CN113969271B - 发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法 - Google Patents
发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113969271B CN113969271B CN202111480580.5A CN202111480580A CN113969271B CN 113969271 B CN113969271 B CN 113969271B CN 202111480580 A CN202111480580 A CN 202111480580A CN 113969271 B CN113969271 B CN 113969271B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucanase
- beta
- foam
- separation
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 124
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 239000006260 foam Substances 0.000 title claims abstract description 106
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 60
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 48
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 18
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000010959 steel Substances 0.000 claims description 5
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 108700038091 Beta-glucanases Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007433 bsm medium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005351 foam fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 108010076363 licheninase Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001612 separation test Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2448—Licheninase (3.2.1.73)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
发酵液中β‑葡聚糖酶的泡沫分离方法，属于泡沫分离技术领域。发酵罐发酵生产β‑葡聚糖酶，将β‑葡聚糖酶发酵液配制成不同浓度的β‑葡聚糖酶溶液，测定其起泡能力与泡沫稳定性；检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置的气浮管中；打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至所需值，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管的底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，带动分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中，测定泡沫液中的β‑葡聚糖酶的浓度和酶活，计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。成本低、条件温和、操作简便，解决产物抑制、分离困难、营养物质利用率低等问题。
Description
技术领域
本发明属于泡沫分离技术领域，具体是涉及利用SDS作为起泡剂的一种发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法。
背景技术
β-葡聚糖酶可以催化β-葡聚糖的分解，在酵母、真菌和谷物的细胞壁中以结构元素存在。β-葡聚糖酶可分为四类，其中最受瞩目研究的是β-1,3-1,4-葡聚糖酶(Yang S Q,Yan Q J,Jiang Z Q,et al.Biochemical characterization of a novel thermostablebeta-1,3-1,4-glucanase(Lichenase)from Paecilomyces thermophila[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2008,56(13):5345-5351)，其具有严格的底物专一性，所以被广泛应用于食品、洗涤剂、动物饲料等产业。β-葡聚糖酶的常见提取方法有：植物提取(孙玉英，王瑞明.β-葡聚糖酶的研究进展[J].山东商业职业技术学院学报,2002(03):11-13)和微生物发酵(Teng D,Wang J-H,Fan Y,et al.Cloning of beta-1,3-1,4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039(CGMCC 0635)and itsexpression in Escherichia coli BL21(DE3)[J].Applied Microbiology andBiotechnology,2006,72(4):705-712)。
