CN113999287B - 一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向半乳糖凝集素‑10的多肽抑制剂，其氨基酸序列为：Leu‑Tyr‑Ile‑Arg‑Gly‑Met‑Ser‑Trp‑Ser‑Gly‑Trp‑Ser‑Ala‑Tyr‑Asp‑Tyr，Met采用乙炔基锍盐修饰。本发明还提供了上述多肽抑制剂的制备方法。本发明的多肽抑制剂，对其中的氨基酸Met采用乙炔基锍盐修饰的方法，通过配体诱导邻近，Met的锍盐可作为反应基团，多肽抑制剂与Gal10蛋白的富电子比如—OH或者酚羟基反应，从而与Gal10实现共价连接，抑制其分子间的相互作用，达到抑制Gal10蛋白自结晶以及调控蛋白液固相变的目的。

Description

一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂及其制备方法和 用途

技术领域

本发明属于生物化学和药物化学领域，涉及一种多肽，具体来说是一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂及其制备方法和用途。

背景技术

蛋白质在体内自发结晶是一种很少见的现象，结晶常与病理学密切相关，例如痛风患者的关节中，尿酸晶体引起痛苦的炎症发作；动脉粥样硬化斑块中，胆固醇晶体是疾病晚期的一个标志。哮喘病人的痰液中观察到一种六角形，底面呈双锥体形的晶体，后被取名为Charcot-Leyden晶体，简称CLC，在除哮喘外的支气管炎、过敏性鼻炎和鼻窦炎等疾病中都有所发现。CLC后被证实是一种名为半乳糖凝集素-10(galectin-10，简写为Gal10)的分泌蛋白，这是嗜酸性粒细胞中含量最丰富的蛋白之一。不过，在细胞内，Gal10以溶解形式存在，只有在分泌出去作为免疫防御时才形成晶体。

半乳糖凝集素(Galectin)是一类对β-半乳糖残基具有特异性结合能力的动物凝集素，目前已发现的有16种，其结构上具有相似性，并且广泛的参与到生物体的多种生理活动中。所有的Galectins均含有高度识别的糖基识别结构域(Carbohydrate RecognitionDomain，CRD)，与N-乙酰基乳糖胺的结合需要Gal的4-OH和6-OH，以及N-乙酰基葡萄糖胺的3-OH。每个糖基识别结构域含有1个结合糖分子的位点，构成糖分子结合位点的氨基酸序列极其保守，包括色氨酸，组氨酸和天冬酰胺。为方便起见，由A、B、C和D标记，C处是由保守氨基酸序列形成的半乳糖结合位点。半乳糖凝集素-10(又名Charcot-Leyden crystalprotein，夏科-莱登晶体蛋白)是原型半乳糖凝集素家族成员之一，由142个氨基酸组成。Galectin-10的晶体结构显示其三维结构由两个较短的α-螺旋，β-折叠以及无规则卷曲构成，两个α-螺旋分别连接F2-S3链和F5-S2链。

半乳糖凝集素-10广泛分布于嗜酸性粒细胞中，在体内能够自发的形成晶体。研究表明，半乳糖凝集素-10参与多种嗜酸性粒细胞相关的疾病反应，例如哮喘、嗜酸性粒细胞膀胱炎、肥大细胞病变及过敏性皮炎等，并且在调节淋巴细胞功能中发挥重要作用，因此可作为开发新型诊断策略和设计创新药物的靶点。

2019年，比利时根特大学、Flanders生物技术研究所(VIB)和argenx生物技术公司的科学家们合作，在Science杂志上发文“Protein crystallization promotes type2immunity and is reversible by antibody treatment”，解开了与哮喘、过敏性鼻炎等呼吸道炎症有关的一个世纪谜团，并以此为基础，开发出一种有效逆转疾病的潜在创新疗法。在这篇文章中指出，Gal10在溶液中通常以二聚体的形式存在，且二聚体是对称的，形成结晶的作用面主要有两个(C1和C2面)。C1面恰好位于两个二聚面暴露于外面的位置，并未参与到二聚的相互作用，正是暴露，才更容易与其他dimer相互作用，在这里，端头的Tyr69与另一个Dimer的Tyr69’容易形成π-π相互作用而使结构更稳定；C2是两个由两个位于边缘beta链和另一单体的beta-strand形成的。Gal10形成结晶的过程也可以看成是蛋白质的聚集过程，并且也是蛋白质分子从液相到固相转变的相分离过程，是自己识别自己的自组装的过程，其二聚体通过不同的作用面与另一个二聚体相互作用，形成双锥体结构(成核中心)，不同的双锥体结构之间再相互作用形成最后的结晶。

