CN113967262B - 一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统、制备方法及应用 - Google Patents

一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨层级靶向‑超声触发式药物递送系统，外部一级骨组织靶向‑超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体，所述内部二级成骨细胞靶向载药脂质体包载于外部一级骨组织靶向‑超声触发式脂质体的亲水性内核内。本发明的药物递送系统通过分别制备骨组织靶向‑超声触发式脂质体和成骨细胞靶向载药脂质体，然后将两者融合得到。本发明的药物递送系统可将包载的药物精准、可控释放于骨质疏松(OP)条件下骨折、骨缺损部位，提高骨损伤部位药物富集浓度与药物生物利用度，降低正常组织毒性，有效促进OP条件下的骨折、骨缺损的愈合。

Description

一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统、制备方法及应用
技术领域
本发明属于药物递送系统技术领域，具体涉及一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统、制备方法及应用。
背景技术
骨质疏松(osteoporosis，OP)是骨代谢异常的系统性骨病，代谢异常导致成骨细胞(Osteoblast，OB)的成骨能力下降、骨质流失、骨量降低、骨微结构受损、骨小梁减少、骨质变薄，从而导致骨脆性增加，最易发生骨折，OP患者骨折后，由于骨折部位OB成骨能力降低，新骨的形成延迟，愈合延迟，甚至不愈合，易伴发骨缺损。
目前，临床治疗方法主要为手术治疗和药物治疗，手术治疗主要有手术固定和利用自体或异体骨、骨修复支架、骨水泥移植修复骨缺损部位，但都存在一定的缺点，如：断端难以加压有效固定；骨与移植物界面结合效果较差；异体骨和人工修复材料等存在病原体、免疫排斥等生物安全性问题；药物治疗主要是通过应用各种促骨形成或抑制破骨的药物，如促骨形成药物：特立帕肽、雷洛昔芬、阿仑膦酸钠、利塞膦酸钠、伊班膦酸钠、唑来膦酸、狄诺塞麦、组织蛋白酶K抑制剂、V-ATP酶抑制剂、αvβ3整联蛋白受体拮抗剂、雷奈酸锶和和促骨生成的核酸类药物；其中生物多肽及核酸类大分子药物，物理、化学稳定性差，血液循环半衰期短，药物作用时效有限；这些成骨药物在治疗中对骨组织或骨相关细胞的影响缺乏特异性，对其正常器官和组织的存在潜在的毒性，易引发多种副作用；并且由于OP性骨折、骨缺损一般发生在骨骼局部，这些药物无靶向性，全身分布，促进OP性骨折、骨缺损骨愈合效果甚微。
随着纳米技术的发展，现已开发多种人工纳米载体用于体内药物递送，由于人体组织包含纳米尺度(1-100nm)的分层结构，纳米载体尺寸与人体组织结构尺寸接近，控制纳米载体尺寸，可使其易于穿透体内生物屏障，有效提高了药物体内递送效率。这些纳米载体相对于传统药物具有以下优点：增加药物溶解度，提高药物稳定性与血液循环时间，改变了药物全身生物分布，如脂质体、聚合物、聚合肽、磷酸钙和金属纳米颗粒等。其中脂质体是一种由磷脂双分子层构成的微型囊泡，主要由磷脂和胆固醇组成，具有包载效率高、生物相容性好、无免疫原性和可修饰等优点，已被广泛用于多种药物体内递送。但是这些人工的递送系统缺乏靶向性，存在肝脏积聚及网状内皮系统(Reticular endothelial system，RES)清除的问题，导致的骨组织药物分布浓度低，通过对脂质体表面PEG、骨组织和OB靶向分子修饰，骨靶向分子包括双磷酸盐类、四环素、重复多肽序列Asp8和(DSS)6，靶向OB的单链小核酸适体CH6，可有效提高药物骨组织及OB有效富集。然而，OP引起的骨折、骨缺损相关骨病，发生于骨折、骨缺损部位，现有的靶向骨组织或OB分子，将药物分布于全身骨骼及OB，极大的降低损伤部位药物的生物利用度，降低了治疗效果，使得药物高剂量使用，亦存在潜在的全身毒性。
随着多交叉学科的发展，药物控释技术也受到越来越多的科研、医学工作者的关注，通过外部刺激，实现可控给药，比较常见的外部刺激有温度、pH、光、声、电和磁场等，其中超声能够无创的穿透组织，穿透深层组织，聚焦超声可精确控制作用位点，研究报道，声敏剂可响应超声，触发用于药物释放；低频脉冲超声可促进成骨，同时超声在治疗过程中可获得组织的结构影像，诊断发病与治疗进程，是实现精准、诊疗一体化的有效手段。开发合适的针对OP性骨折、骨缺损的药物靶向、触发式系统，并结合外部物理触发手段对于OP性骨相关疾病精准、可控治疗具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统、制备方法及应用。
本发明的第一个目的是提供一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统，
包括外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体，所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体均为两亲性磷脂分子形成的具有亲水性外壳和内核以及疏水性双层间结构的脂质体，所述内部二级成骨细胞靶向载药脂质体包载于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的亲水性内核内；
所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的亲水性外壳上分别连接有一级骨组织靶向分子和二级成骨细胞靶向分子，所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的亲水性外壳或疏水双层间上连接有声敏分子，内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的亲水性内核内包载有成骨治疗药物。
优选的，所述一级骨组织靶向分子为双磷酸盐、四环素、天冬氨酸六重复序列(Asp)6、天冬氨酸八重复序列(Asp)8、天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸六重复序列(DSS)6中的一种，所述二级成骨细胞靶向分子为核酸适体CH6。
优选的，所述声敏分子为卟啉类、玫瑰红、叶绿素及其衍生物、酞菁、吲哚菁绿(ICG)中的一种。
优选的，所述成骨治疗药物为特立帕肽、雷洛昔芬、双磷酸盐类、狄诺塞麦、组织蛋白酶K抑制剂、V-ATP酶抑制剂、αvβ3整联蛋白受体拮抗剂、雷奈酸锶、CKIP-1siRNA、SOSTsiRNA、miRNA、过表达质粒中的一种。
本发明的第二个目的是提供一种上述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
S1、将一级骨组织靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(Chol-PEG-Mal)反应，反应结束后，冷冻干燥，得到骨组织靶向脂质；