目前，β-葡聚糖酶的主要生产方式是微生物发酵法。从发酵液中提纯β-葡聚糖酶的方法有：双水相萃取法、疏水层析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、硫酸铵沉淀、膜分离等。随着β-葡聚糖酶的应用领域逐步扩大、应用价值逐渐被发现，其市场价值和需求进一步提升。因此寻求一种高效、成本低、操作简便、酶活性高的工业分离提取技术成为了β-葡聚糖酶应用道路上亟待解决的问题。泡沫分离又称气浮分离或泡沫吸附分离技术，以气泡作为分离载体，利用不同物质其表面活性的不同来达到分离的目的。在本世纪开始逐渐应用于生物工程领域，主要用于具有表面活性的生物大分子的提取(Stowers C C,Makarov V,Walker A,et al.Effect of air flow rate on the foam fractionation of a mixtureof egg white and egg yolk[J].Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering,2009,4(2):180-183)，具有工艺简便、安全性高、工业化成本低、生产效率高、绿色环保等特点，因此可作为提取β-葡聚糖酶的新方法。
常见的发酵液中的β-葡聚糖酶的提取方法有：双水相萃取法、疏水层析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、硫酸铵沉淀、膜分离等。但是这些方法都有各自的缺点，比如疏水层析法的回收率只有25％；离子交换层析法需要大量水洗；硫酸钠沉淀法分离效果较差，而且结合其他分离方法同时使用，而且对环境有污染；膜分离法的膜的价格较高，并且膜易被破坏。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的β-葡聚糖酶生产过程中产物抑制、分离困难、营养物质利用率低等问题，提供利用β-葡聚糖酶自身的起泡性，探究从发酵液中泡沫分离采收β-葡聚糖酶的工艺，并优化工艺条件的一种发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法。
本发明包括以下步骤：
1)发酵罐发酵生产β-葡聚糖酶，得到β-葡聚糖酶发酵液；
2)将步骤1)所得β-葡聚糖酶发酵液配制成不同浓度的β-葡聚糖酶溶液，测定β-葡聚糖酶起泡能力与泡沫稳定性；
3)检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置的气浮管中；
4)打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至所需值，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管的底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，从而带动分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中，测定泡沫液中的β-葡聚糖酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。
在步骤1)中，所述发酵罐可采用Minifors 2台式标准发酵罐；所述发酵可采用重组毕赤酵母，培养基为BMGY培养基；所述发酵罐的参数设置可为，前期：温度30℃，搅拌速度800～1000rpm，通气4L·min-1；诱导产酶期：发酵温度为25～30℃，流加甲醇诱导发酵108～120h；优选，前期：温度30℃，搅拌速度800rpm，通气4L·min-1；诱导产酶期：发酵温度为30℃，流加甲醇诱导发酵108h。
在步骤3)中，所述泡沫分离装置可由空气钢瓶、气瓶主阀、减压阀、调节阀、截止阀、转子流量计、气体分布器、气浮管、泡沫收集烧杯组成；所述空气钢瓶的出口经减压阀接调节阀的输入端，调节阀的输出端接截止阀的输入端，截止阀的输出端经转子流量计分别接气体分布器和残液排出阀，气体分布器的输出端接气浮管的输入端，气浮管的输出端接收集瓶；所述转子流量计可采用型号为LZB-3WB的转子流量计，测量流量范围为100～1000mL/min；所述气浮管可采用长度120cm、内径30mm的玻璃管；所述发酵液的装液体积可为100～300mL。
在步骤4)中，所述通入空气的气速为200～1000mL/min。
本发明提供一种发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离法泡沫分离方法，发酵罐发酵生产β-葡聚糖酶，得β-葡聚糖酶发酵液；泡沫分离法收集发酵液中的β-葡聚糖酶：检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置气浮管中；打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至所需值，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，带动、分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中；测定泡沫液中的β-葡聚糖酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。本发明利用β-葡聚糖酶自身的起泡特性，结合泡沫分离技术，从β-葡聚糖酶发酵液中分离纯化了β-葡聚糖酶。本发明成本低、作用条件温和、操作简便，能有效地解决β-葡聚糖酶生产中产物抑制、分离困难、营养物质利用率低等问题。
