CN114002318A - 前列腺特异性抗原的检测方法 - Google Patents

前列腺特异性抗原的检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种前列腺特异性抗原的检测方法，该前列腺特异性抗原的检测方法包括提供一声表波生物传感器，声表波生物传感器具有第一敏感区；在第一敏感区形成一自组装分子膜，并对自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区；在第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体；提供MoS2@Cu2O‑Au纳米复合物和目标生物分子；对MoS2@Cu2O‑Au纳米复合物和目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液；通过第二敏感区对待检测溶液进行检测。本方案可以提高声表波生物传感器对目标生物分子的检测灵敏度。

Description

前列腺特异性抗原的检测方法
技术领域
本申请实施例涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种前列腺特异性抗原的检测方法。
背景技术
前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)是一种特异性的前列腺癌标志物，目前已成为临床诊断前列腺癌的重要生物标志物。因此，对PSA的快速定量的检测具有重要临床价值。
目前，PSA的检测方法有多种，包括荧光标记法、电化学免疫传感器法、表面等离子体共振法、电化学发光法等。
然而，上述各种PSA的检测方法的灵敏度仍然不够理想。
发明内容
本申请实施例提供一种前列腺特异性抗原的检测方法，可以提高声表波生物传感器对目标生物分子的检测灵敏度。
本申请实施例提供了一种前列腺特异性抗原的检测方法，包括：
提供一声表波生物传感器，所述声表波生物传感器具有第一敏感区；
在所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并对所述自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区；
在所述第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体；
提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子；
对所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和所述目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液；
通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，在所述提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子之前，还包括：
提供纳米Au颗粒、MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料；
基于所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料形成MoS2@Cu2O纳米材料复合物；
将所述纳米Au颗粒附着于所述MoS2@Cu2O纳米材料复合物的表面，形成MoS2@Cu2O-Au纳米复合物。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，所述提供纳米Au颗粒、MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料，包括：
利用一步还原法制备纳米Au颗粒，
利用水热法合成MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，所述基于所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料形成MoS2@Cu2O纳米材料复合物，包括：
基于水热法、所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料合成MoS2@Cu2O纳米材料复合物。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，所述在所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并对所述自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区，包括：
利用3-巯基丙酸所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并采用活化剂对所述自组装分子膜进行活化处理，生成中间酯，得到第二敏感区。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，所述对所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和所述目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液，包括：
使用微量天平称取预设重量的MoS2@Cu2O-Au纳米复合物；
