比。

从表1中可以看出，第1组与第2组大鼠的自主活动次数无明显性差异，说明空白凝胶剂对大鼠自发活动无明显影响；第3组和第4组的大鼠自主活动次数较第1组显著减少(p值分别小于0.05和0.01)，说明两组短肽凝胶剂均能对大鼠自发活动有显著性抑制作用，提示短肽凝胶可能具有镇静催眠作用；第4组大鼠自主活动次数较第3组有明显的减少，结果有统计学差异(p<0.05)，说明DSIP-M短肽凝胶比DSIP短肽凝胶对大鼠有更强的自发活动抑制作用。

实施例4短肽凝胶剂对PCPA失眠模型大鼠阈上戊巴比妥钠睡眠的影响

取体重(200±20)g大鼠，正常饲养两周后，各组采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)，按45mg/100g体重腹腔注射，1次/d，连续注射2d，制备经典的PCPA失眠模型。模型组造模后，不进行任何干预，连续饲养7d。实验时大鼠随机分成4组，每组16只。

第1组为空白组，即不做任何处理的大鼠；

第2组为空白凝胶剂组，即利用不添加短肽的凝胶成型剂处理，凝胶成型剂利用实施例1或实施例2的方法进行制备；

第3组为DSIP短肽凝胶组，利用实施例1制备的DSIP促眠短肽凝胶进行处理；

第4组为DSIP-M短肽凝胶组，利用实施例2制备的DSIP-M促眠短肽凝胶进行处理；

实验时，根据分组在每组大鼠耳根后部大椎穴区域脱毛，用软胶棒涂抹相应的凝胶剂共0.5g，两边耳根部各0.25g，涂抹后并用软胶棒按摩3min至形成薄膜后缓慢吸收。大鼠涂抹给药后伊丽莎白圈固定保护给药位置，50min后各组大鼠按45mg/kg体重剂量腹腔注射戊巴比妥钠(按体重0.1mL/100g)，记录注射时刻(T.R)。15min内翻正反射消失达1min时，记录时刻表示大鼠入睡(T.S)，翻正反射恢复时，记录时刻表示大鼠睡醒(T.W)。由以上指标分别算出：①睡眠潜伏期(T.S-T.R)，表示大鼠从给药到翻正反射消失的时间，②睡眠持续期(T.W-T.S)，表示大鼠从翻正反射消失到翻正反射恢复的时间。实验结果如下表2所示。

表2短肽凝胶剂对大鼠鼠阈上戊巴比妥钠睡眠试验观测结果

组别	潜伏期/min	睡眠总时长/min
			1	10.1±5.2	20.0±16.2
2	11.9±4.9	17.9±14.5
			3	6.6±3.1*	39.8±16.3**
4	3.6±2.3**##	55.2±14.8**#

*p<0.05**p<0.01与1组相比；#p<0.05##p<0.01与第3组相比；

从表2中可以看出，第1组与第2组大鼠的睡眠潜伏期和睡眠总时长无显著差异，说明空白凝胶剂对失眠大鼠几乎无诱导睡眠的作用；第3组和第4组的大鼠睡眠的潜伏期较第1组显著缩短(p值分别小于0.05和0.01)，且第3组和第4组的大鼠睡眠总时长与第1组相比显著增加(p<0.01)，进一步说明两组短肽凝胶剂均能对失眠模型大鼠有显著性诱导睡眠的效果。此外，第4组大鼠睡眠的潜伏期较第3组有显著的缩短(p<0.01)，而睡眠总时长明显增加(p<0.05)，进一步说明DSIP-M短肽凝胶比DSIP短肽凝胶对大鼠有更好的诱导睡眠的效果。

实施例5志愿者睡眠疗效实验研究

本实施例通过安眠穴上涂抹短肽凝胶剂与常规服用镇静安眠药物的对照，评价探讨短肽凝胶剂用于改善成年人失眠症状的有效性、安全性、以及对成年人日常生活质量的影响。

睡眠障碍志愿者来源：案例来源时间于2020年10月至2021年10月，来源于该时间段内浙江省杭州市钱塘新区已工作人群且伴有失眠、睡眠障碍等情况。

诊断标准：参照我国发布的《中国成人失眠诊断与治疗指南》(中华医学会神经病学分会睡眠障碍学组.中华神经科杂志，2012，45(7)：534-540.)、《中国失眠定义、诊断及药物治疗专家共识》(草案)(失眠定义、诊断及药物治疗共识专家组.中华神经科杂志，2006，39(2)：141：143)、《中国精神障碍分类与诊断标准》第3版(CCMD-3)中失眠的诊断标准内容，以及参照美国睡眠障碍联合会(ASDA)制定的睡眠障碍国际分类(ICSD3)中有关失眠的诊断标准，匹兹堡睡眠质量指数表(PSQI)，制定本实施例的医学诊断标准如下：