S2、将二级成骨细胞靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(Chol-PEG-Mal)反应，反应结束后，冷冻干燥，得到成骨细胞靶向脂质；
S3、将胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(Chol-PEG-Mal)与声敏分子在室温避光下反应，反应结束后，冷冻干燥，得到声敏脂质；
S4、将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)、步骤S1得到的骨组织靶向脂质和步骤S3得到的声敏脂质在溶剂中混合，氮气吹干、干燥、水化、冷冻、挤压，加入冻干保护剂冷冻干燥，得到外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体；
S5、将(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)和步骤S2得到的成骨细胞靶向脂质在溶剂中混合，氮气吹干、干燥、水化、冷冻、挤压，得到成骨细胞靶向脂质体，然后加入成骨治疗药物，室温孵育20～60min，透析除去未包载的成骨治疗药物，加入冻干保护剂冷冻干燥，得到内部二级成骨细胞靶向载药脂质体；
S6、将步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二级成骨细胞靶向载药脂质体在室温下混合，并加入氯化镁孵育20～60min，使内部二级成骨细胞靶向载药脂质体融合于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体内部，除去多余的Mg2+，得到所述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统。
优选的，步骤S1中，所述一级骨组织靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(Chol-PEG-Mal)的摩尔比为1～3:1，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，反应时间为24h。
优选的，步骤S2中，所述二级成骨细胞靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(Chol-PEG-Mal)的摩尔比为1～3:1，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，反应时间为24h，步骤S1和步骤S2中，还包括除去未反应的反应物。
优选的，步骤S3中，所述声敏分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(Chol-PEG-Mal)的摩尔比为1～3:1，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，反应时间为24h，步骤S3中还包括除去未反应的反应物。
优选的，步骤S4中，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000、步骤S1得到的骨组织靶向脂质和步骤S3得到的声敏脂质的摩尔比为40～60:30～40:5:1～5:1～5，溶剂为氯仿；步骤S5中，所述(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000和步骤S2得到的成骨细胞靶向脂质的摩尔比为40～70:15:8～38:1～5:1～2，且成骨治疗药物与成骨细胞靶向脂质体的摩尔比为1:10，溶剂为氯仿；步骤S6中，所述步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的摩尔比为1:1，溶剂为氯仿；步骤S4和步骤S5中，所述冻干保护剂为甘露糖、乳糖、葡萄糖、氨基酸、蔗糖和聚乙二醇中的一种或至少两种组合。
本发明的第三个目的是提供一种上述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统在制备治疗骨损伤制剂中的应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本发明提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统通过层级靶向方式可精准靶向骨，利用一级靶向骨组织将药物递送系统靶向高效富集于骨组织，二级靶向成骨细胞，有效提高药物稳定性，和药物进入成骨细胞效率；
(2)本发明通过外部超声物理手段，可精准控制治疗时间与治疗部位，可控触发声敏分子，外部脂质体渗透性增加，从而释放内部脂质体，利用内部脂质体表面的二级成骨细胞靶向分子精准靶向成骨细胞，将包载的药物有效释放于骨折、骨缺损部位，而不影响其他正常骨组织，提高骨损伤部位药物富集浓度与药物生物利用度，降低正常组织毒性。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统结构示意图；
图2为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统在体内释放的原理图；
图3为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的粒径图；
图4为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的Zeta电位图；
图5为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的透射电镜图；
图6为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统中包载药物的包载效率图；
图7为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统中的包载药物稳定性图；
图8为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统以及非靶向组的体外靶向性能图；
图8(a)为本发明实施例1提供的药物递送系统的体外靶向性能图；图8(b)为非靶向组的体外靶向性能图；
图9为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式递送系统的体外超声响应药物释放性能图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
如图1所示，本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统，包括外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体，所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体均为两亲性磷脂分子形成的具有亲水性外壳和内核以及疏水性双层间结构的脂质体，所述内部二级成骨细胞靶向载药脂质体包载于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的亲水性内核内；