将所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物加入盛有去离子水的烧杯中超声处理第一预设时长；
使用微量移液器将待检测抗体溶液加入所述烧杯中；
将所述烧杯放入恒温磁力搅拌器上进行搅拌处理；
去除所述烧杯中的上层清液，得到所述待检测溶液。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，所述在所述第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体，包括：
使用微量移液器在所述第二敏感区依次滴加PBS缓冲液、目标生物分子的捕获抗体；
将所述声表波生物传感器放入湿盒中，再将所述湿盒放置于恒温冰箱进行培育；
培育完成后，从所述湿盒中取出所述声表波生物传感器，并使用PBS缓冲液对所述声表波生物传感器的第二敏感区进行冲洗；
在所述第二敏感区上滴加牛血清白蛋白溶液，并将所述声表波生物传感器放置在室温第二预设时长；
使用PBS缓冲液对所述声表波生物传感器的第二敏感区进行冲洗；
利用氮气枪对所述第二敏感区上的残留物进行冲洗，从而使得所述目标生物分子的捕获抗体固定于所述第二敏感区上。
在本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法中，所述通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测，包括：
将具有所述第二敏感区的所述声表波生物传感器放入微流通道；
基于第三预设时长和预设速度对所述微流通道注入PBS缓冲液；
当到达所述预设时长时，以所述预设速度将所述待检测溶液注入所述微流通道，所述声表波生物传感器通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测。
综上，本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法包括提供一声表波生物传感器，所述声表波生物传感器具有第一敏感区；在所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并对所述自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区；在所述第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体；提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子；对所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和所述目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液；通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测。本方案可以提高声表波生物传感器对目标生物分子的检测灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法的流程示意图。
图2是本申请实施例提供的声表面波传感器生成第二敏感区的原理图。
图3是本申请实施例提供的声表面波生物传感器的敏感区金膜表面经过有机溶剂清洗、3-巯基丙酸酒精溶液处理、活化剂混合溶液处理后敏感区的水滴接触角示意图。
图4是本申请实施例提供的不同放大倍数下纳米Au颗粒溶液SEM图。
图5是本申请实施例提供的MoS2、Cu2O和MoS2@Cu2O的X射线衍射图。
图6是本申请实施例提供的不同放大倍数下MoS2的扫描电子显微镜图。
图7是本申请实施例提供的不同放大倍数下Cu2O的扫描电子显微镜图。
图8是本申请实施例提供的不同放大倍数下MoS2@Cu2O的扫描电子显微镜图。
图9是本申请实施例提供的不同放大倍数下MoS2@Cu2O-Au的扫描电子显微镜图。
图10是本申请实施例提供的不同放大倍数下MoS2@Cu2O-Au的透射电子显微镜图。
图11是本申请实施例提供的PBS环境下的稳定测试图。
图12是本申请实施例提供的目标生物分子PSA使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料增大信号的原理示意图。
图13是本申请实施例提供的目标生物分子PSA使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料增大相应的检测图。
图14是本申请实施例提供的使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料对不同浓度目标生物分子PSA信号放大的实时检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”和“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或模块的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤或模块，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或模块。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本申请实施例提供了一种前列腺特异性抗原的检测方法，以下将进行详细说明。