①.年龄为18-60岁。

②.主要诉求对象为睡眠障碍的成年人，临床症状标准为：(1)睡眠时间减少：入睡困难(入睡时间30min或以上)、总睡眠时间减少(每夜通常少于6小时)；(2)睡眠质量下降：早醒、多梦、整夜醒觉次数≥2次；(3)醒后不适、疲乏或白天困倦感，具有失眠或关注失眠结果的主观体验；(4)病程标准：每周至少发生3次，并至少持续了1个月。

③.或伴有以下一项或多项临床症状：烘热汗出、烦躁易怒、心择胸闷、情志异常、月经不调、腰腿酸痛、动机、精力和主观努力的下降；容易犯错；过度关注或对于睡眠不满意；头晕眼花、口干口苦、情志抑郁、舌暗红少苔、脉弦细；夜间睡眠障碍导致疲劳乏力，注意力、定向力和记忆力损害。

纳入标准

①.符合上述诊断标准的睡眠障碍者；

②.研究试验前一周未接受睡眠障碍相关治疗的志愿者；

③.7分<匹兹堡睡眠质量指数表(PSQI)总积分<15分；

④.签署《知情同意书》，自愿参加本试验的研究者；

排除标准

①.不符合以上诊断标准及纳入标准者；

②.合并有心血管、肝肾等严重系统性原发疾病患者；

③.患有抑郁症、焦虑症、精神分裂症等严重精神疾病患者；

④.怀孕、妊娠、或哺乳期妇女；

⑤.已参加其他临床试验研究者；

⑥.已知对多肽或凝胶或耳垂穴位贴敷药物过敏者；

⑦.拒绝签订知情同意书。

志愿者试验案例中止和脱落

①.纳入后，患者因各种原因要求中断治疗或退出者；

②.依从性较差，不能按规定进行治疗或有明显干预因素影响疗效或安全性的患者；

③.治疗过程中出现不良反应者；

④.治疗过程中出现严重的其它系统并发性疾病者；

⑤.失访者；明确记录受试者退出的原因，对于未按时接受干预或疗效评价的患者，应通过电话等方式问清缘由。

⑥.中止或脱落的病例应记录原因，其观察量表应保留备查。如中止或脱落人数达到计划观测人数10％时，应补充相同病例数。

实验方案设计与操作

分组方法：本试验采用随机分组、对照研宄的方法。总样本数量为100例，随机数字表法分成四组；

第一组为空白组，即不进行任何干预；

第二组为空白凝胶剂组，即利用不添加短肽的凝胶成型剂干预，凝胶成型剂利用实施例1或实施例2的方法进行制备；

第三组为DSIP短肽凝胶剂组，利用实施例1制备的DSIP促眠短肽凝胶进行干预；

第四组为DSIP-M短肽凝胶组，利用实施例2制备的DSIP-M促眠短肽凝胶进行干预。

每组25人。注意4组受试者的年龄、病程等无显著差异，使之具可比性。

实验方法：本实验采用受试者组间对照的试验方法，干预方案采用每日入睡前1小时(每日晚上21：00)，洗漱后，用软胶棒涂抹相应的凝胶剂共1g，涂抹位置为两侧耳根后部安眠穴各0.5g，涂抹后用软胶棒按摩3min至形成薄膜后缓慢吸收。每日涂抹一次，7天为一个疗程。

安眠穴位涂抹中可能出现的问题及处理方法：安眠穴位涂抹注意事项及意外处理：涂抹乳霜后注意局部防水；涂抹时间以3min内为度，最长不超过15min，避免涂抹过久。涂抹处如出现颜色变化、微痒、轻微红肿、较小水泡等均属于正常的皮肤反应。若出现程度严重范围较大的皮肤过敏性状如红斑、疹痒等不适反应，应立即停止涂抹并对症处理。

注意：实验过程中如发现其他不良反应或事件时，以患者安全为基本原则，并根据具体情况采取必要的处理措施；对异常现象应追踪至恢复正常为止，并决定是否中止受试者实验。如有中途脱落或终止实验者，应记录备案。

对照方法：本实验的对照方法为组间对照。

数据处理：本研宄使用excel对实验数据及结果进行统计分析。计量资料记录采用

的形式(即均数土标准差)。采用t-test进行两组间差异统计学分析。

疗效观测与评定

疗效评定指标：根据1993年中华人民共和国卫生部制定的《中药新药临床研究指导原则(第一辑)：44.中药新药治疗失眠的临床研究指导原则》(中华人民共和国卫生部，1993：186-187)以及中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》(ZYT001.1-94)中的内容，运用睡眠状况自评量表(SRSS)进行自评，了解受试者实验前后的变化。此表包括试用前后的入睡时间、睡眠时间、睡眠质量和睡眠觉醒程度及觉醒后的精神状态等指标。开始试用前让自评者评定一次，试用结束时再让受试者评定一次，以便通过总分变化分析自评者的睡眠状态变化情况。