所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的亲水性外壳上分别连接有一级骨组织靶向分子和二级成骨细胞靶向分子，所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的亲水性外壳或疏水双层间上连接有声敏分子，内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的亲水性内核内包载有成骨治疗药物。
本发明实施例中的一级骨组织靶向分子为天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸6的重复序列((DSS)6)，二级成骨细胞靶向分子为核酸片段适体CH6，声敏分子为吲哚菁绿(ICG)，成骨治疗药物为CKIP-1siRNA。
本发明实施例还提供了一种上述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
S1、将122.2mg的Chol-PEG-Mal与92.85mg的(DSS)6溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氩气，室温搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待(DSS)6彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为3000Da)将未反应的Chol-PEG-Mal透析去除，将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，核磁共振检测、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20℃冰箱储存，得到骨组织靶向脂质体Chol-PEG-(DSS)6；
S2、将122.2mg的Chol-PEG-Mal与458.75mg的核酸适体CH6溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氩气，室温搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待核酸适体CH6彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为10000Da)将未反应的Chol-PEG-Mal透析去除。将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20冰箱储存，得到成骨细胞靶向脂质体Chol-PEG-CH6；
S3、将122.2mg的Chol-PEG-Mal与38.748mg的ICG溶解于10ml的DMF中，通入氩气，室温避光搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待ICG彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为3000Da)将未反应的溶血磷脂-Mal透析去除。将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20℃冰箱避光储存，得到声敏脂质体Chol-PEG-ICG；
S4、将10.86mg的DSPC、3.48mg的Chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000、2mg的步骤S1得到的Chol-PEG-(DSS)6和1.6mg的步骤S3得到的Chol-PEG-ICG溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h，将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，降至室温，在制备的脂质体加入甘露糖，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，得到外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体；
S5、将6.99mg的DOTAP、2.79mg的DOPE、3.67mg的Chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000和9.17mg的步骤S2得到的DSPE-PEG-CH6溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm、50nm聚碳酸酯膜，10个循环，降至室温，在制备的脂质体加入葡萄糖，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，然后加入经过DEPC处理过并含有25nmol的CKIP-1siRNA的水溶液，室温孵育20min，使用透析法除去未包载至脂质体内部的多余CKIP-1siRNA，得到内部二级成骨细胞靶向载药脂质体；
S6、将步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二级成骨细胞靶向载药脂质体按照摩尔比1:1在室温下混合，并加入MgCl2孵育20min，使内部二级成骨细胞靶向载药脂质体融合于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体内部，透析除去多余的Mg2+，得到所述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统。
实施例2
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S1不同，本发明实施例的步骤S1的具体操作过程为：
S1、将244.4mg的Chol-PEG-Mal与92.85mg的(DSS)6溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氩气，室温搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待(DSS)6彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为3000Da)将未反应的胆固醇-PEG-Mal透析去除，将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20℃冰箱储存，得到骨组织靶向脂质体Chol-PEG-(DSS)6。
实施例3
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S1不同，本发明实施例的步骤S1的具体操作过程为：