请参阅图1，图1是本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法的流程示意图。该前列腺特异性抗原的检测方法的具体流程可以如下：
101、提供一声表波生物传感器，该声表波生物传感器具有第一敏感区。
需要说明的是，该声表波生物传感器为业内常用的声表波生物传感器。
102、在第一敏感区形成一自组装分子膜，并对自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区。
具体的，可以利用3-巯基丙酸在该第一敏感区形成一自组装分子膜，并采用活化剂对自组装分子膜进行活化处理，生成中间酯，得到第二敏感区。
目标生物分子PSA捕获抗体属于生物大分子蛋白质，其空间结构含有大量的游离氨基，氨基可以与中间酯发生反应，从而实现了目标生物分子PSA捕获抗体在表波生物传感器的第二敏感区的固定。
需要说明的是，针对不同类型的生物传感器，其基底材料表面活性基团修饰的方法各异。在本申请中，所采用的声表面波生物传感器的敏感区当避免使用强酸强碱作为交联剂和固化剂，以保证生物声表波生物传感器的性能。
在本申请中，可以在声表面波生物传感器的第一敏感区沉积一层金膜，金具备良好的生物相容性和化学惰性对于后续使用硫醇3-巯基丙酸(MPA)和活化剂(EDC/NHS)不会产生较大的损坏。并且在实际的实验过程中，采取密闭恒温湿盒培育的方式，具有操作简洁、环境友好、资源节约、生物安全的特点。
如图2所示，该步骤102的具体流程可以如下：
1.第一敏感区的清洗：将声表波生物传感器分别放入酒精溶液和去离子水中，接着运用超声处理，设定合适的时间和功率，并使用氮气枪吹干。
2.声表面波生物传感器的第一敏感区金膜的前处理：用1M NaOH溶液处理5min，接着用1M HCl溶液处理5min，然后用酒精溶液和去离子水冲洗三次，并用氮气枪吹干。
3.声表面波生物传感器第一敏感区金膜自组装分子膜：用40mM 3-巯基丙酸(MPA)酒精溶液处理声表波生物传感器24h，然后用酒精溶液和去离子水冲洗三次，并用氮气枪吹干。
4.声表面波生物传感器的第一敏感区金膜活化处理：用活化剂EDC/NHS(75mM/15mM,体积比1：1)混合溶液处理该声表波生物传感器1h，然后用酒精溶液和去离子水冲洗三次，从而得到第二敏感区。
如图3所示，图3为声表面波生物传感器的第一敏感区金膜表面经过有机溶剂清洗、硫醇3-巯基丙酸(MPA)酒精溶液处理、活化剂EDC/NHS混合溶液处理后敏感区的水滴接触角示意图。
从图中可以明显的观察到，水滴在声表波生物传感器敏感区金膜表面的接触角在不同溶液处理之后发生了明显的变化。敏感区金膜表面水滴接触角从最开始有机溶剂处理为74°，经过硫醇3-巯基丙酸酒精溶液处理之后，传感器芯片敏感区金膜表面亲水性增加其水滴接触角为54°，后续进一步活化剂EDC/NHS混合溶液处理后，传感器芯片敏感区金膜表面亲水性降低其水滴接触角为85.75°。敏感区金膜表面在每一步的溶液处理后，其表面形成了不同的分子膜,而不同分子膜对水滴的亲水性各不相同，进一步其接触角会发生变化。
通过对以上实验结果进行分析，声表波生物传感器敏感区金膜表面经过有机溶剂清洗后，使用硫醇3-巯基丙酸酒精溶液处理，由于在敏感区金膜表面自组装一层分子膜，硫醇中含有羟基具有一定的亲水性，因而使得传感器芯片敏感区金膜亲水性增大，相应的水滴接触角则表现为数值的减少。在声表波生物传感器敏感区金膜后续经过活化剂EDC/NHS混合溶液处理后，用于该活化剂能够与上一步形成的自组装分子膜反应，形成活泼中间酯，酯作为一种疏水性较强的有机物，当其形成的时候会使敏感区金膜对水滴的亲水性降低，相应的水滴接触角则表现为数值的增加。因此，通过对在声表波生物传感器敏感区金膜表面经过不同溶液处理之后对水滴接触角的变化，可以判断此声表波生物传感器表面功能化修饰特定基团具有良好的效果，为后续固定目标生物分子PSA捕获抗体提供了有力的保障。
103、在第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体。
在一些实施例中，可以使用微量移液器在第二敏感区依次滴加PBS缓冲液、目标生物分子的捕获抗体；将声表波生物传感器放入湿盒中，再将湿盒放置于恒温冰箱进行培育；培育完成后，从湿盒中取出声表波生物传感器，并使用PBS缓冲液对声表波生物传感器的第二敏感区进行冲洗；在第二敏感区上滴加牛血清白蛋白溶液，并将声表波生物传感器放置在室温第二预设时长；使用PBS缓冲液对声表波生物传感器的第二敏感区进行冲洗；利用氮气枪对第二敏感区上的残留物进行冲洗，从而使得目标生物分子的捕获抗体固定于第二敏感区上。
可以理解的是，该第二预设时长可以根据实际情况进行设定。
在第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体的具体流程可以如下：
1.用微量移液器在修饰了活泼中间酯的第二敏感区金膜表面滴加0.5mL的PBS缓冲液，取5μL浓度为2mg/mL的目标生物分子PSA捕获抗体溶解于上述滴加的PBS缓冲液，随后小心将该声表波生物传感器放入湿盒，然后将湿盒放置于4℃恒温冰箱培育24小时。
2.经过上述所要求的时间后，取出该声表波生物传感器使用PBS缓冲液缓慢冲洗敏感区金膜表面。
3.配制浓度为2％的牛血清白蛋白BSA溶液，用微量移液器取0.5mL缓慢滴加在固定目标生物分子PSA捕获抗体的声表面波SAW第二敏感区金膜表面，此过程可以封堵残留在敏感区金膜表面的其他官能团，放置在室温60分钟。
4.时间到达之后取出声表面波SAW声表波生物传感器，使用PBS缓冲液缓慢冲洗，用氮气枪稍稍冲洗残留在敏感区金膜表面的残留物，由此固定有目标生物分子PSA捕获抗体的声表面波生物传感器制备完成。