相比现有技术，本发明具有以下突出的技术效果与优点：
1、泡沫分离法提取β-葡聚糖酶的创新点在于：实现首次利用泡沫分集技术提取β-葡聚糖酶，并且高效、简单、温和、低成本地提取β-葡聚糖酶。并且在提取的过程中利用β-葡聚糖酶具有的表面活性，可以减少表面活性剂的使用，从而减小对产物的污染。泡沫分离过程中温和的分离条件，也在最大程度上减少了分离物质的变性的影响。
2、泡膜分离技术提取β-葡聚糖酶耗能更少，能用于低浓度物质的分离，并且分理处的产物分辨率高，是其他分离技术无法替代的。另外，由于泡沫分离技术自身的特点：利用被分离物资的表面活性特性，从而运用泡沫分离方法富集回收，是其他方式无法实现的。因为泡沫分离的关键就是跟被分离物资的表面活性表面张力有关系，其他方式不是依靠这个关系实现。
3、实验数据表明，泡沫分离技术提取β-葡聚糖酶的回收率可以达到96.01％，超过传统的提取方法，同时提取过程相比于传统的提取方法，更加环保和高效.比如常见的发酵液中的β-葡聚糖酶的提取方法有：双水相萃取法、疏水层析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、硫酸铵沉淀、膜分离等。但是这些方法都有各自的缺点，比如疏水层析法的回收率只有25％；离子交换层析法需要大量水洗；硫酸钠沉淀法分离效果较差，而且结合其他分离方法同时使用，而且对环境有污染；膜分离法的膜的价格较高，并且膜易被破坏。除此之外，在泡沫分离技术所需的生产装置更简单和耗材用量更少，也大大降低生产成本和门槛，实现β-葡聚糖酶的高效、低价、绿色生产。
附图说明
图1为泡沫分离装置的结构示意图。
图2为通气速度对摇瓶β-葡聚糖酶采收效果的影响曲线图。
图3为装液体积对摇瓶β-葡聚糖酶采收效果的影响曲线图。
图4为初始酶浓度对摇瓶β-葡聚糖酶采收效果的影响曲线图。
图5为表面活性剂(SDS)对发酵罐β-葡聚糖酶采收效果的影响曲线图。
图6为样品液pH对发酵罐β-葡聚糖酶采收效果的影响曲线图。
图7为富集比E的值分布图。
图8为富集比E的R值分布图。
图9为回收率R的值分布图。
图10为回收率R的R’值分布图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例将结合附图对本发明进行作进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，以下对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
图1给出本发明采用的泡沫分离装置的结构示意图。所述泡沫分离装置可由空气钢瓶1、气瓶主阀2、减压阀3、调节阀4、截止阀5、转子流量计6、气体分布器7、气浮管8、泡沫收集烧杯9组成；所述空气钢瓶1的出口经减压阀3接调节阀4的输入端，调节阀4的输出端接截止阀5的输入端，截止阀5的输出端经转子流量计6分别接气体分布器7和残液排出阀(图中未画出)，气体分布器7的输出端接气浮管8的输入端，气浮管8的输出端接泡沫收集烧杯9。
本发明利用β-葡聚糖酶自身起泡性能，泡沫分离采收发酵液中β-葡聚糖酶的最佳工艺条件的具体步骤为：
1、发酵罐发酵生产β-葡聚糖酶
将甘油管保存的菌液进行活化，培养48h后挑取一环接种在装有25mL BMGY培养基的摇瓶中进行培养，摇床条件设置为30℃，250rpm。12h后分别取2mL培养液转接到4瓶装有50mLBMGY培养基的摇瓶中培养18h得到种子液，摇床条件设置为30℃，250rpm。
实验开始前对设备进行调校，确认发酵罐的pH电极溶氧电极、制冷系统、蠕动泵、补料管等是否正常。检查完成后，将经过高压灭菌的BSM培养基接入发酵罐。待培养基冷却后，打开pH电极调节培养基pH至5.0，通入空气调节进气量4L·min-1，打开溶氧电极、冷却循环水、搅拌电机。接入种子液，设置搅拌转速为800rpm，发酵温度为30℃，pH为5.0，发酵生长约16～18h。大概在16h溶氧值会开始缓慢下降，到大概25h时溶氧值会突然升高并保持在80％以上，此时以3.6mL·h-1·L-1的速率流加发酵液体积5％甘油加入到发酵罐中。甘油添加完成后，等待约3h，溶氧突然上升表明甘油已经完全耗尽，此时开始进行甲醇诱导。调节发酵液pH至6.0，转速保持800rpm，每隔12h流加发酵液体积0.5％的甲醇，期间以甲醇的流加速度调控溶氧，使溶氧维持在35％左右。流加甲醇9次约108h，完成发酵过程。结束发酵，将发酵液转入储存容器，清洗发酵罐。
2、泡沫分离实验
首先对分离装置的气密性、连接稳定性进行检查。根据实验设计，配置对应浓度、pH、装液量等的样品溶液待用。打开减压阀和气瓶阀门，按照实验设计调节转子流量计，使气流速度符合实验设计条件。将样品溶液加入分离柱中，用烧杯在出泡口收集泡沫，在加入样品的同时开始计时，10min后停止收集。用保鲜膜将装有泡沫液的烧杯口封住，并置于4℃的冰箱内静置消泡。泡沫消除后测量剩余液体积，并按照分析方法对分离液进行β-葡聚糖酶浓度及活度测算，并对分离试验的富集比和回收率进行分析，确定最佳分离条件、评价分离效果。
3、泡沫分离采收β-葡聚糖酶的单因素实验：
设计单因素实验，当其他条件不变时，分别考察不同分离气速、样品液浓度、pH、装液体积、表面活性剂的量对泡沫分离采收β-葡聚糖酶的影响。分离前先测定原样品液的β-葡聚糖酶的浓度和活度，加入分离柱后，通过控制流量计等控制分离条件，收集消泡完成后测定分离液的β-葡聚糖酶浓度和活度，并计算泡沫分离的回收率和富集比，对最佳分离单因素条件进行分析。
4、泡沫分离采收β-葡聚糖酶正交试验
根据单因素实验得到的最佳离气速、样品液浓度、pH、装液体积、表面活性剂的量设计五因素四水平的正交试验，根据正交试验结果进行分析，以回收率为主要考察因素确定最佳的分离条件组合，并结合各因素对泡沫分离效果的影响大小，最终确定最佳的分离条件和方案。
