CN113980859B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其菌株号为IMB009，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22995。该菌能够抑制真菌，可用于土壤改良，可提高植物抗性，尤其是提高植物对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的黄萎病的抗性。该菌对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单、容易保存，适合开发应用。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
随着世界气候条件的变化、土壤肥力的流失、大量化肥农药的使用、病虫害对作物的侵害等，农业面临着极大挑战。同时，全球人口数量的持续增加亟需粮食产量提高，过度的农业生产给脆弱的生态系统带来了沉重负担。在保证农业生产的同时减少农药和化肥的使用成为当务之急。促生根际细菌(PGPR)可取代化肥，也能够作为生防制剂以减少化学农药的使用，近年来备受人们重视。芽孢杆菌及其相关物种作为PGPR的重要成员，越来越被广泛地使用到农业生产中(Tian et al.,2020)。
菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求促进生长好、抗逆性强的微生物肥料生产用菌种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抑制真菌病害，和/或如何改良土壤，和/或如何提高植物抗病性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)IMB009。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)IMB009，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22995。该菌株已于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。下文简称解淀粉芽孢杆菌IMB009。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)IMB009菌体形状为短杆状，菌体平均大小为1.6μm×0.7μm，有芽孢。该菌在LB固体培养基上培养2天，菌落呈现圆形扁平状，乳白色，表面干燥，边缘不规则且带有凸起。解淀粉芽孢杆菌IMB009能够良好的利用多种碳源，但在仅含有α-乳糖的培养基中长势一般，利用较弱；解淀粉芽孢杆菌IMB009较容易利用铵根离子，不容易利用硝酸根离子；对于氨基酸作为唯一氮源试验中，解淀粉芽孢杆菌IMB009能够利用大多数氨基酸，利用程度不同，不能利用色氨酸、赖氨酸以及甲硫氨酸。解淀粉芽孢杆菌IMB009的MR实验结果显示为阴性，V.P实验呈阳性，H2S还原、纤维素水解和吲哚试验均为阴性，接触酶、淀粉水解、明胶液化试验均为阳性，硝酸盐试验呈阳性而亚硝酸盐呈阴性。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)IMB009的16S rDNA具有核苷酸序列如序列表中序列1的DNA片段，gyrA具有核苷酸序列如序列表中序列2所示的DNA片段，gyrB具有核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA片段，recA具有核苷酸序列如序列表中序列4所示的DNA片段，rpoB具有核苷酸序列如序列表中序列5所示的DNA片段。
解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
U1、解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物在抑制真菌或制备真菌抑制剂中的应用；
U2、解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物在改良土壤或制备土壤改良剂中的应用；
U3、解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物在提高植物抗病性或制备提高植物抗病性肥料中的应用。
上述应用中，所述真菌可选自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)、白腐垫壳孢(Coniella diplodiella(Speg.)Petrak&Sydow)、围小丛壳(Glomerella cingulata)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和苹果腐烂病菌(Valsamali)中的任一种或多种。
上述应用中，所述改良土壤可表现为抑制土壤中大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的含量与活性。
上述应用中，所述提高植物抗病性可表现为提高植物对黄萎病的抗性。所述黄萎病为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的植物病害。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了产品，本发明所提供的产品含有解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物。
所述产品可为菌剂、含有所述菌剂的微生态制剂、或含有所述菌剂或所述微生态制剂的生物肥料。
所述产品具体可为下述任一种产品：
V1、抑制真菌的产品；
V2、改良土壤的产品；
V3、提高植物抗病性的产品。