在一些实施例中，为了验证该捕获抗体是否成功的固定在第二敏感区金膜表面。在进行上述实验步骤时，可以选用带有荧光标记物FITC标记的荧光PSA捕获抗体取代正常的PSA捕获抗体。从而可以确定目标生物分子PSA荧光捕获抗体成功的固定在第二敏感区金膜表面，为后续进行目标生物分子PSA抗原的实时监测提供了强有力的支撑。
104、提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子。
需要说明的是，在步骤“提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子”之前，还可以包括：
提供纳米Au颗粒、MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料；
基于MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料形成MoS2@Cu2O纳米材料复合物；
将纳米Au颗粒附着于MoS2@Cu2O纳米材料复合物的表面，形成MoS2@Cu2O-Au纳米复合物。
在一些实施例中，可以利用一步还原法制备纳米Au颗粒，利用水热法合成MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料。
其中，利用一步还原法制备纳米Au颗粒的具体流程可以如下：
首先将清洗若干遍的三口烧瓶连同支架安置在数显恒温磁力搅拌器上，用烧杯缓慢加入25mL去离子水，沙浴加热设置温度为90℃，搅拌速度设为60r/min。温度达到设定值时，加入事先用天平称取并配比好的适量浓度的柠檬酸钠溶液，边加入边搅拌。等三口烧瓶反应溶剂温度趋于稳定时，加入事先称取并配比好的氯Au酸溶液。观察三口烧瓶内溶液颜色变化，当其颜色由黄色逐渐转变为酒红色时，继续等待15min。然后小心取下三口烧瓶，将其浸入事先备好的冰浴之中，此步骤可使溶液快速冷却，经过以上步骤制备出来的溶液即为纳米Au颗粒溶液。
在本申请实施例中，对上述合成的纳米Au颗粒溶液进行了SEM分析。如图4所示，图4为不同放大倍数下纳米Au颗粒溶液SEM图，从图4中可以看到经过一步还原法制备的纳米Au颗粒具有良好的分散性，纳米Au颗粒在微观形貌上为球状或类球状，团聚情况较少且尺寸大小分布均匀，直径约30nm。由SEM表征结果证明了一步还原法制备的纳米Au颗粒溶液在微观尺寸上为后续与目标生物分子的检测抗体结合提供良好的基础。
利用水热法合成MoS2纳米材料的具体步骤可以如下：
首先使用微量天平量取一定质量的(NH4)2MoS4固体粉末，接着溶解于盛有适量去离子水的烧杯中。用超声清洗加快其溶解，设置超声功率70W，超声10min，溶液最终成为均匀透明。接着，用微量移液器逐滴加入25uLN2H4·H2O于上述均一透明溶液中，并且进一步超声30min，功率同样为70W。超声完毕后，将上述溶液加入聚四氟乙烯高温反应釜中，接着放入烘箱，设置反应温度200℃，时间10h。反应结束取出反应釜中的溶液，后续使用去离子水和酒精溶液对取出的溶液进行清洗，用高速离心机4000rpm/min离心5分钟。离心之后，取出产物加入3mL去离子水，用冷冻干燥机干燥24h以制成固体MoS2粉末。
如图5所示，图5是MoS2、Cu2O和MoS2@Cu2O的X射线衍射图。从图5中观察MoS2的XRD测试结果与MoS2标准PDF卡片的对比，显示在14.37°、39.53°、49.78°、58.3°左右附近的衍射峰有着较好的匹配。该结果证实了上述实验成功的合成出MoS2。
如图6所示，图6是不同放大倍数下MoS2的扫描电子显微镜图。上述合成的MoS2纳米材料其SEM表征结果可以如图6所示。从图6中观察其微观结构为球型，周围是随机堆砌的若干个呈二维纳米片花瓣结构的MoS2分子，构成三维多孔的立体结构。由以上分析可得MoS2分子具有较大的比表面积，进一步会拥有数量较多的结合位点。
利用水热法合成Cu2O纳米材料的具体流程可以如下：
首先使用微量天平量取一定质量的Cu(NO3)2·3H2O固体粉末，接着溶解于盛有适量去离子水的烧杯中。用超声清洗加快其溶解，设置超声功率70W，超声10min，溶液最终成为蓝色均匀透明。接着，用微量移液器逐滴加入75uL N2H4·H2O于上述均一透明溶液中，并且进一步超声30min，功率同样为70W。超声完毕后，将上述溶液加入聚四氟乙烯高温反应釜中，接着放入烘箱，设置反应温度200℃，时间10h。反应结束取出反应釜中的溶液，后续使用去离子水和酒精溶液对取出的溶液进行清洗，用高速离心机4000rpm/min离心5分钟。离心之后，取出产物加入3mL去离子水，用冷冻干燥机干燥24h以制成固体Cu2O粉末。
需要说明的是，对Cu2O纳米材料进行XRD表征，结果如图5所示，图5是示出了Cu2O与标准Cu2O卡片(JCPDS No.34-1354)对比，在37°、74.4°左右附近的衍射峰有着较好的匹配，以上结果表明水热法合成出较好的Cu2O。
如图7所示，图7是不同放大倍数下Cu2O的扫描电子显微镜图。从图7中可以观察到Cu2O纳米材料的微观结构尺寸大小为100-200nm，且具有不同的晶体形态，包括球形，多面体和纳米棒结构，多个Cu2O分子堆砌在一起形成具有多孔结构的三维空间。由以上分析可得Cu2O分子具有较大的比表面积，进一步会拥有数量较多的结合位点
在一些实施例中，步骤“基于MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料形成MoS2@Cu2O纳米材料复合物”可以包括：