5、分析方法
5.1β-葡聚糖酶浓度的测定
本实验采用考马斯亮蓝染色法对β-葡聚糖酶浓度进行测定：将取出的样品液进行低温离心10min，取800μL无菌蒸馏水和200μL上清液转移到试管中。加入5mL的考马斯亮蓝染液摇匀，静置5min。用加入1mL无菌蒸馏水的试管作为空白对照，在595nm处测定吸光度，并从标准曲线查出β-葡聚糖酶浓度。
5.2β-葡聚糖酶酶活的测定
本实验通过β-葡聚糖酶水解产物与DNS试剂发生显色反应来对酶活进行测定：先取1mL菌液在10000rpm条件离心5min，将上清液倒入新的1.5mL离心管中，沉淀进行细胞裂解，裂解后得到待测酶样品。取1mL底物溶液分别置于四支试管中，其中三支作测试管，一支作空白对照，在50±0.2℃下保温2～3min。保温结束后，向三支测试管中分别加入1mL酶液，空白管中加入1mL蒸馏水作对照。然后将四支试管同时在50℃水浴中加热10min，取出后每管加入2mL DNS试剂，沸水加热5min。冷却后每管加入10mL无离子水混匀。最后用空白管调零，在540nm处测定吸光度。将测得的各平行样吸光度求取平均值，按照以下公式计算β-葡聚糖酶活度：
式中x：为样品OD值的平均值；b和a：由麦芽糖浓度和相应的OD值通过回归方程求得；n：酶液的稀释倍数；10：酶促反应的时间；F：底物校正因子(1.047)；W：酶样品的重量(1mL)。
5.3分离效果评价
泡沫分离的效果用富集比(E)和酶活回收率(R)来评价：
式中C1：泡沫液中β-葡聚糖酶蛋白浓度，mg/mL；C0：样品液初始β-葡聚糖酶蛋白浓度，mg/mL；V1：分离后泡沫液体积，mL；V0：样品液初始体积，mL；A1：分离后泡沫液酶活，U/mL；A0：样品液初始酶活，U/mL。
以下给出具体实施例。
实施例1
本实施例是改变发酵液中的通气速度，固定其它实验因素，比较不同通气速度下摇瓶培养液中β-葡聚糖酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶β-葡聚糖酶的通气速度。
设计五组泡沫分离实验，通气速度变化梯度为200mL/min，分别取200mL/min、400mL/min、600mL/min、800mL/min、1000mL/min，其他条件确定为：装液体积100mL，初始酶浓度为100μg/mL，表面活性剂浓度为0.4mg/mL，溶液pH值为6，收集时间10min。结果如图2所示。
由实验结果可得，β-葡聚糖酶的富集比E随着通气速度的增大而减小，在通气速度为200mL/min时，富集比E有最大值1.69。而酶活回收率R随着通气速度的增大而增大，在通气速度为1000mL/min时有最大值25.09％。结合泡沫分离原理对实验结果进行分析可得，当通气速度较低时，产生的气泡少且不稳定，容易破裂，对β-葡聚糖酶的吸附效果弱，因此随着通气速度的增大，泡沫变多变稳定，β-葡聚糖酶与液相接触的次数变多，吸附效果变强，因此分离的酶活回收率逐渐增大。另一方面，随着通气速度的增大，产生的大量气泡也带出了更多的水，导致分离收集液中水的含量大大提高，分离的富集比也逐渐下降。因此，综合分析考虑富集比E和酶活回收率R的影响，最后选定单因素条件下最优分离气速为600mL/min。
实施例2
本实施例是改变泡沫分离体系中的装液体积，固定其它实验因素，比较不同装液体积下摇瓶培养液中β-葡聚糖酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶β-葡聚糖酶的装液体积。
设计五组泡沫分离实验，装液体积分别取50mL、150mL、200mL、250mL、300mL，其他条件确定为：通气速度400mL/min，初始酶浓度为100μg/mL，表面活性剂浓度为0.4mg/mL，溶液pH值为6，收集时间10min。结果如图3所示。
由实验结果可得，β-葡聚糖酶的酶活回收率R随着装液体积的增大而增大，在装液体积为300mL时有最大值35.76％。而β-葡聚糖酶的富集比E则随着装液体积的增大呈现先增大后减小的趋势，在装液体积为200mL时有最大值1.51。结合泡沫分离原理对实验结果进行分析可得，当装液体积较低时，液面高度低，样品液与气泡结合区域短，导致β-葡聚糖酶与气泡结合时间短，结合不充分，当装液体积增加时，β-葡聚糖酶与气泡结合效果变好，因此酶活回收率增大。而另一方面，随着装液体积的增大，液面的上升，在更好的带出β-葡聚糖酶的同时，也带出了大量的水，在到达一定的极限后，随着装液体积的增大，分离的富集比E会逐渐下降。因此，综合分析考虑富集比E和酶活回收率R的影响，最后选定单因素条件下最优装液体积为200mL。
实施例3
本实施例是改变泡沫分离体系中的初始酶浓度，固定其它实验因素，比较不同初始酶浓度下摇瓶培养液中β-葡聚糖酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶β-葡聚糖酶的初始酶浓度。
设计五组泡沫分离实验，初始酶浓度变化梯度为25μg/mL，分别取50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL，其他条件确定为：通气速度400mL/min，装液体积为100mL，表面活性剂浓度为0.4mg/mL，溶液pH值为6，收集时间10min。结果如图4所示。
由结果可得，β-葡聚糖酶的酶活回收率R随着初始酶浓度的增大呈现出先增大后减小的趋势，在初始酶浓度为100μg/mL时有最大值61.03％。而β-葡聚糖酶的富集比E随着初始酶浓度的增大也呈现出先减小后增大的趋势，在初始酶浓度为1000μg/mL时有最大值1.59。结合泡沫分离原理对实验结果进行分析可得，当初始酶浓度较低时，产生的泡沫量较少，因此酶活回收率和富集比都较低。当初始酶浓度逐渐上升时，产生的泡沫量增加，泡沫也处于更加稳定的状态。当其浓度增大到一定临界值时，样品液的粘度过大，酶与酶之间会发生缔结现象，导致气泡不稳定，酶活回收率及富集比逐渐下降。因此，综合分析考虑富集比E和酶活回收率R的影响，最后选定单因素条件下最优初始酶浓度为100μg/mL。