上述产品的活性成分可为解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物，上述产品的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述产品的其他活性成分本领域技术人员可根据产品的效果确定。
所述产品还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述产品中，解淀粉芽孢杆菌IMB009或/和解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述产品的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述产品中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上述产品中，所述真菌可选自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)、白腐垫壳孢(Coniella diplodiella(Speg.)Petrak&Sydow)、围小丛壳(Glomerella cingulata)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和苹果腐烂病菌(Valsamali)中的任一种或多种。
上述产品中，所述改良土壤可表现为抑制土壤中大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的含量与活性。
上述产品中，所述提高植物抗病性可表现为提高植物对黄萎病的抗性。所述黄萎病为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的植物病害。
上述产品的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
X1、所述的产品在抑制真菌中的应用；
X2、所述的产品在改良土壤中的应用；
X3、所述的产品在提高植物抗病性中的应用。
上文中，所述解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物可为解淀粉芽孢杆菌IMB009的发酵液。解淀粉芽孢杆菌IMB009的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养解淀粉芽孢杆菌IMB009，收集发酵液(含有解淀粉芽孢杆菌IMB009和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物。
解淀粉芽孢杆菌IMB009的培养物也属于本发明的保护范围。解淀粉芽孢杆菌IMB009的培养物是将解淀粉芽孢杆菌IMB009在微生物培养基中培养得到的发酵产物(如含有解淀粉芽孢杆菌IMB009和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有解淀粉芽孢杆菌IMB009和分泌到固体培养基内的物质)。
上述解淀粉芽孢杆菌IMB009的培养物具有下述W1-W3的至少一种功能：
W1、抑制真菌；
W2、改良土壤；
W3、提高植物抗病性。
培养所述的解淀粉芽孢杆菌IMB009的方法也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的培养所述的解淀粉芽孢杆菌IMB009的方法包括将所述解淀粉芽孢杆菌IMB009在培养基中培养的步骤。
制备所述产品的方法也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的制备所述产品的方法，包括将所述解淀粉芽孢杆菌IMB009和/或所述解淀粉芽孢杆菌IMB009的代谢物作为产品的成分，得到所述产品的步骤。
发明人从健康马铃薯根际土壤中分离得到一株对多种植物病原菌具有良好抗性的菌株IMB009，结合形态观察、生理生化特征鉴定以及多基因聚类分析，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，通过菌体对峙实验以及该菌株发酵液的抑菌实验确定了该菌株的抑菌谱，其中对棉花枯萎病病原-大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)也具有较好的抑制效果。为检测自然环境中IMB009对棉花枯萎病的防治效果，发明人建立了土壤中大丽轮枝菌含量变化的检测方法。实验表明IMB009能够显著抑制大丽轮枝菌，对棉花具有明显的保护作用。
生物材料保藏说明
生物材料的的分类命名：解淀粉芽孢杆菌
生物材料的的拉丁文学名：Bacillus amyloliquefaciens
生物材料的菌株编号：IMB009
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年07月30日
保藏编号：CGMCC No.22995
附图说明
图1为本发明解淀粉芽孢杆菌IMB009在LB平板上的表型以及在扫描电子显微镜下的形态。其中，图1的A为在LB平板上的表型照片，图1的B为在扫描电子显微镜下的形态图。
图2为本发明解淀粉芽孢杆菌IMB009菌株系统发育进化树。图中，括号中的序号为菌株GenBank的登录号，线段0.02表示序列差异的分支长度。