基于水热法、所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料合成MoS2@Cu2O纳米材料复合物。
具体的，可以首先使用微量天平量取一定质量的(NH4)2MoS4固体粉末，接着溶解于盛有适量去离子水的烧杯中。用超声清洗加快其溶解，设置超声功率70W，超声10min，溶液最终成为均匀透明。接着继续使用微量天平称取适量的Cu(NO3)2·3H2O固体粉末，按照按照上面的步骤加入另一个烧杯中，重复上面的操作。然后将经过超声处理后两个烧杯内的溶液混合在一起，用微量移液器逐滴加入100uLN2H4·H2O于该混合溶液中，边滴加边轻微搅拌，进一步超声处理30min，功率70W。超声完毕后，将上述溶液加入聚四氟乙烯高温反应釜中，接着放入烘箱，设置反应温度200℃，时间10h。反应结束取出反应釜中的溶液，后续使用去离子水和酒精溶液对取出的溶液进行清洗，用高速离心机4000rpm/min离心5分钟。离心之后，取出产物加入3mL去离子水，用冷冻干燥机干燥24h以制成固体MoS2@Cu2O粉末。
其中，MoS2@Cu2O纳米材料复合物的X射线衍射分析(XRD)可以如图5所示，从图5中可以看到(002)、(100)、(110)的格面表示宽度MoS2纳米片的衍射峰，另外，五个强衍射峰为(110)、(111)、(200)、(220)、(311)面也可以观察到，以验证在MoS2@Cu2O纳米复合材料合成的Cu2O。以上结果证明了水热法较好合成出MoS2@Cu2O纳米复合材料。
如图8所示，图8是不同放大倍数下MoS2@Cu2O的扫描电子显微镜图。该图像充分展示了MoS2@Cu2O的微观结构，呈现出一般均匀的颗粒大小和珊瑚状形态。呈三维状珊瑚结构，具有较好的空间结构，有效的增加了该复合材料的比表面积且增加了反应位点。以上结果为后续实验的进行提供了有力的保障。
在一些实施例中，制备MoS2@Cu2O-Au纳米复合物的具体流程可以如下：
取3mL纳米Au溶液和5mL MoS2@Cu2O粉末的溶液加入离心管，接着将该离心管放入恒温磁力搅拌器上，温度设置为4℃。搅拌10后取出去离子水冲洗3次，放置在真空干燥箱24h得到MoS2@Cu2O-Au复合物粉末。
请参阅图9，图9是不同放大倍数下MoS2@Cu2O-Au的扫描电子显微镜图。从图9中观察可得在MoS2@Cu2O纳米复合材料的基础上加载了许多均匀的纳米Au颗粒，具有良好的分散性，若干个MoS2@Cu2O-Au分子在三维空间上互相堆砌形成多孔结构。由以上分析可得MoS2@Cu2O-Au分子具有较大的比表面积，进一步会拥有数量较多的结合位点，为后续与目标生物分子PSA检测抗体的结合提供了强有力的保障。
接着对MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料进行HR-TEM表征，其结果如图10所示。从图10中观察可以获得MoS2(002)纳米粒子的0.24nm晶格间距和Cu2O(111)纳米粒子的0.18nm晶格间距以及纳米Au颗粒(111)的0.17nm晶格间距。以上结果可以验证纳米Au颗粒良好的附着在MoS2@Cu2O表面。
综上，本申请实施例采用一步还原法合成了纳米Au颗粒溶液，SEM表征结果显示该方法合成的纳米Au颗粒具备良好的分散性，微观形貌上程球状或类球状，团聚情况较少且尺寸大小分布均匀。
其次使用水热法分别合成了MoS2、Cu2O、MoS2@Cu2O纳米材料，然后利用物理搅拌的方法制备了MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料。并通过对MoS2、Cu2O、MoS2@Cu2O三种材料进行XRD和SEM表征分析，表征结果显示上述三种纳米材料具有良好的分散性、较大的比表面积和结合位点。通过透射电子显微镜(HR-TEM)和X射线能谱分析(EDS)表征了MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料，证明了通过物理搅拌的方法使得复合材料加载了许多均匀的纳米Au颗粒，具有良好的分散性，若干个MoS2@Cu2O-Au分子在三维空间上互相堆砌形成多孔结构，具有较大的比表面积，进而具有数量较多的结合位点，为后续与目标生物分子PSA检测抗体的结合提供了强有力的保障。
105、对MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液。
具体的，可以使用微量天平称取预设重量的MoS2@Cu2O-Au纳米复合物；将MoS2@Cu2O-Au纳米复合物加入盛有去离子水的烧杯中超声处理第一预设时长；使用微量移液器将待检测抗体溶液加入烧杯中；将烧杯放入恒温磁力搅拌器上进行搅拌处理；去除烧杯中的上层清液，得到待检测溶液。
可以理解的是，该第一预设时长可以根据实际情况进行设定。
在一些实施例中，可以使用微量天平称取适量MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料固体粉末并加入盛有适量去离子水的烧杯中，超声处理15min。接着使用微量移液器将适量浓度为1mg/mL的anti-PSA检测抗体溶液加入盛有上述溶液的烧杯中，然后放入恒温磁力搅拌器上，设置温度4℃，搅拌时间为10h。搅拌结束用离心机以3500rpm/min的转速离心10min，去除上层清液，得到待检测溶液，之后再放置于4℃冰箱备用。
106、通过第二敏感区对待检测溶液进行检测。