进一步，作者通过噬菌体展示技术筛选出针对Gal10晶体的抗体，这些抗体可以在实验室培养皿中几分钟内溶解CLC，并在几小时内溶解患者粘液中的CLC。在哮喘小鼠模型中使用这些抗体可以明显减少肺部炎症、肺功能改变和粘液产生。

目前针对Gal10结晶的抑制剂还鲜有报道，因此，基于已有的抗体结构，可以对接下来开发相关的多肽及小分子等抑制剂提供指导。

目前针对Gal10蛋白的多肽抑制剂还尚无报道，本发明基于Gal10与已开发的抗体相互作用的晶体结构，从抗体结构出发，截取抗体与Gal10蛋白作用的最短序列进行研究，利用各种蛋白-蛋白相互作用的表征手段，通过合理设计多肽实现对Gal10自结晶的干扰，包括抑制Gal10结晶的形成以及溶解已经形成的结晶，并在疾病的治疗上起到一定的作用。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂及其制备方法和用途，所述的这种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂及其制备方法和用途要解决现有技术中对于半乳糖凝集素-10参与多种嗜酸性粒细胞相关的疾病治疗效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂(C1-8-3)，其氨基酸序列为：Leu-Tyr-Ile-Arg-Gly-Met(锍盐修饰)-Ser-Trp-Ser-Gly-Trp-Ser-Ala-Tyr-Asp-Tyr(如SEQ ID NO.1所示)。

进一步的，所述的一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂的结构式如下所示：

，

R为乙酰基或者FAM。

进一步的，其中N端氨基采用FITC荧光染料或乙酰化修饰，Met氨基酸侧链用乙炔基锍盐修饰。

本发明还提供了上述的一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)一个制备寡肽固相树脂的步骤：通过固相合成方法将目标多肽负载在MBHA树脂上；

(2)一个制备乙炔基锍盐多肽的步骤：多肽合成结束后，用体积百分比浓度为95％的三氟乙酸溶液剪切多肽，所述的三氟乙酸溶液中，三氟乙酸、H₂O和三异丙基硅烷的体积比为95:2.5:2.5，然后滤掉树脂吹干，用乙腈和水溶解，再加入占上述总的物料比为1％体积的甲酸，再加入溴丙炔摇过夜，溶液直接用制备型反相HPLC纯化，产物经MS鉴定，冻干收集。

本发明还提供了上述的靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂在制备治疗由半乳糖凝集素-10自结晶引起的疾病中的应用。

本发明还提供了上述的靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂在制备治疗过敏性鼻炎的药物中应用。

本发明还提供了上述的靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂在在制备治疗由半乳糖凝集素-10自结晶引起的免疫性疾病中的应用。

本发明通过对Gal10蛋白结构的分析，Gal10暴露的Tyr69是重要的互作位点，Tyr69在Gal10结合课题组开发的独特的锍盐共价体系，通过截取Gal10互作面所参与的多肽序列，考察多肽与Gal10蛋白的结合能力，在筛选出具有理想的结合能力的多肽序列后，将多肽不同位置的氨基酸突变成Met，再对多肽抑制剂上的Met进行锍盐修饰。利用具有良好结合能力的多肽配体诱导靠近Gal10，在生理条件下再与Gal10暴露的富电子基团-OH进行反应，形成稳定的多肽蛋白共价复合物，阻止蛋白分子内以及分子间的互作。这对半乳糖凝集素-10自结晶的抑制提供了很好的成药策略，也为治疗半乳糖凝集素-10自结晶导致的一系列的疾病的治疗提供了另一种可能。