实施例4
本实施例是改变泡沫分离体系中的表面活性剂(SDS)浓度，固定其它实验因素，比较不同初始SDS浓度下摇瓶培养液中β-葡聚糖酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶β-葡聚糖酶的初始酶浓度。
设计五组泡沫分离实验，表面活性剂(SDS)浓度变化梯度为0.1mg/mL，分别取0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL，其他条件确定为：通气速度400mL/min，装液体积为100mL，初始酶浓度为100μg/mL，溶液pH值为6，收集时间10min。结果如图5所示。
由实验结果可得，β-葡聚糖酶的酶活回收率R和富集比E随着SDS浓度的增大均呈现出先增大后减小的趋势，酶活回收率R在SDS浓度为0.3mg/mL时有最大值69.26％，富集比E也在在SDS浓度为0.3mg/mL时有最大值1.25。结合泡沫分离原理对实验结果进行分析可得，当SDS浓度较低时，产生泡沫较少，随着其浓度的增大，产生泡沫增多，对β-葡聚糖酶的吸附力增强，因此富集比和回收率都增大。当SDS浓度增大到某一界限值时，由于SDS浓度过高，导致其分子之间产生缔合现象，对β-葡聚糖酶的吸附力逐渐下降，同时由于气泡过多带出大量水，因此富集比也逐渐下降。因此，综合分析考虑富集比E和酶活回收率R的影响，最后选定单因素条件下最优表面SDS浓度为0.3mg/mL。
实施例5
本实施例是改变泡沫分离体系中的pH，固定其它实验因素，比较不同pH下发酵罐培养液中β-葡聚糖酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收发酵罐β-葡聚糖酶的最适pH。
设计五组泡沫分离实验，样品液pH变化梯度为1，分别取4、5、6、7、8，其他条件为：通气速度400mL/min，装液体积为100mL，初始酶浓度为100μg/mL，表面活性剂浓度为0.4mg/mL，收集时间10min。结果如图6所示。
由实验结果可得，β-葡聚糖酶的酶活回收率R随着pH的增大而呈现先减小后小幅增大的趋势，在pH为4处有最大值54.25％。而β-葡聚糖酶的富集比E随着pH的增大呈现出先增大后减小的趋势，在pH为5处有最大值1.67。结合β-葡聚糖酶的性质和泡沫分离原理对实验结果进行分析可得，β-葡聚糖酶在偏弱酸性溶液中稳定性较强，最适pH为4～5，在这个范围内β-葡聚糖酶稳定性最强、活性最高，最容易被吸附，因此酶活回收率和富集比最高，而由于泡沫在碱性条件下更稳定因此样品液pH增至碱性后回收率又小幅上升。综合分析考虑富集比E和酶活回收率R的影响，最后选定单因素条件下最优样品液pH为5。
实施例6
根据单因素试验的结果，设计正交实验，通过均值和极差综合分析获得最佳泡沫分离摇瓶培养液中β-葡聚糖酶的最佳工艺条件；通过验证性实验，得到最终的回收率和富集比。
通过单因素实验已得出泡沫分离摇瓶β-葡聚糖酶的最佳条件为：通气速度600mL/min，装液体积为200mL，初始酶浓度为100μg/mL，表面活性剂浓度为0.3mg/mL，pH为5。根据最佳单因素条件及实际情况涉及五因素四水平正交试验，如表1所示。
表1β-葡聚糖酶分离正交试验因素及水平表
根据表1因素水平表设计五因素四水平共计16组正交试验，按照实验方法进行泡沫分离采收β-葡聚糖酶实验，实验设计和结果如表2所示。
表2β-葡聚糖酶正交试验方案及结果
表中分别表示五个单因素四个不同的水平所对应E的平均值，R表示各/>值的极差；/>分别表示五个单因素四个不同的水平所对应R的平均值，R’表示/>值的极差。
根据正交试验结果，对泡沫分离采收β-葡聚糖酶的富集比E的值及R值分布进行分析，如图7和8所示。对泡沫分离采收β-葡聚糖酶的酶活回收率R的/>值及R’值分布进行分析，如图9和10所示。
通过单因素实验得出发酵罐培养液中β-葡聚糖酶的泡沫分离采收单因素最佳分离条件为：通气速度600mL/min，装液体积为200mL，初始酶浓度为100μg/mL，表面活性剂浓度为0.3mg/mL，pH为5。通过单因素实验和正交实验得出的泡沫分离采收摇瓶培养液中的β-葡聚糖酶的最佳条件为：通气速度600mL/min，装液体积为200mL，初始酶浓度为100μg/mL，表面活性剂浓度为0.5mg/mL，pH为5。在该分离条件下，富集比E为0.56，回收率R为96.01％。
上述实施例仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (8)
1.发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于包括以下步骤：
1)发酵罐发酵生产 β-葡聚糖酶，得到 β-葡聚糖酶发酵液；
2)将步骤1)所得 β-葡聚糖酶发酵液配制成100 μg/mL的 β-葡聚糖酶溶液；
3)检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置的气浮管中；
4)打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至600 mL/min，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管的底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，从而带动分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中，测定泡沫液中的 β-葡聚糖酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比；