在一些实施例中，可以将具有第二敏感区的声表波生物传感器放入微流通道；基于第三预设时长和预设速度对微流通道注入PBS缓冲液；当到达预设时长时，以预设速度将待检测溶液注入微流通道，声表波生物传感器通过第二敏感区对待检测溶液进行检测。
需要说明的是，该预设速度和第三预设时长可以根据实际情况进行设定。
目前一段时间大部分声表面波液相生物分子测试系统，其基本设计为在内部流通所要测试液体的微型反应腔室。同时，通过使用简单的橡胶圈对腔室实行密封，或者通过使用PDMS对敏感区域进行密封，PDMS对应反应区留下的微小凹槽可以使反应液体流入敏感区，进而进行后续测试。
测试过程中敏感区域所需的微型反应腔室的设计应该多方面全方位的考虑可能影响的因素，比如，所选材料的易加工性、优异的生物相容性、可靠性、空间密闭性等。综合以上各因素的考虑，本实施例采取PDMS和橡胶圈结合的方式来进行微流通道的设计与制作，因其自身具备的诸多优点，如无毒性、良好的生物相容性、富弹性、能与其他相关材料以范德华力进行可逆键合性等等。通过范德华力的可逆键合，能够和与之匹配的橡胶圈进行结合。由于这种键合是可逆的，进而能够使得微流通道可以拆卸，可以后续对SAW器件清洗、回收、再利用，实现了环境友好，资源节约。
具体的，可以通过使用尺寸匹配的橡胶圈，用镊子小心安放在敏感区上面，利用PMDS材料压在橡胶圈上面，如此，形成了一个密闭的微型反应腔室。样品注入孔和样品排除孔则位于反应腔室的两端，注入孔和排除孔的孔径保持和与注射器连接的管道孔径相匹配。整个微流装置分为上下两层，通过在上下两层的四个角打孔，用四个螺丝钉用于实现对整个微流装置的密封。
检测平台整体可以分为两大部分：电路与信号检测部分部分、注样部分。电路与信号检测部分：声表波生物传感器放置在微流通道里面，通过使用两根射频线连接网络分析仪的两个信号输入输出端口。通过计算机数据采集程序可实现对网络分析仪产生的声表波信号采集，进一步实现人机交互，实时监测。注样部分：依次装有PBS缓冲液、PSA前列腺特异性抗原溶液、纳米Au抗体复合物溶液、MoS2@Cu2O-Au与PSA复合物溶液的注射器。使用三端口流入一端口流出接头，可将不同溶液的注射器和装配有声表波生物传感器的微流通道连接。进一步对多通道微流注射泵系统精确控制，实现不同样品溶液的注入。
在试剂的测试过程中，注射溶液的速度对测试结果的精确性有一定程度的影响，注样速度较快对目标生物分子与第二敏感区表面的捕获抗体结合不利，同时也会造成通道中压强过大，进而可能会使溶液泄露；注样速度较慢不利于测试的时效性，使得时间成本大大增加。经过多次实验，本实现最终将所有样品液体的注射速率设置为1mL/h，在该速率下，目标生物分子PSA与第二敏感区表面的捕获抗体结合充分，同时不会出现溶液泄露的问题。
在一些实施例中，在进行目标生物分子PSA的检测前，可以对已经固定捕获抗体的第二敏感区进行稳定性测试。如图11所示，使用多通道微流注射泵系统对微流通道注入PBS缓冲液，设置注样速度为1mL/h，注射时间为30min的第二敏感区系统稳定性测试结果，其中采集信号为1s一次。对图11分析可得，该微流通道下第二敏感区输出的工作频率较为稳定，背景噪声的波动较为稳定，为后续目标样品的测试提供了有力的保障。
请参阅图12，图12为目标生物分子PSA使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料增大信号的原理示意图。
先将目标生物分子PSA抗原小分子与MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料复合，在该溶液通入微流通道的过程中，固定在声表波生物传感器表面的捕获抗体anti-PSA会与目标溶液中的PSA抗原小分子结合后，声表波生物传感器的工作频率会有一定程度的改变，整个结构类似于“三明治”。由于使用的MoS2@Cu2O-Au纳米材料复合物的质量比单独用检测抗体和纳米金复合物大很多，所以此种方法在声表波生物传感器表面与捕获抗体探针的结合会产生较为明显的质量负载，进而使得芯片的中心工作频率产生更大的漂移，使得信号得到了放大，检测灵敏度得到了提高。在进行目标生物分子PSA加MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料测试之前，将表面固定有捕获抗体探针的声表波生物传感器精确装入微流通道，检测通道密闭性，接入网络分析仪、多通道微流注射泵等仪器。
具体的检测步骤可以如下：
1.按照固定模实连接检测系统，相应检测软件依次打开，调试测试所需参数，获得稳定的输出信号。
2.设置微流注射泵注样速度为1mL/h，按下注样开关，PBS缓冲液缓慢注入第二敏感区。根据不同的注入时间，依次选择PBS溶液充满整个微型腔室且无气泡干扰时，启动对信号的数据采集。
3.PBS溶液持续通入约10分钟后，切换到目标生物分子PSA与MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料混合溶液，将一定浓度的PSA小分子输送至微流通道，保持注样速度为1mL/h。
4.目标生物分子PSA与MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料混合溶液持续通入微流通道中，等待声表波生物传感器的输出工作频率稳定后，一个浓度的生物目标分子PSA的测试流程完成，为保证实验的重复性，可多次进行同一浓度测试。
需要说明的是，测试不同浓度目标生物分子PSA，只需重复以上的测试步骤，一个浓度进行多次实验测试，得到不同浓度的目标生物分子PSA的测试结果。