图3为本发明解淀粉芽孢杆菌IMB009与植物病原真菌对峙培养结果图。图3的a)图为与草莓尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)对峙，图3的b)图为与草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)对峙，图3的c)图为与立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)对峙，图3的d)图为与富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)对峙，图3的e)图为与白腐垫壳孢(Coniella diplodiella(Speg.)Petrak&Sydow)对峙，图3的f)图为与围小丛壳(Glomerella cingulata)对峙，图3的g)图为与辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)对峙，图3的h)图为与玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，图3的i)图为与黄瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)对峙，图3的j)图为与大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)对峙，图3的k)图为与苹果腐烂病菌(Valsa mali)对峙。
图4为本发明实施例3中土壤样品DNA提取和凝胶成像分析结果图。
图5为本发明实施例3中病圃土壤中真菌菌落分析和鉴定结果图。其中，图5的A图为真菌菌落分析结果图，图5的B图为不同的菌落PCR扩增鉴定结果。图中，1、2、3为Vd+Bs组样品(共同接种大丽轮枝菌V991和解淀粉芽孢杆菌IMB009)，4、5、6为Vd组样品(单独接种大丽轮枝菌V991)。
图6为本发明实施例3中qPCR分析土壤中大丽轮枝菌含量的曲线图。其中，图6的A图和图6的B图为不同盆栽和不同时间点土壤样品的Ct值；图6的C图和图6的D图为不同盆栽和不同时间点土壤样品中大丽轮枝菌含量的对数值(log)；图6的E图和图6的F图为土壤样品检测的溶解曲线峰。
图7为本发明实施例4解淀粉芽孢杆菌IMB009有助于棉花植株对黄萎病的抗性图。其中，图7的A图为接种等量大丽轮枝菌苗期个体间的发病表型；图7的B图为后期棉花植株个体间发病表型；图7的C图为棉花植株叶片的表型；图7的D图为后期棉花剖杆表型。图7的E图为棉花植株棉铃的大小。图中，1、2、3为Vd+Bs组样品(共同接种大丽轮枝菌V991和解淀粉芽孢杆菌IMB009)，4、5、6为Vd组样品(单独接种大丽轮枝菌V991)。
图8为本发明实施例4中解淀粉芽孢杆菌IMB009抑制大丽轮枝菌在土壤中生长的结果图。图中1和5为为Vd组(单独接种大丽轮枝菌V991)采土样涂板结果，2、3和4为Vd+Bs组(共同接种大丽轮枝菌V991和解淀粉芽孢杆菌IMB009)采土样涂板结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)记载于非专利文献“谢心悦,贾慧慧,杨海清,高坦坦,魏艳敏,任争光.芽胞杆菌BJ-10的鉴定及其抑菌活性与防病作用,北京农学院学报.2020,35(02):1-5.”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)记载于非专利文献“贾慧慧,谢心悦,潘园园,任争光,刘钢,魏艳敏.芽胞杆菌BJ-6的鉴定及对甜瓜细菌性果斑病的防治.微生物学报.2020,60(05):982-991.”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，白腐垫壳孢(Coniella diplodiella(Speg.)Petrak&Sydow)记载于非专利文献“刘长远,赵奎华,王克,白金铠.我国葡萄白腐病菌分类地位的重新确定研究.植物病理学报,1999,29(2):174-176.”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，围小丛壳(Glomerella cingulata)记载于非专利文献“围小丛壳Glomerela cingulata子囊孢子交配繁殖、生物学特性及致病性.菌物学报,2015,34(6):1101-1110.”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)记载于非专利文献“郑娜,郭安慧,翟伟卜,郭慧敏,张珊珊,张文蔚,简桂良,韩榕,齐放军.VIGS技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因.中国科学:生命科学.2016,46(05):646-656.”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，苹果腐烂病菌(Valsa mali)记载于非专利文献“任争光,宋庆丰,张志勇,包放,刘正坪,刘素花,魏艳敏.杏树根际芽孢杆菌BJ-6抗菌蛋白的分离纯化及抑菌机理.果树学报.2009,26(03):325-328”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
实施例1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)IMB009 CGMCCNo.22995的分离及鉴定
于2018年6月9日采自北京市密云区巨各庄镇塘子村的健康马铃薯植株根际土壤，并通过采用LB平板稀释涂布法分离细菌。以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌，通过平板对峙方法筛选到一株芽孢杆菌，命名为IMB009。
IMB009在LB平板上28℃培养2天，菌落呈现圆形扁平状，乳白色，表面干燥，边缘不规则且带有凸起，具体见图1的A图。在光学显微镜下观察，LB液体培养基中培养12小时后细胞呈短杆状，30小时后部分菌体产生芽孢，36小时后菌体破裂，椭圆形芽孢释放，但仍有少量菌体存在。在扫描电子显微镜下，可见芽孢表面有褶皱，比菌体略小，菌体大小约为1.6μm×0.7μm，具体见图1的B图。
不同微生物在利用各种碳/氮源的能力存在差异。IMB009碳源利用情况见表1，IMB009氮源利用情况见表2。IMB009能够良好的利用多种碳源，但在仅含有α-乳糖的培养基中长势一般，利用较弱；IMB009较容易利用铵根离子，不容易利用硝酸根离子；对于氨基酸作为唯一氮源试验中，IMB009能够利用大多数氨基酸，利用程度不同，不能利用色氨酸、赖氨酸以及甲硫氨酸。