本发明提出的特异性靶向半乳糖凝集素-10并抑制其自结晶的多肽抑制剂，对其中的氨基酸Met采用乙炔基锍盐修饰的方法，通过配体诱导邻近，Met的锍盐可作为反应基团，多肽抑制剂与Gal10蛋白的富电子比如—OH或者酚羟基反应，从而与Gal10实现共价连接，抑制其分子间的相互作用，达到抑制Gal10蛋白自结晶以及调控蛋白液固相变的目的。通过实验证明，本发明的多肽抑制剂与Gal10蛋白有较好的结合，并具有一定程度地抑制蛋白自结晶的效果，该多肽为调控液固相分离提供了新的策略，也为过敏性鼻炎药物的开发提供了新的可能。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。目前Gal10蛋白的天然配体还尚未找到，因此针对Gal10结晶的抑制剂还鲜有报道。多肽相对于小分子，其分子量介于小分子(小于500Da)与大分子(大于5000Da)之间，其结构具有更大的尺寸和足够高的柔性，可以更好地与大且平坦的蛋白-蛋白作用界面结合，可以减小脱靶效应从而降低毒性成为又一大研究热点。再者，多肽的多样性可以通过改变氨基酸的数目以及种类实现，体外合成以及修饰改造也更加容易完成。Gal 10形成结晶的过程也可以看成是蛋白质的聚集过程，是自己识别自己的自组装的过程，本质上就是蛋白-蛋白相互作用(分子间和分子内)，Gal 10在溶液中通常以二聚体的形式存在，二聚体通过不同的作用面与另一个二聚体相互作用，形成双锥体结构(成核中心)，不同的双锥体结构之间再相互作用形成最后的结晶。鉴于以上特点，多肽在调控蛋白-蛋白相互作用上具有独特的优势，也一直是药物研发的热点。本发明所述的多肽抑制剂能与蛋白上的-OH共价结合，从而形成稳定的多肽蛋白共价复合物，阻止蛋白分子内以及分子间的互作。利用此多肽实现对Gal10自结晶的干扰，包括抑制Gal10结晶的形成以及溶解已经形成的结晶，并在疾病的治疗上起到一定的作用，同时这也是多肽抑制蛋白液相-固相相分离的一次尝试。

附图说明

图1.Gal10(1-142)蛋白的表达与酶切图。(a)Gal10(1-142)蛋白的SDS-PAGE图；(b)Gal10(1-142)蛋白的WB图；(c)酶切后的SDS-PAGE图(最右边为文献报道图)。

图2.酶切后倒置显微镜下观察的结晶图。

图3.基于C2平面设计的多肽以及在不同的Buffer和温度时间下的结合情况。(a)报道的抗体与Gal10的结构图以及MOE预测二聚面的关键氨基酸图；(b)前两张为Tris中的结合图，后两张为PBS的结合图；(c)分别在37℃以及12小时Hepes和PBS缓冲液中的结合图；(d)基于C2平面设计的多肽序列。

图4.基于Gal10自结晶的C1平面设计多肽并测试与蛋白的结合能力。(a)为报道的抗体与Gal10的晶体结构图；(b)前三张为C1-1到C1-8的荧光偏振结果，第四第五张分别在Tris和Hepes的Buffer中测试C1-8、C24和C25多肽的结合图，最后一张为C1-8随着时间的变化荧光偏振图；(c)为基于C1平面设计的多肽序列。

图5.基于C1-8改造的多肽与Gal 10蛋白的结合情况。(a)为C1-8多肽与Gal10的结合图；(b)分别为C1-8-1到C1-8-6与Gal10蛋白的MST结合图；(c)为C1-8-1到C1-8-6与Gal10蛋白的FP图；(d)为C1-8改造的多肽。

图6.多肽抑制剂与蛋白的作用原理图。

图7.C1-8改造的锍盐多肽与蛋白的共价修饰情况。(a)为C1-8-3多肽以及C1-8-5与Gal10的共价修饰；(b)为C1-8-3与1μM Gal10在PBS不同温度下反应12h的情况；(c)C1-8-5与1μM Gal10在PBS不同温度下反应12h的情况。

图8.Gal10单体纯化过程中的体积排阻色谱。

图9.固相合成接肽路线图。

图10.多肽C1-8-3-FAM的MS图。

具体实施方式

实施例1一种靶向半乳糖凝集素-10的锍盐多肽的制备方法

制备乙炔基锍盐多肽：通过固相合成方法将目标多肽负载在MBHA树脂上，多肽合成结束后，用体积百分比浓度为95％的三氟乙酸(TFA：H₂O：三异丙基硅烷的体积比为＝95:2.5:2.5)剪切多肽，滤掉树脂吹干，用乙腈和水溶解，加入占上述总的物料比为1％体积的甲酸，再加入溴丙炔摇过夜。溶液直接用制备型反相HPLC纯化。产物经MS鉴定(以C1-8-3-FAM为例，即C1-8-3的R基团为FAM，MS图如图10所示)，冻干收集。