疗效诊断标准分为四级：

痊愈：症状改善显著，可达正常睡眠状态，且整夜睡眠时间＞6h，或SRSS总分值下降≥75％；睡眠质量评定为优；

显效：失眠症状好转，睡眠深度增加，整夜睡眠时间增加＞3h，或SRSS总分值下降≥50％但＜75％；睡眠质量评定为良好；

有效：症状缓解或减轻，或整夜睡眠时间增加≥3h，或SRSS总分值下降≥30％但＜50％；睡眠质量评定为一般；

无效：失眠症状无任何改善，或SRSS总分值下降＜30％，或睡眠时间＜3h，睡眠质量评定为差；

评价时点：本实验治疗时间为2疗程共14天，评测指标分别在治疗前以及2疗程14日治疗结束时进行评测。每组有1-3人退出，并及时补充符合要求的储备人员进行实验。

实验结果

短肽凝胶对入睡时间和睡眠时间的影响结果如表3所示。从表3中可以看出，第1组与第2组受试者入睡时间和睡眠时间无明显性差异，睡眠质量和醒后精神状态均较差，说明空白凝胶剂对人体几乎无促进睡眠的作用；第3组和第4组的入睡时间较第1组出现显著性缩短(p<0.01)，睡眠时间出现显著性增加(p<0.01)，说明两组短肽凝胶剂均能对受试者有显著性辅助睡眠的效果。第4组受试者入睡时间较第3组有明一定的缩短(p<0.01)，而睡眠时间出现一定的延长(p<0.01)，说明DSIP-M短肽凝胶比DSIP短肽凝胶对受试者有更好的辅助睡眠的效果。

表3睡眠功效指标

组别	入睡时间(h)	睡眠时间(h)
			1	1.5±0.4	3.0±0.8
2	1.6±0.6	2.7±0.9
			3	0.7±0.2**	6.1±0.9**
4	0.5±0.1**##	7.1±0.8**##

**p<0.01与1组相比；##p<0.01与第3组相比

短肽凝胶对睡眠促进的结果如表4所示。从表4中可以看出，第1组与第2组受试者无明显提升睡眠的效果，对于改善受试者的睡眠状态几乎无效，说明空白凝胶剂对受试者几乎无促进睡眠的作用；第3组和第4组的受试者在提升睡眠疗效上，痊愈、显效、有效数均比较第一组和第二组出现显著增加，说明两组短肽凝胶剂均能对受试者有显著性辅助睡眠的效果。第4组受试者较第3组在痊愈数量上有一定的增加，整体的疗效上，第4组短肽凝胶剂较第3组要好，说明DSIP-M短肽凝胶比DSIP短肽凝胶对受试者有更好的辅助睡眠的效果。

表4睡眠受试者统计分析结果

组别	痊愈(例)	显效(例)	有效(例)	无效(例)
					1	0	1	4	20
2	0	0	2	23
					3	14	7	3	1
4	18	5	2	0

使用两组短肽凝胶剂的所有受试者，使用时的2周内，均未出现不适、呕吐、过敏、皮肤异常等不良症状；在停止使用短肽凝胶剂的后2周内，依然均未出现不适、呕吐、过敏、皮肤异常等不良症状；说明短肽凝胶剂在使用期间及停用后，所有受试者均无不良症状和皮肤过敏反应，具有较好的安全性。受试者停用短肽凝胶剂后2周内，未出现失眠、嗜睡、睡眠时间短、睡眠多梦、早醒、入睡困难等不良影响，说明该短肽凝胶剂对人体睡眠状态不会产生依赖性或其它负面或有害性影响。同时，使用第4组短肽凝胶剂，痊愈率更高，没有无效病例。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 安域生物制药（杭州）有限公司

<120> 一种具有睡眠改善作用的短肽凝胶及其制备方法和应用

<130> XYY202111628

<150> 2020115433985

<151> 2020-12-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Ala Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> ACETYLATION

<222> (1)..(1)

<220>

<221> AMIDATION

<222> (9)..(9)

<400> 2

Trp Ala Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu

1 5

Claims (3)

1.短肽DSIP-M在制备以涂抹方法施用在安眠穴上用于改善睡眠的制剂中的应用，所述制剂为短肽凝胶，由所述短肽DSIP-M以及凝胶成型剂组成，所述凝胶成型剂中，所述透明质酸的质量分数为0.3～0.5％；所述泊洛沙姆的质量分数为15～25％，所述短肽DSIP-M与所述凝胶成型剂的比例为1mg:1.6～10mL，所述短肽DSIP-M的氨基酸序列为Ac-Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu-NH₂。

2.一种以涂抹方法施用在安眠穴上用于改善睡眠的短肽凝胶，其特征在于，由短肽DSIP-M以及凝胶成型剂组成，所述凝胶成型剂中，所述透明质酸的质量分数为0.3～0.5％；所述泊洛沙姆的质量分数为15～25％，所述短肽DSIP-M与所述凝胶成型剂的比例为1mg:1.6～10mL，所述短肽DSIP-M的氨基酸序列为Ac-Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu-NH₂。

3.权利要求2所述的以涂抹方法施用在安眠穴上用于改善睡眠的短肽凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获得所述短肽DSIP-M，

S2，获得由去离子水、透明质酸和泊洛沙姆组成的凝胶成型剂，

S3，将所述短肽DSIP-M添加入所述凝胶成型剂中，边加边搅拌。

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