表1 IMB009碳源利用情况
碳源 利用情况 碳源 利用情况 碳源 利用情况
麦芽糖 ++ 蔗糖 ++ 山梨醇 ++
半乳糖 ++ 肌醇 ++ 木糖 ++
葡萄糖 ++ 甘露糖 ++ α-乳糖 +
注：表1中“++”表示利用良好，“+”表示利用较弱，“-”表示不能利用。
表2 IMB009氮源利用情况
氮源 利用情况 氮源 利用情况 氮源 利用情况
谷氨酸 ++ 天门冬氨酸 ++ 缬氨酸 +
谷氨酰胺 ++ 苏氨酸 ++ 半胱氨酸 +
丙氨酸 ++ 亮氨酸 ++ 色氨酸 -
精氨酸 ++ 酪氨酸 + 赖氨酸 -
组氨酸 ++ 丝氨酸 + 甲硫氨酸 -
硝酸铵 ++ 硫酸铵 ++ 硝酸钠 +
注：表2中“++”表示利用良好，“+”表示利用较弱，“-”表示不能利用。
IMB009生理生化特征详见表3。微生物在糖代谢过程中，葡萄糖经糖酵解过程首先形成丙酮酸并进入不同的代谢途径。MR实验结果显示为阴性，表明IMB009未将葡萄糖发酵产物进一步分解成有机酸，或产生的有机酸较少，或产生的有机酸转化为非酸性末端产物，而V.P实验呈阳性说明其产生的丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，后者能够与培养基中精氨酸所含有的胍基结合，生成红色化合物，肌酸可提高胍基浓度，加速反应；H2S还原、纤维素水解和吲哚试验均为阴性，表明IMB009不能产生半胱氨酸还原酶，因而不能形成硫化氢，该菌不能产生纤维素水解酶水解纤维素，也不能产生色氨酸水解酶形成吲哚；接触酶、淀粉水解、明胶液化试验均为阳性表明IMB009能够产生过氧化氢酶催化过氧化氢产生氧气和水，能够产生淀粉水解酶水解淀粉，培养基透明圈较大表明其水解能力较强，也能够产生明胶酶使明胶液化；硝酸盐试验呈阳性而亚硝酸盐呈阴性表明IMB009能够产生硝酸还原酶将硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和胞内其他含氮化合物，但是不能还原亚硝酸盐。
表3 IMB009生理生化特征
特征实验 IMB009 特征实验 IMB009
M.R试验 - 淀粉水解 +
V.P试验 + 纤维素水解 -
H2S还原 - 明胶液化 +
吲哚试验 - 硝酸盐还原 +
接触酶 + 亚硝酸盐还原 -
发明人在基因组测序的基础上，提取了IMB009菌株的16S rDNA序列(具有核苷酸序列如序列表中序列1的DNA片段)、gyrA序列(具有核苷酸序列如序列表中序列2的DNA片段)、gyrB序列(具有核苷酸序列如序列表中序列3的DNA片段)、recA序列(具有核苷酸序列如序列表中序列4的DNA片段)和rpoB序列(具有核苷酸序列如序列表中序列5的DNA片段)，将这些序列串联后，再在NCBI上进行BLAST比对分析。结果发现IMB009与解淀粉芽孢杆菌DSM7模式菌株的序列覆盖率(Query coverage)高达100％，且一致性(Sort by percentidentity)为98.33％。通过邻接法构建系统发育树得到图2。由此发明人将菌株IMB009确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)IMB009已于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22995。以下简称解淀粉芽孢杆菌IMB009。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌IMB009的抗真菌活性检测
以真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、富克葡萄孢盘菌(Botryotiniafuckeliana)、白腐垫壳孢(Coniella diplodiella(Speg.)Petrak&Sydow)、围小丛壳(Glomerella cingulata)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、黄瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和苹果腐烂病菌(Valsa mali)为病原菌，与IMB009进行平板对峙实验。
具体实验方法如下：将解淀粉芽孢杆菌IMB009在LB固体培养基上28℃恒温培养48h。上述供试植物病原真菌分别在PDA平板上25℃-28℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.7cm的无菌不锈钢打孔器打制带病原菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线解淀粉芽孢杆菌IMB009，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三次重复，25℃-28℃恒温培养5-7天，测量病原真菌边缘与解淀粉芽孢杆菌IMB009的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。
平板对峙实验的结果见图3，发现解淀粉芽孢杆菌IMB009对多种病原真菌具有抑制活性，但对不同病原菌的作用不同。其中草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)、以及苹果腐烂病菌生长较慢，而解淀粉芽孢杆菌IMB009生长较快，推测通过竞争空间及营养，达到抑制效果；对小帽壳孢属、富克葡萄孢盘菌以及辣椒疫霉菌等病原真菌，解淀粉芽孢杆菌很可能通过产生次级代谢产物来抑制了病原菌的生长。