实施例2Gal10的表达与纯化

首先，利用分子克隆技术构建了pet28a-Gal10蛋白(1-142，Uniprot Q05315)的质粒，并将其转入到DH5α感受态细胞进行扩增，扩增之后的质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，挑菌小摇37℃放大并诱导(16℃，1mM IPTG)进行蛋白的表达。破菌并用GE的5mL的His-Trap^TM FF Crude镍柱纯化。从图1中可以看出蛋白与镍柱结合后，用50％(即250mM咪唑)洗脱，在15kda有明显的条带(如图1所示，与文献报道一致)，说明菌液的培养条件以及诱导时间均较为合适，可以成功地将目的蛋白诱导出来，且纯化的蛋白纯度＞90％。之后根据实验需要使用Superdex^TM200 10/300GL分子筛或Desalting柱进行纯化并脱盐，蛋白纯化过程均在4℃进行(图8)。

酶切后在倒置荧光显微镜下观察：如图2所示，经过不同条件比较，最终发现1.9ug/uL，100uL的体系，过夜16h，可以在显微镜下看到明显的结晶，与文献报道的形态一致；相反，未酶切的蛋白在高浓度时容易形成沉淀，形态相对不规则，并且不酶切不容易把握蛋白结晶浓度，造成蛋白大量损失，因此应选择浓缩到合适浓度后在选择酶切观察结晶。

实施例3基于Gal10自结晶的C1和C2平面设计多肽并测试与蛋白的结合能力

首先基于C2平面以及二聚面设计多肽(图3d)，所有的多肽均采用固相合成(图9)，C2是两个由两个位于边缘beta链和另一单体的beta-strand形成的，通过预测猜想C2平面中可能发挥作用的beta-strand的关键氨基酸以及维持二聚面的一些起作用的氨基酸残基，设计了C21-C25多肽和D1多肽，开始先用荧光偏振的方法测试多肽与Gal10可溶蛋白的结合能力。C21-C22以及D1多肽在Tris和PBS的缓冲液中和蛋白几乎没有结合(图3b)，在buffer中加入DTT，常温下孵育0.5h，在Hepes缓冲液中C24和C25有弱的结合(Kd大于25uM)，但在Tris和PBS中没有看到结合的趋势(图3b,3c)。

之后又尝试根据C1结合面设计多肽，从已报道的抗体与Gal10蛋白的结合模式可以看出(图4a)，C1平面对Gal10自结晶的贡献更大，因此对比已报道的抗体序列分析后，设计的多肽序列如图4c所示(C1-1至C1-11)，并与C2平面设计的多肽进行对比(图4b)，C1面恰好位于两个二聚面暴露于外面的位置，并未参与到二聚的相互作用，正是暴露，才更容易与其他dimer相互作用，在这里，端头的Tyr69与另一个Dimer的Tyr69’容易形成π-π相互作用而使结构更稳定。如图3a所示，不管是二聚体还是与抗体互作，Tyr69处确实都显示出较高亲和力，为关键氨基酸且3个抗体的结合模式类似，存在序列相似性。将50％(50mM Tris，300mM NaCl，250mM咪唑)洗脱下来的蛋白浓缩并置换到50mM Tris，300mM NaCl，2mM DTT，0.01％Tween 20的buffer中测FP，蛋白的终浓度为44.5μM，多肽终浓度为10nM，如图4b所示，C1-7、1-10、1-11多肽在45uM蛋白浓度以内与Gal10并无明显结合，1-8多肽有一定的结合，将其重复加样测FP，并且过夜测，随着时间推移，由于样品挥发以及荧光淬灭等，仪器读数误差增大。结合MST实验，总的来看，C1-8与Gal10蛋白的结合相对较好，结合常数大致在30-50μM。

实施例4基于C1-8改造的多肽与Gal10结合情况。

由于C24和C25多肽序列较长，因此选取C1-8作为修饰改造的起点。在荧光偏振的基础上，使用微量热泳动仪(Microscale thermophoresis，MST)再次验证了C1-8和Gal10蛋白的结合(如图4b和图5a所示)，结合常数大致在30-50μM。之后基于实验室开发的甲硫氨酸乙炔基锍盐修饰侧链的与蛋白共价反应体系，对C1-8不同位置进行甲硫氨酸位点突变，序列如图5d所示，在突变的Met上修饰乙炔基锍盐，并用MST(图5b)和荧光偏振(图5c)同时对多肽和Gal10的结合情况进行了评估。