如图13所示，图13是目标生物分子PSA使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料增大相应的检测图。从图13中可以观察到随着微流注射泵注样PBS缓冲液，声表波生物传感器的输出频率稳定10分钟后切换目标生物分子PSA与MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料混合溶液。加注样品溶液2min后生物传感器芯片的工作频率漂移有着显著的增大，最终频率漂移约7200Hz，与同为20ng/mL的PSA抗原溶液使用纳米金检测抗体复合物产生的800Hz频率漂移有着显著的提高。因此，证明了使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料能够显著增大声表波生物传感器的输出信号，增大其工作频率，提高目标生物分子PSA的检测极限。
图14为使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料对不同浓度目标生物分子PSA信号放大的实时检测结果示意图。首先利用多通道微流注射泵注入PBS缓冲液，设置流速为1mL/h，等待检测系统在PBS缓冲液稳定工作10分钟后，切换目标生物分子PSA与MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料混合溶液，流速同样设为1mL/h，注样时间约25分钟，能够保证目标生物分子PSA能够与第二敏感区固定的捕获抗体特异性结合。以上结合过程可在20分钟内完成，之后生物传感器芯片的工作频率趋于稳定。从图14中可以看出随着目标生物分子PSA浓度的升高，对应声表波生物传感器的输出工作频率有着更大的漂移，传感器芯片在目标生物分子PSA浓度为0.2-50ng/mL范围内展现出优异的测试性能，其中50ng/mL浓度的目标生物分子PSA最终的频率漂移可以达到-8000Hz左右，0.2ng/mL浓度的目标生物分子PSA也会产生-500Hz左右的频率漂移。此结果相比单独使用纳米金检测抗体复合物检测方法灵敏度和检测极限有着显著的提升。
在一些实施例中，在完成目标生物分子PSA检测之前，对该生物传感器芯片在PBS缓冲溶液下的稳定性进行探究，其背景噪声在50Hz左右；探究了直接法检测目标生物分子PSA抗原，浓度为100ng/mL的PSA溶液频率漂移为-800Hz左右，使用纳米金与PSA检测抗体复合物对浓度为20ng/mL的PSA产生的频率漂移同样为-800Hz左右，而使用MoS2@Cu2O-Au纳米复合材料来增大信号响应的方法可使得浓度为20ng/mL的PSA产生的频率漂移为-7200Hz左右，大大提升了声表波生物传感器的检测灵敏度。
综上，本申请实施例提供的前列腺特异性抗原的检测方法包括提供一声表波生物传感器，声表波生物传感器具有第一敏感区；在第一敏感区形成一自组装分子膜，并对自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区；在第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体；提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子；对MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液；通过第二敏感区对待检测溶液进行检测。本方案可以提高声表波生物传感器对目标生物分子的检测灵敏度。
以上对本申请实施例所提供的一种前列腺特异性抗原的检测方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (8)

1.一种前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，包括：
提供一声表波生物传感器，所述声表波生物传感器具有第一敏感区；
在所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并对所述自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区；
在所述第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体；
提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子；
对所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和所述目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液；
通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测。
2.如权利要求1所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，在所述提供MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和目标生物分子之前，还包括：
提供纳米Au颗粒、MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料；
基于所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料形成MoS2@Cu2O纳米材料复合物；
将所述纳米Au颗粒附着于所述MoS2@Cu2O纳米材料复合物的表面，形成MoS2@Cu2O-Au纳米复合物。
3.如权利要求2所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，所述提供纳米Au颗粒、MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料，包括：
利用一步还原法制备纳米Au颗粒，
利用水热法合成MoS2纳米材料和Cu2O纳米材料。
4.如权利要求2所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，所述基于所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料形成MoS2@Cu2O纳米材料复合物，包括：
基于水热法、所述MoS2纳米材料和所述Cu2O纳米材料合成MoS2@Cu2O纳米材料复合物。
5.如权利要求1所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，所述在所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并对所述自组装分子膜进行活化处理，得到第二敏感区，包括：
利用3-巯基丙酸所述第一敏感区形成一自组装分子膜，并采用活化剂对所述自组装分子膜进行活化处理，生成中间酯，得到第二敏感区。
6.如权利要求1所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，所述对所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物和所述目标生物分子进行复合处理，得到待检测溶液，包括：
使用微量天平称取预设重量的MoS2@Cu2O-Au纳米复合物；
将所述MoS2@Cu2O-Au纳米复合物加入盛有去离子水的烧杯中超声处理第一预设时长；
使用微量移液器将待检测抗体溶液加入所述烧杯中；
将所述烧杯放入恒温磁力搅拌器上进行搅拌处理；
去除所述烧杯中的上层清液，得到所述待检测溶液。
7.如权利要求1所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，所述在所述第二敏感区上固定目标生物分子的捕获抗体，包括：
使用微量移液器在所述第二敏感区依次滴加PBS缓冲液、目标生物分子的捕获抗体；
将所述声表波生物传感器放入湿盒中，再将所述湿盒放置于恒温冰箱进行培育；
培育完成后，从所述湿盒中取出所述声表波生物传感器，并使用PBS缓冲液对所述声表波生物传感器的第二敏感区进行冲洗；
在所述第二敏感区上滴加牛血清白蛋白溶液，并将所述声表波生物传感器放置在室温第二预设时长；
使用PBS缓冲液对所述声表波生物传感器的第二敏感区进行冲洗；
利用氮气枪对所述第二敏感区上的残留物进行冲洗，从而使得所述目标生物分子的捕获抗体固定于所述第二敏感区上。
8.如权利要求1所述的前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，所述通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测，包括：
将具有所述第二敏感区的所述声表波生物传感器放入微流通道；
基于第三预设时长和预设速度对所述微流通道注入PBS缓冲液；
当到达所述预设时长时，以所述预设速度将所述待检测溶液注入所述微流通道，所述声表波生物传感器通过所述第二敏感区对所述待检测溶液进行检测。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101493452A (zh) * 2008-11-13 2009-07-29 港龙生物科技有限公司 压电陶瓷传感器
CN107085024A (zh) * 2017-05-16 2017-08-22 山东理工大学 一种检测乙肝病毒标志物的免疫传感器的制备方法及应用
CN108593765A (zh) * 2018-04-04 2018-09-28 深圳大学 一种基于声表面波模式的生物传感器及其检测方法
CN109187974A (zh) * 2018-08-02 2019-01-11 深圳大学 癌胚抗原传感器及其制作方法、癌胚抗原浓度检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101493452A (zh) * 2008-11-13 2009-07-29 港龙生物科技有限公司 压电陶瓷传感器
CN107085024A (zh) * 2017-05-16 2017-08-22 山东理工大学 一种检测乙肝病毒标志物的免疫传感器的制备方法及应用
CN108593765A (zh) * 2018-04-04 2018-09-28 深圳大学 一种基于声表面波模式的生物传感器及其检测方法
CN109187974A (zh) * 2018-08-02 2019-01-11 深圳大学 癌胚抗原传感器及其制作方法、癌胚抗原浓度检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG ZHANG ET AL: "A Microfluidic Love-Wave Biosensing Device for PSA Detection Based on an Aptamer Beacon Probe" *

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