由于病原真菌生长速度不同，通过对峙实验只能得出相对结论。发明人进一步通过液体发酵检测解淀粉芽孢杆菌菌株代谢产物对真菌的抑制活性：接种供试菌于100mLPDA液体培养基中，28℃，200rpm培养2～3天，使用榨汁机将聚集成球状的菌体打散，使其均匀的分布在培养基中；待PDA培养基冷却至50℃以下，加入打碎的供试菌菌液(5％)，充分混匀后，倒入直径为90mm的平板，待培养基凝固后，用7mm的打孔器打孔备用。用接种环刮取活化一天的IMB009单菌落加入至50mL的NB培养基(NB培养基(1L)：牛肉膏5g、胰蛋白胨10g、葡萄糖10g，pH7.0)中，在28℃，200rpm摇床中震荡培养10h后，按1％接种量接种于100mL NB培养基中进行发酵培养，培养条件为28℃，200rpm，于培养第0h、12h、24h、36h、48h、60h进行取样，离心取发酵液上清进行抑菌实验，将不同时期的发酵液上清50μL加入至混有不同供试菌培养基的孔内，28℃培养1～3天，测量抑菌圈检测抑菌效果。结果见表4：
表4解淀粉芽孢杆菌IMB009不同发酵时间的发酵液对植物病原菌的抑菌活性检测
Figure BDA0003366871400000091
Figure BDA0003366871400000101
注：表4数据为抑菌圈直径，单位为cm，且数据包含打孔器直径7mm。“-”表示抑菌圈不明显，无法测量。
IMB009菌株在发酵的第12h开始产生次级代谢产物，表4表明不同的次级代谢产物可能在发酵的不同时间段产生，同时不同病原真菌对不同次级代谢产物的敏感程度也不同。因此，不同时间的发酵液对不同病原菌的抑制活性也出现了不同，体现在抑菌圈的大小不同。而发酵36h以后的上清液的抑菌圈差异不大，推测IMB009发酵36h后，次级代谢产物的产生已经趋于稳定。该菌发酵液对与所有供试菌均有不同程度的抑制效果。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌IMB009对棉花盆栽植株根际土壤病原菌的影响及对棉花黄萎病的防治效果
1、实验设计
将保存在试管中的强致病力落叶型黄萎病菌株大丽轮枝菌(V.dahliae)“V991”(记载于非专利文献“郑娜,郭安慧,翟伟卜,郭慧敏,张珊珊,张文蔚,简桂良,韩榕,齐放军.VIGS技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因.中国科学:生命科学.2016,46(05):646-656.”)在无菌条件下涂布在固体PDA培养基上，放入培养箱在28℃条件下培养一周左右活化，用接种环转接到PDB培养液，在台式空气恒温摇床于28℃震荡培养5-7天，制备孢子悬浮液。用血球计数板在显微镜下测定孢子浓度。
将解淀粉芽孢杆菌IMB009接种到固体LB培养基上，37℃培养24h活化。用接种环转接到LB液体培养基，在台式空气恒温摇床37℃震荡培养24h，制成菌悬浮液，测定其浓度。
将浓度为1×108个/mL的大丽轮枝菌V991孢子悬浮液和OD600为1.39的解淀粉芽孢杆菌IMB009菌悬液(以LB液体培养基为空白对照)接种至九圣禾产业园区(新疆昌吉市)的大田土壤，具体方法如下：
为了更好的模拟大田环境，取无大丽轮枝菌的九圣禾产业园区(新疆昌吉市)的大田土壤，按10千克土壤50mL的大丽轮枝菌V991孢子悬浮液接种，装入半径为15cm，高15cm的花盆中，再将装入土壤花盆埋入土中10cm，充分模仿大田的土壤环境。将接种强致病力落叶型黄萎病菌株“V991”悬浮液的土壤于播种前3周等量拌入盆栽，分别装入200个花盆。
播种前一周在其中100盆中拌入OD600为1.39的解淀粉芽孢杆菌IMB009的孢子悬浮液，加大丽轮枝菌V991和解淀粉芽孢杆菌IMB009的孢子悬浮液至每克土壤中均达到106个，即得到共同接种大丽轮枝菌V991和解淀粉芽孢杆菌IMB009的处理组(Vd+Bs组)。
余下的100盆为单独接种浓度为1×108个/mL的大丽轮枝菌V991孢子悬浮液，使孢子悬浮液至每克土壤中为106个，即得到阴性对照组(Vd组)。
另设未进行任何处理的土壤为空白对照。
后定苗为每盆1株棉花。棉花的浇水、施肥等农田管理措施与日常农田管理的措施一致；实验重复三次。
2、盆栽实验中根际土壤中大丽轮枝菌的检测和定量
在播种后每隔两周取一次土样，为了保证取样均匀，在一个花盆的不同三处取样，取样后混合，每次取土样50g，每次取样分别在实验组与阴性对照组的土壤样品中各选取10盆。将取得的盆栽土样自然风干，然后选取筛目半径为1mm的网筛过筛混匀，最后写好编号装入密封袋中，并放置于-20℃的条件下保存备用。
分别称取0.1g Vd+Bs组(1-10号)、Vd组(11-20号)和未进行任何处理的空白对照(21号)土壤样品，根据土壤样品基因组提取试剂盒
Figure BDA0003366871400000112
power
Figure BDA0003366871400000113
Kit说明书提取土壤样品的DNA，获得了浓度和纯度较高DNA样品，具体见表5。将提取的21个DNA样品通过Nanodrop 1000 V3.8.1检测样品纯度，并通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，电泳结果显示提取的土壤样本DNA质量较好，具体见图4。
表5不同盆栽植株根际土壤样品DNA浓度和纯度检测
Figure BDA0003366871400000111
Figure BDA0003366871400000121
通过常规PCR鉴定大丽轮枝菌V991：根据大丽轮枝菌三磷酸甘油醛脱氢酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PD，GenBank number：MG598931.1)基因序列，通过Primer premier 5软件设计qPCR特异性引物G3PD-F和G3PD-R，扩增大丽轮枝菌V991的G3PD部分基因序列。引物序列如下：
G3PD-F：5’-GTCTATCATGTGCTGGGGTTCTCC-3’；
G3PD-R：5’-GAGATGATGACCTTCTTGGCGCC-3’。
扩增体系为25.0μL：模板DNA 20ng/μL，引物G3PD-F和G3PD-R各0.5μL，2×SuperPfxMasterMix 10μL，加ddH2O补齐至25μL。扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
称取以上Vd+Bs组和Vd组土样各5g，根据实验方法(Yang&Shang,2002)，对土壤中的大丽轮枝菌V991进行水筛，并涂布于PDA培养基上，对不同菌落进行PCR鉴定，比较土壤样品间的大丽轮枝菌的含量(结果见图5的A图)。结合盆栽土壤浸提液稀释后涂布生长的平板真菌菌落生长情况和对不同的菌落进行PCR扩增鉴定(结果见图5的B图)，对土壤中大丽轮枝菌的含量进行测定。
经过统计分析，不同盆栽土壤里的大丽轮枝菌V991含量呈现显著差异，不同时间点的大丽轮枝菌V991在土壤中含量也呈现显著差异，并且随着时间的后移，差异越大(见表6)。这种土壤病原真菌V991含量变化可能是造成植株个体间发病程度不同的原因。
表6盆栽棉株土壤不同时间点大丽轮枝菌含量的方差分析
源 III型平方和 df 均方 F Sig.
校正模型 13266.776a 20 663.338778 2209.96 4.763E-57
截距 28821.5278 1 28821.5278 96020.955 3.4864E-72
样品名称 0 0
取样时间 12327.3667 14 880.52619 2933.5352 4.6107E-58
样品名称*取样时间 0 0
误差 12.6066667 42 0.30015873
总计 42100.91 63
校正的总计 13279.3822 62
注：因变量:Ct值。a.R方＝.999(调整R方＝.999)。
通过实时荧光定量PCR测定大丽轮枝菌V991的含量：按照SYBR Green qPCRMaster mix试剂盒(中国，北京擎科生物科技有限公司)说明书进行实时荧光定量PCR。以qG3PD-F和qG3PD-R为引物扩增。引物序列如下：
qG3PD-F：5’-CACGGCGTCTTCAAGGGT-3’；
qG3PD-R：5’-CAGTGGACTCGACGACGTAC-3’。
反应体系为20μL：SYBR Green qPCR Master mix 10μL，稀释模板DNA 20ng/μL，引物qG3PD-F/R各1.0μL，加ddH2O补齐至20μL。扩增条件为：95℃1min；95℃10s，58℃5s，72℃15s，40个循环。将已知浓度的GFP质粒作为荧光定量的质粒作为内参，进行实时荧光定量PCR扩增。
利用qPCR分析土壤中大丽轮枝菌含量，随机选取6盆植株土样的DNA，每个盆栽样品的Ct值呈现出显著性差异(见图6)，表明不同盆栽土壤中病原菌含量呈现显著差异。
3、盆栽实验中解淀粉芽孢杆菌IMB009对棉花黄萎病的防治效果
从棉花的苗期开始，记录一次接种大丽轮枝菌V991的棉花发病情况。记录各处理组中发病植株的症状，根据接菌后棉花植株叶片发黄、萎蔫脱落等不同程度的病症，参照Wang等发表的文献对棉花植株进行病级划分，将发病等级分为0、1、2、3、4五个等级，统计五个病级的棉花植株，根据植株的发病等级计算接菌植株的发病指数(disease index,DI)，病情指数计算参照Wang等发表的文献并进行适当的修改(Wang et al.,2004)。此外，将侵染大丽轮枝菌V991后的植株截取子叶节以下相同部位的茎秆进行徒手斜剖，观察植株茎杆木质部褐化程度，参照Fradin等人文献(Fradin&Thomma,2006)，将徒手横剖的植株茎杆进行表面消毒，于PDA培养基上恢复培养。
发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)×100％
病情指数DI＝∑(感染植株数量×发病等级)/(总植株数×4)×100％
黄萎病分级标准：
0级:健康的棉花植株，棉花的叶片健康无症状，维管束无任何症状，不变色。
1级:发病的棉花植株，叶片出现症状不到1/4，棉花植株叶片表现出叶肉呈现为淡黄色或叶片上具有不规则形形状的黄色斑点。剖杆后棉花植株维管束的变色面积占棉株横截面1/4以下。
2级:发病的棉花植株叶片出现症状达到1/4至1/2之间，棉花植株叶片病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯。剖杆后棉花植株维管束的变色面积占棉株横截面1/4至1/2之间。
3级:发病的棉花植株叶片出现症状达到1/2以上，棉花植株病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯，有少数叶片凋落。剖杆后棉花植株维管束的变色面积占棉株横截面1/2以上。
4级:发病的棉花植株所有的叶片发病，棉花植株叶片多呈现褐色掌状的枯斑，有的植株叶片完全脱落成为光杆，导致整株死亡。剖杆后棉花植株维管束的变色面积占棉株横截面3/4以上。
结果见图7，在使用解淀粉芽孢杆菌IMB009的盆栽里，棉花植株发病很轻或不发病，通过对土壤接种解淀粉芽孢杆菌IMB009的盆栽植株进行剖杆分析，并未发现植茎杆木质部出现黄萎病导致的明显棕褐色，而不接种解淀粉芽孢杆菌IMB009的盆栽对照植株茎杆木质部则出现明显棕褐色。通过对实验组棉株的叶片及结铃情况观察，也未见明显病症，表明解淀粉芽孢杆菌IMB009可以显著抑制棉花黄萎病的发生。
用涂布平板分析发现，接种解淀粉芽孢杆菌IMB009的棉花盆栽土壤中大丽轮枝菌V991含量显著低(见图8)，说明土壤中接种解淀粉芽孢杆菌IMB009能够显著抑制大丽轮枝菌的生长。
对盆栽棉花植株的农艺性状进行分析显示，施用解淀粉芽孢杆菌IMB009后棉花的株高、始节高、果枝数、棉铃个数以及棉铃重量都比不施用解淀粉芽孢杆菌IMB009的对照组棉花有显著提高，同时黄萎病发病指数显著下降，由45.8％下降到12.5％(见表7)。
表7解淀粉芽孢杆菌IMB009有助于提高棉花的农艺性状和对黄萎病的抗性
Figure BDA0003366871400000141
注：表7中相同字母代表没有显著性差异，不同字母代表有显著性差异，a,b,c d表示有显著性差异。
施用解淀粉芽孢杆菌IMB009对棉花产量和品质的影响：比较经过IMB009处理(Vd+Bs组)和没有处理的盆栽棉花植株接种大丽轮枝菌V991(Vd组)，待棉花收获后，称取籽棉的重量、脱绒和测定衣分，结果见表8和表9。表中数据显示IMB009的使用通过抑制了棉花黄萎病的发生，不但显著提高了棉花产量也显著提高了棉花纤维的品质。
表8解淀粉芽孢杆菌IMB009有助于提高棉花产量
处理 衣分(％) 籽棉产量(g/株)
Vd+Bs组 43.61 46.10
Vd组 45.94 28.20
表9解淀粉芽孢杆菌IMB009有助于提高棉花纤维品质
Figure BDA0003366871400000151
注：表9中相同字母代表没有显著性差异，不同字母代表有显著性差异，a,b表示有显著性差异。
综上，解淀粉芽孢杆菌IMB009在棉花根际土壤中能够显著抑制大丽轮枝菌V991的生长，盆栽实验显示IMB009能够通过降低土壤中大丽轮枝菌的含量，减轻棉花黄萎病的发病程度。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
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ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
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gagtaccact acgaaggcgg aatcaaaagc tatgttgagt acttaaaccg ttccaaagaa 720
gtcgttcatg aagagccgat ttatatcgaa ggcgagaaag acggcataac ggttgaagtt 780
gcattgcaat acaacgacag ctatacaagc aatatttatt ctttcacgaa taatatcaac 840
acatacgaag gcggcacgca cgaggccgga tttaaaaccg gtctgacccg tgtcataaac 900
gactatgcaa gaagaaaagg gattttcaaa gaaaatgatc cgaatttaag cggggatgat 960
gtgagagaag ggctgactgc cattatttca attaagcacc ctgatccgca attcgaaggg 1020
cagacgaaaa cgaagctcgg caactccgaa gcgagaacga tcactgatac gctgttttct 1080
tctgcgctgg aaacattcct tcttgaaaat ccggactcag cccgcaaaat cgttgaaaaa 1140
ggtttaatgg ccgcaagagc gcggatggca gcgaaaaaag cacgggaatt gacccggcgc 1200
aaaagtgcgc ttgagatttc caatctgccg ggcaaactgg cggactgttc ttctaaagat 1260
ccgagcattt ccgagctgta tatcgtagag ggtgactctg cgggcggatc agcgaaacag 1320
ggacgggacc gtcatttcca agctattctg ccgctgcgcg gtaagattct gaacgttgag 1380
aaagccagac ttgataagat cctctcaaac aatgaggtca gatcaatgat cacggctctc 1440
ggaacaggaa tcggagaaga ttttaatctt gaaaaagcgc gttatcataa agtggtcatc 1500
atgacggatg ccgatgttga cggcgcccac atcagaacgc ttttattaac gttcttctac 1560
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ttaaaagagc ttccgcaatc acctaagccc ggcctccagc gttataaagg tcttggagaa 1740
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gtcaatcttg aagatgcaat ggacgctgac gagacttttg aaatgctgat gggtgacaaa 1860
gtagaaccgc ggagaaactt catagaagca aacgccagat acgtgaaaaa tcttgatatt 1920
taa 1923
<210> 4
<211> 1044
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 4
atgagtgatc gtcaggcagc cttagatatg gctcttaagc aaatagaaaa acaattcggc 60
aaaggttcca tcatgaagct cggagaaaaa acggatacaa gaatttcaac ggtgccaagc 120
ggttcccttg cacttgatac cgctctcgga ataggcggat acccgcgcgg acggattatt 180
gaagtatacg gacctgaaag ctcaggtaaa acgactgtag cgcttcacgc aatcgctgag 240
gttcaggaaa aaggcggaca ggcagcattt attgatgctg agcatgctct tgatcctgtt 300
tacgcgcaaa agctcggtgt caatatcgaa gagcttctgc tttctcagcc ggatacggga 360
gagcaggcgc tagagattgc tgaagcgctg gtgcgaagcg gcgctgttga catcgtagtc 420
gttgactctg ttgcggcgct tgttccaaaa gctgaaattg aaggtgacat gggtgattca 480
cacgtcggtt tacaggcgcg tctcatgtct caggcgctcc gtaagctttc cggcgccatc 540
aataaatcta aaacaatcgc aatctttatt aaccagattc gtgaaaaagt cggcgttatg 600
ttcggaaatc cggagacgac accgggcggc cgcgcgctga aattctattc ttccgtgcgc 660
cttgaagtgc gccgtgccga gcaattaaag cagggcaacg acgtgatggg gaataaaacg 720
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<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
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ttgacaggtc aactagttca gtatggacga caccgccagc gcagaagcta tgctcgcatt 60
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gataccggta cttttatcat caacggtgca gaacgtgtta tcgtatctca gcttgttcgg 420
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ctggataagg acaacactga aaacagtgac aaagcgcttc ttgaaatcta tgagcgcctt 720
cgtcccggag agccgcctac agtagaaaac gcaaaaagct tgctggattc ccgtttcttc 780
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cgtatcggtt taagccggat ggaacgtgtc gttcgtgaaa gaatgtctat tcaagacacg 1320
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caaaaagtaa aaggcaacct ggataagtac agcttgctga aatttgtccg ctccaaccaa 2160
ggtacgtgct acaatcagcg tccgatcgtc agtgtcggcg acgaagtagt caaaggagaa 2220
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gtcggcttca tgacatggga tggttacaac tatgaggatg ccatcatcat gagtgaacgc 2340
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cgtacgggag aaccgtttga caaccgtgta tctgtcggaa tcatgtacat gatcaaactg 3120
gcacacatgg ttgatgataa acttcatgcc cgttctacag gtccttactc acttgttacg 3180
cagcagcctc tcggcggtaa agcccaattc ggcggacagc gtttcggtga gatggaggtt 3240
tgggcgcttg aagcttacgg cgcagcttac acgcttcaag aaatcctgac tgtgaagtcc 3300
gatgacgtgg tcggacgtgt gaaaacatat gaagccatcg tcaaaggcga caatgttcca 3360
gagcctggtg ttccggaatc attcaaagta ttgatcaaag agcttcaaag cttaggtatg 3420
gacgtgaaaa tcctttcagg cgatgaagaa gaaatagaaa tgagagatct agaagacgag 3480
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gcatctccag acgttgaacg tgacgcagta acgaaagagt ag 3582

Claims (6)

1.解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），其菌株号为IMB009，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.22995。
2.一种产品，其特征在于：含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌IMB009；所述产品为菌剂、含有所述菌剂的微生态制剂、或含有所述菌剂或所述微生态制剂的生物肥料。
3.权利要求2所述的产品，其特征在于：为抑制真菌的产品。
4.解淀粉芽孢杆菌的培养物，其特征在于：所述培养物为将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在微生物培养基中发酵得到的发酵产物。
5.培养权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌IMB009的方法，其特征在于：包括将所述解淀粉芽孢杆菌在培养基中培养的步骤。
6.制备权利要求2或3任一项所述的产品的方法，其特征在于：包括将所述解淀粉芽孢杆菌IMB009作为产品的成分，得到所述产品的步骤。
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