在步骤3）中，所述发酵液的装液体积为200 mL，pH为5，所述发酵液中含有表面活性剂SDS，表面活性剂SDS的浓度为0.5 mg/mL。
2.如权利权利要求1所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵罐采用Minifors 2台式标准发酵罐。
3.如权利权利要求1所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵采用重组毕赤酵母，培养基为BMGY培养基。
4.如权利权利要求1所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵罐的参数设置为，前期：温度30℃，搅拌速度800～1000 rpm，通气4L·min-1；诱导产酶期：发酵温度为25～30℃，流加甲醇诱导发酵108～120 h。
5.如权利权利要求4所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于所述发酵罐的参数设置为，前期：温度30℃，搅拌速度800rpm，通气4L·min-1；诱导产酶期：发酵温度为30℃，流加甲醇诱导发酵108h。
6.如权利权利要求1所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述泡沫分离装置由空气钢瓶、气瓶主阀、减压阀、调节阀、截止阀、转子流量计、气体分布器、气浮管、泡沫收集烧杯组成；所述空气钢瓶的出口经减压阀接调节阀的输入端，调节阀的输出端接截止阀的输入端，截止阀的输出端经转子流量计分别接气体分布器和残液排出阀，气体分布器的输出端接气浮管的输入端，气浮管的输出端接收集瓶。
7.如权利权利要求1所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤4)中，所述转子流量计采用型号为LZB-3WB的转子流量计，测量流量范围为100～1000mL/min。
8.如权利权利要求1所述发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述气浮管采用长度120cm、内径30mm的玻璃管。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111480580.5A CN113969271B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111480580.5A CN113969271B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113969271A CN113969271A (zh) | 2022-01-25 |
| CN113969271B true CN113969271B (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=79590741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111480580.5A Active CN113969271B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113969271B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2510542A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising a cyclodextrin glucanotransferase enzyme |
| CN101166423A (zh) * | 2005-04-29 | 2008-04-23 | 阿克伦大学 | 用于物质收集和纯化的亲合泡沫分馏 |
| CN102559641A (zh) * | 2011-12-29 | 2012-07-11 | 山东博奥克生物科技有限公司 | 重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶方法 |
| CN111593033A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-28 | 厦门大学 | 发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法 |
-
2021
- 2021-12-06 CN CN202111480580.5A patent/CN113969271B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2510542A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising a cyclodextrin glucanotransferase enzyme |
| CN101166423A (zh) * | 2005-04-29 | 2008-04-23 | 阿克伦大学 | 用于物质收集和纯化的亲合泡沫分馏 |
| CN102559641A (zh) * | 2011-12-29 | 2012-07-11 | 山东博奥克生物科技有限公司 | 重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶方法 |