将366.6mg的Chol-PEG-Mal与92.85mg的(DSS)6溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氩气，室温搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待(DSS)6彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为3000Da)将未反应的胆固醇-PEG-Mal透析去除，将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20℃冰箱储存，得到骨组织靶向脂质体Chol-PEG-(DSS)6。
实施例4
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S2不同，本发明实施例的步骤S2的具体操作过程为：
将244.4mg的Chol-PEG-Mal与458.75mg的核酸适体CH6溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氩气，室温搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待核酸适体CH6彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为10000Da)将未反应的胆固醇-PEG-Mal透析去除。将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20冰箱储存，得到成骨细胞靶向脂质体DSPE-PEG-CH6。
实施例5
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S2不同，本发明实施例的步骤S2的具体操作过程为：
将366.6mg的Chol-PEG-Mal与458.75mg的核酸适体CH6溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氩气，室温搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待核酸适体CH6彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为10000Da)将未反应的胆固醇-PEG-Mal透析去除。将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20冰箱储存，得到成骨细胞靶向脂质体DSPE-PEG-CH6。
实施例6
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S3不同，本发明实施例的步骤S3的具体操作过程为：
将244.4mg的Chol-PEG-Mal与38.75mg的ICG溶解于10ml的三氯甲烷中，通入氩气，室温避光搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待ICG彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为3000Da)将未反应的溶血磷脂-Mal透析去除。将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20℃冰箱避光储存，得到声敏脂质体Chol-PEG-ICG。
实施例7
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S3不同，本发明实施例的步骤S3的具体操作过程为：
将366.6mg的Chol-PEG-Mal与38.75mg的ICG溶解于10ml的三氯甲烷中，通入氩气，室温避光搅拌反应24h，使用高效液相监测反应进程，待ICG彻底反应完，使用透析袋(透析袋分子量为3000Da)将未反应的溶血磷脂-Mal透析去除。将得到的反应终产物使用冷冻干燥机干燥，对其进行核磁共振、红外光谱检测，进一步确定合成产物为目标产物，样品置于-20℃冰箱避光储存，得到声敏脂质体Chol-PEG-ICG。
实施例8
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S4不同，本发明实施例的步骤S4的具体操作过程为：
将10.86mg的DSPC、3.58mg的Chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000、2mg的步骤S1得到的Chol-PEG-(DSS)6和0.8mg的步骤S3得到的Chol-PEG-ICG溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，降至室温，在制备的脂质体中加入乳糖，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，得到外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体。
实施例9
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S4不同，本发明实施例的步骤S4的具体操作过程为：
将10.86mg的DSPC、3.29mg的Chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000、2mg的步骤S1得到的Chol-PEG-(DSS)6和3.2mg的步骤S3得到的Chol-PEG-ICG溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，降至室温，在制备的脂质体加入聚乙二醇，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，得到外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体。
实施例10
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S5不同，本发明实施例的步骤S5的具体操作过程为：
将8.74mg的DOTAP、2.79mg的DOPE、2.70mg的chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000和9.17mg的步骤S2得到的DSPE-PEG-CH6溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm、50nm聚碳酸酯膜，10个循环，降至室温，在制备的脂质体加入葡萄糖，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，然后加入经过DEPC处理过并含有CKIP-1siRNA的水溶液，室温孵育40min，使用透析法除去未包载至脂质体内部的多余siRNA，得到内部二级成骨细胞靶向载药脂质体。
实施例11
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S5和步骤S6不同，本发明实施例的步骤S5和S6的具体操作过程为：