体系使用的buffer为50mM Tris-HCl，300mM NaCl，2mM DTT，0.01％Tween 20。蛋白(PBS溶解)从-80℃取出，最高浓度为35μM。从结果来看，突变后的多肽结合有改善，但不明显。C1-8-5和C1-8-6多肽与蛋白的结合和C1-8接近，为了尽可能小地不破坏C1-8序列与蛋白的结合，将C1-8-5以及C1-8-3作为接下来与蛋白共价反应的对象(图6)。

实施例5C1-8改造的乙炔基锍盐多肽与蛋白的共价修饰情况。

反应之后随着多肽浓度越大，沉淀越多，怀疑蛋白在加入多肽后变得不稳定，因为control孔也加了DMSO，但并无沉淀，排除DMSO的影响。如图7所示，在没有加入多肽前，蛋白的位置在15-20kDa之间，孵育带FAM的锍盐多肽后，在20-25kDa之间有弱的荧光条带(最下面有大量没有反应的多肽)，而control孔无荧光条带，control孔中蛋白与DMSO混合(DMSO的量与1:10，即多肽10个当量的DMSO量一致)。考染之后加多肽的蛋白的分子量可以看到有位移，而control孔则无。总的来说，锍盐修饰的多肽可以和蛋白进行共价连接，证明Tyr69可作为目标多肽的共价位点，C1-8-3可作为Gal10蛋白的多肽共价抑制剂，在抑制Gal10自结晶以及治疗相关疾病的药物开发中具有很大的开发潜力。

序列表

<110> 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心

北京大学深圳研究生院

<120> 一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂及其制备方法和用途

<130> JSP12110587

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Tyr Ile Arg Gly Met Ser Trp Ser Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val Asn Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Asp His Arg

1 5

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val Asn Gly Gln Ser Ser Tyr Thr Phe

1 5 10 15

Asp His Arg

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Phe Glu Leu Ser Ile Ser Val Leu Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val

1 5 10 15

Asn Gly

<210> 6

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Phe Glu Leu Ser Ile Ser Val Leu Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val

1 5 10 15

Asn Gly Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Asp His Arg

20 25

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Pro Leu Ala Cys Phe Leu Asn Glu Pro Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Lys Asp Arg Asn Leu Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Pro Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

Trp

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Arg Ser Ser Asn Asn Ala Val Phe

1 5 10 15

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Ala Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ala Thr Pro Gly Asp Arg Leu Trp Tyr Tyr Arg Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Arg Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp

1 5 10 15

Arg Phe Ser Gly Ser Lys

20

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ala Leu Tyr Ile Arg Gly Ser Ser Trp Ser Gly Trp Ser Ala Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Gly Asn Phe Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Trp Tyr Gln Gln

20

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Asp Asn Pro Val Phe

1 5 10 15

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

1 5 10 15

Ser Gly Ser Ser Ser

20

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Leu Tyr Ile Arg Gly Ser Ser Trp Ser Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Leu Tyr Ile Arg Gly Ser Ser Trp Ser Gly Trp Ser Met Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Leu Tyr Ile Arg Gly Ser Ser Trp Ser Met Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Leu Tyr Ile Met Gly Ser Ser Trp Ser Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Met Leu Tyr Ile Arg Gly Ser Ser Trp Ser Gly Trp Ser Ala Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Leu Tyr Ile Arg Gly Ser Ser Trp Ser Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

Met

Claims (4)

1.一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂，其特征在于，其氨基酸序列为：Leu-Tyr-Ile-Arg-Gly-Met-Ser-Trp-Ser-Gly-Trp-Ser-Ala-Tyr-Asp-Tyr，Met采用乙炔基锍盐修饰。

2.根据权利要求1所述的一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂，其特征在于，其结构式如下所示：

，

R为乙酰基或者FAM。

3.根据权利要求1所述的一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂，其特征在于，其中N端氨基采用FITC荧光染料或乙酰化修饰，Met氨基酸侧链用乙炔基锍盐修饰。

4.权利要求1或2所述的一种靶向半乳糖凝集素-10的多肽抑制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)一个制备寡肽固相树脂的步骤：通过固相合成方法将带有Met的目标多肽负载在MBHA树脂上；

(2)一个制备乙炔基锍盐多肽的步骤：多肽合成结束后，用体积百分比浓度为95％的三氟乙酸溶液剪切多肽，所述的三氟乙酸溶液中，三氟乙酸、H₂O和三异丙基硅烷的体积比为95:2.5:2.5，然后滤掉树脂吹干，用乙腈和水溶解，再加入占上述总的物料比为1％体积的甲酸，再加入溴丙炔摇过夜，溶液直接用制备型反相HPLC纯化，产物经MS鉴定，冻干收集。

Images