| CN111593033A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-28 | 厦门大学 | 发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 大麦β-葡聚糖和啤酒泡沫的稳定性;张峻炎;;啤酒科技(第01期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113969271A (zh) | 2022-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ciani et al. | Combined use of immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wines | |
| Kwon et al. | Extractive lactic acid fermentation in poly (ethyleneimine)‐based aqueous two‐phase system | |
| Domingues et al. | Alcohol production from cheese whey permeate using genetically modified flocculent yeast cells | |
| RO122457B1 (ro) | Procedeu de fermentaţie continuă/în şarje pentru producere de alcooli potabili | |
| CN108330075B (zh) | 高产乙酸乙酯酵母及其在机械化清香型小曲白酒中的应用 | |
| CN112795491B (zh) | 一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法 | |
| CN106635934B (zh) | 一种嗜热型乳酸杆菌及人工添加该嗜热型乳酸杆菌的玉米浸泡方法 | |
| WO2014078924A1 (pt) | Processo e equipamento para fermentação contínua multiestagio com recuperação, reativação e reciclo de fermento para obtenção de vinhos com alto teor alcoólico | |
| Galindo et al. | Detergents improve xanthan yield and polymer quality in cultures of Xanthomonas campestris | |
| CN113969271B (zh) | 发酵液中β-葡聚糖酶的泡沫分离方法 | |
| CA2852406C (en) | Method involving contact between grain raw material liquid and yeast, grain raw material liquid and sparkling beverage | |
| CN1948462A (zh) | 一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用 | |
| CN115704001A (zh) | 己酸菌菌粉、其制造方法及应用 | |
| Maicas et al. | Continuous malolactic fermentation in red wine using free Oenococcus oeni | |
| WO2001002534A1 (fr) | Procede de production d'un produit de fermentation | |
| Jones et al. | The combined effects of oxygen supply strategy, inoculum size and temperature profile on very‐high‐gravity beer fermentation by Saccharomyces cerevisiae | |
| Palmieri et al. | Efficient flotation of yeast cells grown in batch culture | |
| CN112940952B (zh) | 一株高产己酸乙酯酵母菌及其应用 | |
| CN110358798B (zh) | 一种发酵生产井冈霉素的方法 | |
| Ciani et al. | Influence of temperature and oxygen concentration on the fermentation behaviour of Candida stellata in mixed fermentation with Saccharomyces cerevisiae | |
| CN113215007B (zh) | 一株高耐酸粟酒裂殖酵母及在酱香型白酒酿造中的应用 | |
| CN110452945B (zh) | 利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法 | |
| CN111593033A (zh) | 发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法 | |
| JP6229864B2 (ja) | 界面活性剤により改良したエタノール発酵法 | |
| Mishra et al. | A comparative evaluation of oxygen mass transfer and broth viscosity using Cephalosporin-C production as a case strategy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |