CN111593033A - 发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法 - Google Patents

Abstract

发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，属于泡沫分离技术领域。发酵罐发酵生产脂肪酶，得脂肪酶发酵液；发酵液配制成不同浓度的脂肪酶溶液，测定脂肪酶起泡能力与泡沫稳定性；检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置气浮管中；打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至所需值，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，带动、分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中，测定泡沫液中的脂肪酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。成本低、作用条件温和、操作简便，有效解决脂肪酶生产中产物抑制、分离困难、营养物质利用率低等问题。

Description

发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法

技术领域

本发明属于泡沫分离技术领域，具体是涉及利用脂肪酶自身的起泡性的一种发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法。

背景技术

脂肪酶(三酰基甘油水解酶，EC 3.1.1.3)，能催化三酰基甘油水解，生成甘油和脂肪酸^[1]，是一种十分具有生理意义和工业应用潜力的酶。脂肪酶在食品、洗涤剂、造纸和皮革行业等领域有重要应用^[2-5]。目前脂肪酶的主要生产方式是微生物发酵法，从发酵液中提纯脂肪酶的方法有：双水相萃取法、层析法、膜分离^[6-8]等,但双水相萃取有易乳化、相分离时间长、分辨效率低的缺点，层析法不能分离分子量接近的蛋白且有流速限制，膜分离法有膜污染的问题。因此，寻求成本低、效率高、产品质量好的脂肪酶分离技术成为了一个重要的发展目标。泡沫分离法有设备投资少、操作简单、环保无污染、能够分离浓度很低的物质、能耗低^[9,10]的特点，其在矿物浮选、废水处理、蛋白质分离^[11-13]等领域都有应用。泡沫分离法利用的是物质间的表面活性差异，有表面活性的物质或者能与表面活性物质结合的物质都能分离^[14]。泡沫分离法能有效分离微量溶质，因此采用此方法分离发酵液中的脂肪酶具有很大优势。

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发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的脂肪酶生产过程中产物抑制、分离困难、营养物质利用率低等问题，提供利用脂肪酶自身的起泡性，探究从发酵液中泡沫分离采收脂肪酶的工艺，并优化工艺条件的一种发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法。

本发明所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，包括以下步骤：

1)发酵罐发酵生产脂肪酶，得到脂肪酶发酵液；

2)将步骤1)所得脂肪酶发酵液配制成不同浓度的脂肪酶溶液，测定脂肪酶起泡能力与泡沫稳定性；

3)检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置的气浮管中；

4)打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至所需值，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管的底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，从而带动、分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中，测定泡沫液中的脂肪酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。

在步骤1)中，所述发酵罐可采用Minifors 2台式标准发酵罐；所述发酵可采用重组毕赤酵母，培养基为BSM无机培养基；所述发酵罐的参数设置可为，前期：温度30℃，搅拌速度1000rpm，通气4L·min^-1；诱导产酶期：发酵温度为20℃，流加甲醇诱导发酵140h；所得脂肪酶发酵液中酶浓度可在0.20～3.0mg/mL，发酵液的pH值为自然pH值。

在步骤2)中，所述测定脂肪酶起泡能力与泡沫稳定性的具体方法可为：配制六种不同浓度的脂肪酶溶液，测定不同浓度脂肪酶的起泡能力与泡沫稳定性；所述脂肪酶溶液的浓度可为0.10～0.50mg/mL。

在步骤3)中，所述泡沫分离装置可由空气钢瓶、气瓶主阀、减压阀、调节阀、截止阀、转子流量计、气体分布器、气浮管、泡沫收集烧杯组成；其中转子流量计可采用型号为LZB-3WB的转子流量计，测量流量范围为100～1000mL/min；所述气浮管可采用长度120cm、内径30mm的玻璃管；所述空气钢瓶的出口经减压阀接调节阀的输入端，调节阀的输出端接截止阀的输入端，截止阀的输出端经转子流量计分别接空气分布器和残液排出阀，空气分布器的输出端接气浮管的输入端，气浮管的输出端接收集瓶；所述发酵液的装液体积可为100～300mL。

在步骤4)中，所述通入空气的气速为200～1000mL/min。

本发明利用脂肪酶自身的起泡特性，结合泡沫分离技术，从脂肪酶发酵液中分离纯化了脂肪酶。本发明成本低、作用条件温和、操作简便，能有效地解决脂肪酶生产中产物抑制、分离困难、营养物质利用率低等问题。通过单因素实验得出发酵罐培养液中脂肪酶的泡沫分离采收单因素最佳分离条件为：分离气速400mL/min，装液体积100mL，初始酶浓度3.0 mg/mL，此时脂肪酶的富集比和回收率为1.53和74.0％。通过单因素实验和正交实验得出的泡沫分离采收摇瓶培养液中的脂肪酶的最佳条件为：分离气速500mL/min，装液体积150mL，初始酶浓度0.20mg/mL。在此条件下的富集比与回收率分别为9.76和92.8％。

附图说明

图1为泡沫分离装置示意图。图中各标记为：1-空气钢瓶；2-气瓶主阀；3-减压阀；4- 调节阀；5-截止阀；6-转子流量计；7-气体分布器；8-气浮管；9-泡沫收集烧杯。

图2为分离气速对摇瓶脂肪酶采收效果的影响曲线图。

图3为装液体积对摇瓶脂肪酶采收效果的影响曲线图。

图4为初始酶浓度对摇瓶脂肪酶采收效果的影响曲线图。

图5为分离气速对发酵罐脂肪酶采收效果的影响曲线图。

图6为装液体积对发酵罐脂肪酶采收效果的影响曲线图。

图7为初始酶浓度对发酵罐脂肪酶采收效果的影响曲线图。

图8为富集比E的

值分布图。

图9为富集比E的R值分布图。

图10为回收率R的

值分布图。

图11为回收率R的R’值分布图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

所述利用脂肪酶自身起泡性能，泡沫分离采收发酵液中脂肪酶的最佳工艺条件的步骤为：

1、发酵罐发酵生产脂肪酶

将毕赤酵母种子培养液接种至2L BSM无机培养基中，设定发酵罐参数为：温度30℃，搅拌速度1000rpm，通气4L·min^-1。当溶氧突然上升至某一数值时，通入200mL体积分数50％的甘油(含PTM1 12mL·L^-1)，取样检测，直到菌体湿重大于160g·L^-1。当溶氧量突然上升时，开始流加甲醇，速率为2％(含PTM1 12mL·L^-1)。设置发酵温度为20℃，流加甲醇诱导发酵140h，得到脂肪酶发酵液。将发酵液配制成不同浓度的脂肪酶溶液。

2、脂肪酶起泡能力与泡沫稳定性的测定：

配制六种不同浓度的脂肪酶溶液，取100mL引流注入玻璃管。打开气瓶阀门，调节空气流速为100mL/min，将通气1min时的高度记为起泡初始高度，该值反应起泡能力强弱。在通气1min后的0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0min分别记录泡沫高度，起泡稳定性以不同时间泡沫高度与起泡初始高度之比作为度量依据。

3、泡沫分离实验：

检查装置气密性，检查连接处是否正常，如图1，泡沫分离装置包括空气钢瓶1、气瓶主阀2、减压阀3、调节阀4、截止阀5、转子流量计6、气体分布器7、气浮管8、泡沫收集烧杯9。打开空气钢瓶1、气瓶主阀2和减压阀3，调节转子流量计6，将分离气速调整至所需值。将发酵液倒入气浮管8，从通气时开始计时，收集得到相应时间的泡沫。将泡沫液密封保存消泡，记录消泡后的泡沫液体积。

4、泡沫分离采收脂肪酶的单因素实验：

分别考察初始脂肪酶浓度、分离气速、装液体积对摇瓶和发酵罐培养液中脂肪酶的泡沫分离效果。测定原发酵液中脂肪酶的浓度和酶活，将发酵液引入泡沫分离装置，通入相应流速的空气，收集泡沫液，测定泡沫液中的脂肪酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。

5、摇瓶培养液中脂肪酶泡沫分离正交实验：

根据单因素取得的气速、装液体积和初始酶浓度最佳条件，选取各因素的研究水平值，设计三因素三水平正交表，按照该表的方案进行实验，从实验结果中分析得到各个因素对脂肪酶采收的影响程度，得出最佳工艺条件并进行验证。

6、分析方法

6.1脂肪酶浓度的测定

采用考马斯亮蓝染色法对脂肪酶浓度进行测定，在游离状态下考马斯亮蓝G-250呈红色，与蛋白质结合后呈青色，蛋白质-色素结合物的最大吸收波长在595nm处。在一定浓度范围内，光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可以测定蛋白质的含量。

6.2脂肪酶酶活的测定

量取18mLpH为6.8的磷酸缓冲液与5mL的三丁酸甘油酯于100mL锥形瓶中，摇晃锥形瓶使底物乳化。再加入1mL待测发酵液，置于30℃、200rpm恒温摇床中反应10min。反应过后滴加酚酞数滴，用NaOH标准溶液滴定，直到待测底物变色，并记录NaOH标准溶液所消耗的体积。酶活力单位(U)定义为30℃、pH 6.8的条件下，三丁酸甘油酯单位时间内水解生成1μmol丁酸所消耗的酶量。酶活(U)计算公式：

其中：A：酶活力(U·mL-¹)

V₀：NaOH标准溶液的消耗体积(mL)；

C₀：NaOH标准溶液的物质的量浓度(100mmol·L-¹)；

V_c：样品体积(1mL)；

t：反应时间(10min)。

6.3泡沫分离效果的评价

泡沫分离的效果用富集比(E)和酶活回收率(R)来评价：

式中，C₁为分离得到泡沫液中蛋白浓度，mg/mL；C₀为发酵液初始蛋白浓度，mg/mL；V₁为泡沫液体积，mL；V₀为发酵液初始体积，mL；A₁为分离得到的泡沫液酶活，U/mL；A₀为发酵液初始酶活，U/mL。

以下给出具体实施例。

实施例1

本实施例是改变发酵液中脂肪酶浓度，固定其它实验因素，比较不同浓度脂肪酶的起泡能力与泡沫稳定性。

步骤：配制六种不同浓度的脂肪酶溶液，取100mL引流注入玻璃管。打开气瓶阀门，调节空气流速为100mL/min，将通气1min时的高度记为起泡初始高度，该值反应起泡能力强弱。在通气1min后的0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0min分别记录泡沫高度，起泡稳定性以不同时间泡沫高度与起泡初始高度之比作为度量依据。六种浓度的脂肪酶发酵液的起泡能力与泡沫稳定性测定结果如表1所示。

表1

脂肪酶的起泡能力总体上随着脂肪酶浓度的上升而减弱。泡沫稳定性则随着脂肪酶浓度的增加有一个先下降再上升的趋势。总的来说，在已测定的浓度范围内，脂肪酶发酵液都有良好的起泡能力与泡沫稳定性，脂肪酶浓度为0.10mg/mL时起泡能力与泡沫稳定性最好。

实施例2

本实施例是改变泡沫分离体系中的分离气速，固定其它实验因素，比较不同分离气速下摇瓶培养液中脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶脂肪酶的分离气速。

确定摇瓶培养液中脂肪酶的初始浓度为0.30mg/mL，装液体积为100mL，收集时间为5 min，发酵液自然pH值为4.2。分离气速取值为300、400、500、600、700mL/min，分别对其进行泡沫分离实验，结果如图2所示。

由实验结果可知，脂肪酶的富集比随着分离气速的增加而减小，在气速为300mL/min时有最大值，为13.50。而脂肪酶的回收率总体上随着分离气速的增加而上升，在气速为700 mL/min时达到最大，为44.9％。气速低时，气液界面有充足的接触时间，使得吸附在气泡上的脂肪酶增加，于是脂肪酶的富集比就较大，但气泡离开液相之后，较低的气速使得气泡在出管的过程中流失了大量的水分，导致收集到的泡沫液量很少，这就使得回收率降低。综合富集比和回收率的影响，将分离气速的最佳条件定为500mL/min。

实施例3

本实施例是改变泡沫分离体系中的装液体积，固定其它实验因素，比较不同装液体积下摇瓶培养液中脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶脂肪酶的装液体积。

确定脂肪酶的初始浓度为0.20mg/mL，分离气速为500mL/min，收集时间为5min，发酵液自然pH值为4.2。装液体积取值为100、150、200、250、300mL，分别对其进行泡沫分离实验，结果如图3所示。

由实验结果可知，富集比随着装液体积的增加逐渐降低，在装液体积为100mL时富集比最大，为21.811。这是因为随着装液体积的增大，液相高度就越高，泡沫中的水分在气浮管内上升的过程中来不及排出，这样就增大了收集到的泡沫液的体积，分离得到的脂肪酶浓度也就随之降低，于是脂肪酶的富集比就下降了。而当装液体积增加时，脂肪酶的回收率有增大的趋势，装液体积为300mL时，回收率最大，为93.69％。因为装液体积越大，气泡在液相中的停留时间就越长，有利于脂肪酶在气液表面的吸附。综合两方面考虑，将装液体积单因素的最佳条件定为100mL。

实施例4

本实施例是改变泡沫分离体系中的初始酶浓度，固定其它实验因素，比较不同初始酶浓度下摇瓶培养液中脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收摇瓶脂肪酶的初始酶浓度。

确定分离气速为500mL/min，装液体积为100mL，收集时间为5min，发酵液自然pH值为4.2。初始酶浓度取值为0.25、0.35、0.45、0.55、0.65mg/mL，分别对其进行泡沫分离实验，结果如图4所示。

由实验结果可知，初始酶浓度较低时，有比较高的富集比，在酶浓度为0.35mg/mL时，富集比最大值为9.78。而较高的回收率则在初始酶浓度高的范围内出现，酶浓度为0.35mg/mL 时，回收率最大值为83.4％。这是因为初始酶浓度很低时，气浮管中产生的泡沫稀疏易破裂，对泡沫分离的效果有负面影响。而初始酶浓度过高又会使得泡沫中夹带大量的水，富集比就因此降低。所以，要想达到较好的分离效果，初始酶浓度就要取值适中，综合富集比和回收率来考虑，将最佳条件定在0.35mg/mL。

实施例5

本实施例是改变泡沫分离体系中的分离气速，固定其它实验因素，比较不同分离气速下发酵罐培养液中脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收发酵罐脂肪酶的初始酶浓度。

确定脂肪酶的初始浓度为6.2mg/mL，装液体积为100mL，收集时间为10min，发酵液自然pH值为6.0。分离气速取值为200、400、600、800、1000mL/min，分别对其进行泡沫分离实验，结果如图5所示。

结果表明，脂肪酶的富集比和回收率都在分离气速为400mL/min时有最大值，富集比最大值为1.86，回收率最大值为83.3％。富集比和回收率都是一个先增后减的趋势。分离气速比较低时，气泡在液相中的停留时间相对较长，有助于脂肪酶被吸附带出，但气速过低又会使泡沫不稳定，泡沫稀疏、破裂，对富集比和回收率产生影响。提高分离气速，会使液相湍动状态加剧，泡沫容易碰撞破裂，降低了富集比和回收率。综合分析，分离气速的最佳条件为400mL/min。

实施例6

本实施例是改变泡沫分离体系中的装液体积，固定其它实验因素，比较不同装液体积下发酵罐培养液中脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收发酵罐脂肪酶的装液体积。

确定脂肪酶的初始浓度为6.2mg/mL，分离气速为400mL/min，收集时间为10min，发酵液自然pH值为6.0。装液体积取值为50、100、150、200、250、300mL，分别对其进行泡沫分离实验，结果如图6所示。

结果表明，脂肪酶的富集比和回收率都在装液体积为100mL时有最大值，富集比最大值为1.86，回收率最大值为83.3％。回收率大致随着装液体积的增大而增大，因为装液体积越大，气泡在上升过程中吸附脂肪酶的时间就越长，更能有效提取脂肪酶。但装液体积太大也会导致泡沫排液不及，泡沫的含水量较大，使得分离后的脂肪酶浓度较低，富集比也因此减小。综合分析，装液体积的最佳条件为100mL。

实施例7

本实施例是改变泡沫分离体系中的初始酶浓度，固定其它实验因素，比较不同初始酶浓度下发酵罐培养液中脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收发酵罐脂肪酶的初始酶浓度。

确定泡沫分离的装液体积为100mL，分离气速为400mL/min，收集时间为10min，发酵液自然pH值为6.0。初始酶浓度取值为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mg/mL，分别对其进行泡沫分离实验，结果如图7所示。

从实验结果可得知，脂肪酶的富集比和回收率都在脂肪酶初始浓度为3.0mg/mL时有最大值，富集比最大值为1.53，回收率最大值为74.0％。随后当脂肪酶初始浓度升高时，富集比和回收率逐渐降低。这是由于当初始酶浓度很低时，泡沫极不稳定，收集到的泡沫量很少，此时的富集比较大但回收率比较低。当初始酶浓度增大时，产生的泡沫较细密稳定，对分离效果有积极的影响。而当初始酶浓度进一步增大，由于待分离发酵液是用稀释法配制的，液相中菌体的浓度也增大，将会增加液体的粘度，产生的泡沫容易破裂，且由于高浓度脂肪酶之间的缔合作用，都对富集比和回收率产生了负面影响。发酵罐生产的脂肪酶浓度远大于摇瓶生产的，主要原因是摇瓶发酵过程中缺乏pH的控制、通气量不足、对碳源和甲醇的补料控制不够理想等。综合分析，初始酶浓度的最佳条件为3.0mg/mL。

实施例8

根据单因素试验的结果，设计正交实验，通过均值和极差综合分析获得最佳泡沫分离摇瓶培养液中脂肪酶的最佳工艺条件；通过验证性实验，得到最终的回收率和富集比。

通过单因素实验已得出泡沫分离摇瓶脂肪酶的最佳条件为：初始酶浓度0.35mg/mL，分离气速500mL/min，装液体积100mL。在最佳分离条件附近取值，设计正交实验，如表2所示。

表2

根据表2的因素水平，进行摇瓶脂肪酶的泡沫分离实验，实验方案和结果分析如表3所示。

分别为各单因素各水平所对应富集比E的平均值，R值为各

值的极差；

分别为各单因素各水平所对应回收率R的平均值，R’值为各

值的极差。图 8及图9显示了富集比E的

值及R值分布，图10和11显示了酶活回收率R的

值及R’值分布。

表3

将回收率R作为衡量泡沫分离脂肪酶的指标，由实验结果分析可得，泡沫分离的最佳条件为：分离气速500mL/min，装液体积150mL，初始酶浓度0.20mg/mL。在此条件下进行泡沫分离实验，富集比为9.76，回收率达到了92.8％。从分析结果得到，各因素对回收率的影响的主次关系为：装液体积>初始酶浓度>分离气速。

综上所述，脂肪酶在一定浓度范围内有较好的起泡能力与泡沫稳定性。发酵罐培养液中脂肪酶的泡沫分离采收单因素最佳分离条件为：分离气速400mL/min，装液体积100mL，初始酶浓度3.0mg/mL，此时脂肪酶的富集比和回收率为1.53和74.0％。正交实验得出的泡沫分离采收摇瓶培养液中的脂肪酶的最佳条件为：分离气速500mL/min，装液体积150mL，初始酶浓度0.20mg/mL。在此条件下的富集比与回收率分别为9.76和92.8％。

Claims (10)

1.发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1)发酵罐发酵生产脂肪酶，得到脂肪酶发酵液；

2)将步骤1)所得脂肪酶发酵液配制成不同浓度的脂肪酶溶液，测定脂肪酶起泡能力与泡沫稳定性；

3)检查泡沫分离装置气密性，将发酵液引入泡沫分离装置的气浮管中；

4)打开气瓶主阀和减压阀，调节转子流量计，将分离气速调整至所需值，向发酵液中通入空气，气体抵达气浮管的底部，在气体分布器上均匀分布并向上输送，从而带动、分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由气浮管顶端排出，并收集到泡沫收集烧杯中，测定泡沫液中的脂肪酶的浓度和酶活，并计算泡沫分离的回收率和酶活富集比。

2.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵罐采用Minifors 2台式标准发酵罐。

3.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵采用重组毕赤酵母，培养基为BSM无机培养基。

4.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵罐的参数设置为，前期：温度30℃，搅拌速度1000rpm，通气4L·min^-1；诱导产酶期：发酵温度为20℃，流加甲醇诱导发酵140h。

5.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤1)中，所述脂肪酶发酵液中酶浓度在0.20～3.0mg/mL，发酵液的pH值为自然pH值。

6.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤2)中，所述测定脂肪酶起泡能力与泡沫稳定性的具体方法为：配制六种不同浓度的脂肪酶溶液，测定不同浓度脂肪酶的起泡能力与泡沫稳定性；所述脂肪酶溶液的浓度可为0.10～0.50mg/mL。

7.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述泡沫分离装置由空气钢瓶、气瓶主阀、减压阀、调节阀、截止阀、转子流量计、气体分布器、气浮管、泡沫收集烧杯组成；所述空气钢瓶的出口经减压阀接调节阀的输入端，调节阀的输出端接截止阀的输入端，截止阀的输出端经转子流量计分别接空气分布器和残液排出阀，空气分布器的输出端接气浮管的输入端，气浮管的输出端接收集瓶。

8.如权利要求7所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述转子流量计采用型号为LZB-3WB的转子流量计，测量流量范围为100～1000mL/min；所述气浮管采用长度120cm、内径30mm的玻璃管。

9.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述发酵液的装液体积为100～300mL。

10.如权利要求1所述发酵液中脂肪酶的泡沫分离方法，其特征在于在步骤4)中，所述通入空气的气速为200～1000mL/min。

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