CN113999843A - 用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒 - Google Patents

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李艳
肖樱艳
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Abstract

本发明涉及一种用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒。该用于检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的核酸组合产品包括引物对，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。上述检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品包括的引物对，针对火山类芽孢杆菌的特异性很强，而且灵敏度很高，在火山类芽孢杆菌含量极低的情况下也能将其检出。

Description

用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒。
背景技术
急性胰腺炎是消化系统常见的危重疾病，发病率逐年升高。急性胰腺炎的总病死率约为5％，重症急性胰腺炎患者病死率仍较高，已成为严重危及我国人民健康和生命的重大疾病之一。因此尽早辨别急性胰腺炎患者，及时对患者进行对症治疗，对降低患者的死亡率至关重要。
急性胰腺炎的病理机制主要是各种原因导致的胰酶的过早激活而引发的胰腺自发性炎症。目前对急性胰腺炎的检测主要有两种手段：通过血清酶学检测血清淀粉酶和/或脂肪酶的含量来判断是否可能为胰腺炎，以及通过检测血清标志物血清C反应蛋白(CRP)、尿素氮(BUN)、红细胞压和肌酐来判断胰腺炎是否重症化。然而这两种手段都是辅助检测手段，敏感性不够高，并且需要介入手段才能获得进行检测的样本。
发明内容
本发明研究发现，胰腺炎患者肠道中的火山类芽孢杆菌可代谢睾酮，能够通过影响机体睾酮水平改变内分泌代谢状态，促进和加剧急性胰腺炎的发生。火山类芽孢杆菌在正常人群粪便或口腔中几乎不含有或含量极低，而在急性胰腺炎患者粪便或唾液中含量明显增加。通过检测胰腺炎患者粪便或唾液中的火山类芽孢杆菌含量，有利于早期急性胰腺炎的诊断，并对胰腺炎预后预测具有指导意义。基于此，有必要提供一种用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒。
一种用于检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的核酸组合产品，该核酸组合产品包括引物对，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。
上述检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的核酸组合产品包括的引物对，针对火山类芽孢杆菌的特异性很强，而且灵敏度很高，在火山类芽孢杆菌含量极低的情况下也能将其检出。
在其中一个实施例中，上述核酸组合产品还包括与上述引物对对应的检测探针，检测探针上连接有第一荧光报告基团。
在其中一个实施例中，上述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在其中一个实施例中，上述核酸组合产品还包括内参引物对和该内参引物对应的内参探针，内参探针上连接有第二荧光报告基团。
在其中一个实施例中，上述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.4～5所示。
在其中一个实施例中，上述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
在其中一个实施例中，上述第一荧光报告基团和上述第二荧光报告基团分别独立地选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种。
一种检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的试剂盒，包括以上任一实施例的核酸组合产品。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应辅助试剂和DNA提取试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括PCR内部控制品，该PCR内部控制品包括内部控制核酸片段和内部控制引物对，该内部控制核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该内部控制引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.8～9所示。
附图说明
图1为1.0×103拷贝数～1.0×106拷贝数的GAPDH基因标准品的qPCR扩增曲线；
图2为1.0×103拷贝数～1.0×106拷贝数的内部阳性控制基因标准品的qPCR扩增曲线；
图3为急性胰腺炎患者火山类芽孢杆菌qPCR扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文所述的术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。所述的“TaqMan荧光探针”是一种寡核苷酸探针，其5’端携带荧光报告基团，3’端携带荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq聚合酶将探针酶切降解，荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
本申请一实施方式提供了一种用于检测火山类芽孢杆菌(Paenibacilluscineris)的核酸组合产品，该核酸组合产品包括引物对，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.1～2所示。
上述检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的核酸组合产品包括的引物对，针对火山类芽孢杆菌的特异性很强，而且灵敏度很高，在火山类芽孢杆菌含量极低的情况下也能将其检出。
具体地，上述火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的是Bruker MB主库菌种(DB5989_Specieslist total)，编号1587。SEQ ID No.1的核苷酸序列为5’-CTGGAAACTGGGTGACTTG-3’，SEQ ID No.2的核苷酸序列为5’-CGTCAGTTACAGCCCAGAGA-3’。
在其中一个实施例中，上述核酸组合产品还包括与上述引物对对应的检测探针，检测探针上连接有第一荧光报告基团。
在其中一个实施例中，上述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。具体地，SEQ ID No.3的核苷酸序列为5’-GCAGAAGAGGAGAGTGG-3’。
在一个可选的具体示例中，上述检测探针为TaqMan荧光探针，5’端连接有第一荧光报告基团TET，3’端连接有第一荧光淬灭基团TAMRA。可以理解的是，在其他一些具体示例中，第一荧光报告基团不限于是TET，第一荧光淬灭基团也不限于是TAMRA，荧光基团的选择只需要满足第一荧光报告基团受设备激发发射的波长是第一荧光淬灭基团的激发波长即可，第一荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，第一荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。
在其中一个实施例中，上述核酸组合产品还包括内参引物对与内参引物对应的内参探针，内参探针上连接有第二荧光报告基团。
在一个可选的具体示例中，内参引物对扩增的内参基因片段为人源GAPDH基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。具体地，SEQ ID No.11的核苷酸序列为5’-TGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATC-3’。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述核酸组合产品包括的内参引物对还可以是GAPDH基因的其他区段，也可以是其他内参基因片段，例如β-actin、Cyclophilin、HPRT或GUS。
在其中一个实施例中，上述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.4～5所示。具体地，SEQ ID No.4的核苷酸序列为5’-TGAATGGGCAGCCGTTAGGA-3’，SEQ ID No.5的核苷酸序列为5’-GATTTACCAGAGAATAATCTA-3’。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述内参引物对的核苷酸序列可以是其他能扩增GAPDH、β-actin、Cyclophilin、HPRT或GUS基因片段的序列。
在其中一个实施例中，上述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。具体地，SEQ ID No.6的核苷酸序列为5’-GGCCCGATTTCTCCTCC-3’。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述内参探针的核苷酸序列可以是与上述内参引物对对应的其他序列。
在一个可选的具体示例中，上述内参探针为TaqMan荧光探针，5’端连接有第二荧光报告基团TET，3’端连接有第二荧光淬灭基团TAMRA。可以理解的是，在其他一些具体示例中，第二荧光报告基团不限于是TET，第二荧光淬灭基团也不限于是TAMRA，荧光基团的选择只需要满足第二荧光报告基团受设备激发发射的波长是第二荧光淬灭基团的激发波长即可，第二荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，第二荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。
本申请一实施方式还提供了一种检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的试剂盒，包括以上任一实施例的核酸组合产品。
在其中一个实施例中，该试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应辅助试剂和DNA提取试剂中的至少一种。
在一个可选的具体示例中，上述阳性对照品为含有上述火山类芽孢杆菌的总DNA样品。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述阳性对照品可以是其他含有该火山类芽孢杆菌的DNA样品。
在一个可选的具体示例中，上述阴性对照品为去离子水。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述阴性对照品可以是其他不含上述火山类芽孢杆菌的样品。
在一些实施例中，上述PCR反应辅助试剂包括PCR Premix。在一个可选的具体示例中，PCR Premix中包括Mg2+、Taq聚合酶、dNTPs、UNG酶、dUTP和反应缓冲液。反应缓冲液的目的是给Taq聚合酶提供一个最适酶催反应条件。可以理解的是，反应缓冲液可以选用但不限于10mmol/L～50mmol/L的Tris-HCl(pH＝8.3～8.8，20℃)。
在一些实施例中，上述DNA提取试剂包括细胞裂解剂和DNA纯化试剂。可以理解的是，细胞裂解剂包括去污剂和盐。去污剂的作用是使蛋白质变性、破坏膜结构和去除与核酸相互作用的蛋白质；盐的作用是提供合适的裂解环境、抑制核酸酶对核酸的降解以及维持核酸结构稳定。在一个可选的具体示例中，去污剂选自SDS、Triton X-100、NP-40和Tween20中的一种。在一个可选的具体示例中，盐选自Tris、EDTA和NaCl中的至少一种。DNA纯化是为了保证后续实验不受杂质干扰以及防止DNA被降解，DNA纯化剂可以选用但不限于酚氯仿和醇，能实现DNA纯化的试剂均可以采用。
可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述试剂盒可以不包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应辅助试剂和DNA提取试剂中的任意一些试剂，不包括的试剂可以合理从外部获得。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括PCR内部控制品。上述PCR内部控制品包括内部控制核酸片段和内部控制引物对，内部控制核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，内部控制引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.8～9所示。
具体地，上述PCR内部控制品是指监控是否存在PCR抑制物及反应系统(包括试剂、PCR程序、荧光采集)是否正常的DNA序列。在PCR体系中加入内部控制品能够辨别假阴性和假阳性。SEQ ID No.7的核苷酸序列为5’-AATGAATGGGCAGCTAGGAACTGCCGGTGACTAACGCGCTCCTGCCGATGGGTGAGTCGCGGCGGGGAAGTCAGGTGGGCGAGAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGATGCTTTCAGATTTCTCTGGAC-3’，SEQ ID No.8的核苷酸序列为5’-AATGAATGGGCAGCTAGGAA-3’，SEQ IDNo.9的核苷酸序列为5’-GTCCAGAGAAATCTGAAAGCATCC-3’。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述试剂盒中可以没有PCR内部控制品，内部控制核酸片段也可以是不会干扰靶序列扩增的其他片段，内部控制引物对是与内部控制核酸片段对应的引物对。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括与PCR内部控制品对应的内部控制探针，内部控制探针上连接有与第一荧光报告基团不同的第三荧光报告基团。
在其中一个实施例中，上述内部控制探针的序列如SEQ ID No.10所示。具体地，SEQ ID No.10的核苷酸序列为5’-GCCGATGGGTGAGTCGC-3’。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述内部控制探针的核苷酸序列可以是与上述内部控制引物对对应的其他序列。
在一个可选的具体示例中，上述内部控制探针为TaqMan荧光探针，5’端连接有第三荧光报告基团FAM，3’端连接有第三荧光淬灭基团TAMRA。可以理解的是，在其他一些具体示例中，第三荧光报告基团不限于是FAM，第三荧光淬灭基团也不限于是TAMRA，荧光基团的选择只需要满足第三荧光报告基团受设备激发发射的波长是第三荧光淬灭基团的激发波长，且第三荧光报告基团与第一荧光报告基团的发射波长不一样即可。第三荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，第三荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。
本申请一实施方式还提供一种检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的方法，该方法包括以下步骤：提取样品总DNA；及利用上述试剂盒对样品进行qPCR检测。
在一个可选的具体示例中，qPCR的程序设置为50℃10s，95℃10min，然后再经过95℃15s和62℃1min，共35个循环。可以理解的是，在其他一些具体示例中，qPCR程序可以合理调整。
进一步地，在qPCR检测之后，还包括步骤：分析火山类芽孢杆菌的qPCR结果，确定火山类芽孢杆菌的含量。
具体地，火山类芽孢杆菌的含量，可以是相对含量，也可以是绝对含量，可以合理选择其中一种。
上述检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的方法，检测火山类芽孢杆菌的敏感性达0.01％，即10000个细胞中有一个火山类芽孢杆菌就可以被检测出。检测火山类芽孢杆菌的特异性高，利用该火山类芽孢杆菌的引物和探针，能够准确地识别火山类芽孢杆菌。此外，该方法中引入的PCR内部控制品，能够对检测过程进行监控，有效避免假阳性或假阴性。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.获取样品DNA
获取临床20例急性胰腺炎患者和10例健康人的粪便样品，分别记为为急性胰腺炎患者1～急性胰腺炎患者20和健康人1～健康人10。采用DNA提取试剂盒(QIAampPowerFecal DNA Kit，No.12830-50)提取急性胰腺炎患者和健康人粪便样品总DNA。将提取得到的样品总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，若一条泳道上只出现一条带，则认为提取得到的DNA是完整的。通过紫外分光光度计测定提取得到的DNA在260nm和280nm处的光密度值，当OD260/OD280在1.5～1.9之间时，认为提取得到的DNA纯度可接受，并计算其浓度，用0.1％DEPC处理的水调节所提取的各样品DNA至相同浓度。
2.配制qPCR反应体系
根据表1配制待测样品火山类芽孢杆菌检测体系。选择人源GAPDH基因作为内参基因，根据表2配制待测样品GAPDH基因检测体系，根据表3配制GAPDH基因标准曲线检测体系。内部阳性控制基因片段是人工合成的内部控制核酸片段，根据表4配制内部阳性控制基因标准曲线检测体系。其中，内部阳性控制基因片段标准品和GAPDH基因片段标准品分别为稀释至1.0×103、1.0×104、1.0×105和1.0×106拷贝数的梯度标准品。本申请所用的核苷酸序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
配制完成的反应体系中含有2.5mmol/L～4.0mmol/L的Mg2+、2U的Taq聚合酶、0.2mmol/L～0.4mmol/L的dNTPs、0.2U～1.0U的UNG酶和0.3mmol/L～0.6mmol/L的dUTP。
表1
Figure BDA0003340569280000101
Figure BDA0003340569280000111
表2
Figure BDA0003340569280000112
表3
Figure BDA0003340569280000113
表4
Figure BDA0003340569280000114
Figure BDA0003340569280000121
3.qPCR检测
将上述配制好的qPCR反应体系在LightCycler上按照表5的程序进行qPCR扩增。
表5
Figure BDA0003340569280000122
4.qPCR结果分析
图1为1.0×103拷贝数～1.0×106拷贝数的GAPDH基因标准品的qPCR扩增曲线；图2为1.0×103拷贝数～1.0×106拷贝数的内部阳性控制基因标准品的qPCR扩增曲线；图3为急性胰腺炎患者火山类芽孢杆菌qPCR扩增曲线。
分析待测样品火山类芽孢杆菌检测体系中内部阳性控制基因扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效；如果其Ct值大于35，提示检测失败，需要重新采样进行检测；如果其Ct值处于33～35之间，需要二次检测，二次检测Ct值小于35时，判定为检测有效，否则认为检测失败，需要重新采样进行检测。当检测有效时，提示数据可用，进行下一步计算，分别由火山类芽孢杆菌及GAPDH基因的Ct值，计算得出两者之差，即ΔCt。最后，qPCR结果采用软件分析，并归一化计算样本数据，得到火山类芽孢杆菌相对于GAPDH基因的相对含量(结果如表6所示)，将相对含量大于500定义为高表达，小于100定义为低表达。
表6
Figure BDA0003340569280000131
Figure BDA0003340569280000141
从表6中可知，根据此方法检测出的20例火山类芽孢杆菌高表达样品均来自于急性胰腺炎患者，10例低表达样品均来自于健康人。
5.与细菌培养法结果的比较
将上述20例急性胰腺炎患者和10例健康人的粪便样品同时用细菌培养法对火山类芽孢杆菌的含量进行检测。检测结果(如表7所示)显示，20例急性胰腺炎患者样品中有19例为火山类芽孢杆菌高表达，1例为低表达，10例健康人样品均为火山类芽孢杆菌低表达。
表7
Figure BDA0003340569280000142
将上述本申请的qPCR检测火山类芽孢杆菌的方法得出的结果与细菌培养法的结果进行比较，可以看出，本申请的qPCR检测火山类芽孢杆菌的方法灵敏度达100％，高于细菌培养法，特异性达90.91％，阳性预测值为95％，阴性预测值也达到100％。此外，本申请实验总耗时约4h，而细菌培养法需要在37℃恒温培养箱中培养18h～24h，本申请检测方法耗时远短于细菌培养法，并且可重复性强，多次重复实验结果一致。
以上结果说明本申请的检测火山类芽孢杆菌的方法能够准确检测出火山类芽孢杆菌的含量高低，通过细菌培养法的验证，可看出本发明所利用的火山类芽孢杆菌所对应的核酸组合产品能够作为检测火山类芽孢杆菌的有效工具，并且有利于早期急性胰腺炎的诊断，对急性胰腺炎预后的预测具有指导意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 李艳
<120> 用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctggaaactg ggtgacttg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgtcagttac agcccagaga 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gcagaagagg agagtgg 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgaatgggca gccgttagga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
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ggcggggaag tcaggtggg 79
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<211> 20
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<400> 8
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtccagagaa atctgaaagc atcc 24
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gccgatgggt gagtcgc 17
<210> 11
<211> 158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgaatgggca gccgttagga aagcctgccg gtgactaacc ctgcgctcct gcctcgatgg 60
gtggagtcgc gtgtggcggg gaagtcaggt ggagcgaggc tagctggccc gatttctcct 120
ccgggtgatg cttttcctag attattctct ggtaaatc 158

Claims (10)

1.一种用于检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的核酸组合产品，其特征在于，所述核酸组合产品包括引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。
2.根据权利要求1所述的核酸组合产品，其特征在于，所述核酸组合产品还包括与所述引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有第一荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的核酸组合产品，其特征在于，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求2～3任一项所述的核酸组合产品，其特征在于，所述核酸组合产品还包括内参引物对和所述内参引物对应的内参探针，所述内参探针上连接有第二荧光报告基团。
5.根据权利要求4所述的核酸组合产品，其特征在于，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.4～5所示。
6.根据权利要求5所述的核酸组合产品，其特征在于，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
7.根据权利要求5～6任一项所述的核酸组合产品，其特征在于，所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团分别独立地选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种。
8.一种检测火山类芽孢杆菌(Paenibacillus cineris)的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的核酸组合产品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应辅助试剂和DNA提取试剂中的至少一种。
10.根据权利要求8～任一项9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR内部控制品，所述PCR内部控制品包括内部控制核酸片段和内部控制引物对，所述内部控制核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述内部控制引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.8～9所示。
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