S5、将10.49mg的DOTAP、2.79mg的DOPE、1.74mg的chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000和9.17mg的步骤S2得到的DSPE-PEG-CH6溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm、50nm聚碳酸酯膜，10个循环，降至室温，在制备的脂质体加入葡萄糖，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，然后加入经过DEPC处理过并含有CKIP-1siRNA的水溶液，室温孵育60min，使用透析法除去未包载至脂质体内部的多余siRNA，得到内部二级成骨细胞靶向载药脂质体；
S6、将步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二级成骨细胞靶向载药脂质体按摩尔比1:1在室温下混合，并加入Mg2+孵育40min，使成骨细胞靶向载药脂质体融合于骨组织靶向-超声触发式脂质体内部，透析法除去多余的Mg2+，得到所述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统。
实施例12
本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于步骤S5和步骤S6不同，本发明实施例的步骤S5和S6的具体操作过程为：
S5、将12.24mg的DOTAP、2.79mg的DOPE、0.77mg的chol、3.51mg的DSPE-PEG-2000和9.17mg的步骤S2得到的DSPE-PEG-CH6溶解在氯仿中，并加入试管中，将试管固定于氮气吹干装置上，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，去除氯仿，形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体；接着将其放入真空干燥罐内，抽真空干燥3～4h将残余溶剂充分挥发，然后使用1mL pH＝7.2-7.4的0.01M PBS在50℃水浴中振荡，水化试管中的脂质薄膜，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在40℃迅速融化并涡旋5个循环，使用挤压器挤压水化脂质体液体，依次通过200nm、100nm、50nm聚碳酸酯膜，10个循环，降至室温，在制备的脂质体加入葡萄糖，置于-80℃冰箱，预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，然后加入经过DEPC处理过并含有CKIP-1siRNA的水溶液，室温孵育60min，使用透析法除去未包载至脂质体内部的多余siRNA，得到内部二级成骨细胞靶向载药脂质体；
S6、将步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二级成骨细胞靶向载药脂质体按摩尔比1:1在室温下混合，并加入MgCl2孵育60min，使成内部二级骨细胞靶向载药脂质体融合于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体内部，透析法除去多余的Mg2+，得到所述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统。
本发明实施例1-12所提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的性能基本相同，因此下面仅以本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统为例，对其内部释放原理以及各项性能进行研究
图2为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统在体内释放的原理图。如图2所示，本发明实施例1提供的药物递送系统利用静脉注射的方式进行体内注射，进入血液之后随着血液循环在该递送系统全身分布，该递送系统借助外部脂质体上修饰的骨靶向分子首先靶向骨组织，并在骨组织中富集，根据需要治疗的骨折部位与骨缺损部位，采用局部超声触发外部脂质体上的声敏分子，使得外部脂质体渗透性增加，从而精准可控的使内部脂质体释放，内部脂质体借助成骨细胞靶向分子进一步向成骨细胞富集，将携载的成骨治疗药物高效递送至成骨细胞，提高成骨细胞成骨能力，实现骨折、骨损伤的精准控制、层级靶向治疗，可有效提高药物利用度，按需精准释放，降低毒副作用，加快治疗进程。
图3为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的粒径图。通过图3可以看出，本发明实施例1制备的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统粒径分布在100nm左右，粒径分散均一。
图4为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的Zeta电位图。通过图4可以看出，本发明实施例1制备的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统Zeta电位为正电荷，绝对值大于30mV，证明制备的药物递送系统可稳定分散与溶液中，不易聚集沉淀。
图5为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的透射电镜图。通过图5可以看出，制备的的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统呈球形结构，外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体包裹内部二级骨细胞靶向载药脂质体，共同形成该递送系统。
图6为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的包载药物包载效率图。将siRNA与内部脂质室温孵育，并通过透析法将未包载的siRNA去除，通过计算得出该系统的基因药物包载效率，通过图6可以看出该递送系统包载效率高达75.67％。
图7为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统以及游离的siRNA的包载药物稳定性对比图。通过模拟体内条件，将本发明实施例1制备的药物递送系统与游离的siRNA分别置于含有50％胎牛血清的PBS中，于37℃下孵育，提取样品中的siRNA，通过琼脂糖凝胶电泳法检测样品中剩余的siRNA。通过图7可以看出，本发明实施例1制备的药物递送系统的稳定性显著增强，说明本发明实施例1制备的药物递送系统可有效保护基药物不被降解。
图8为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统体外靶向性能图。将本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统与非靶向组(在脂质体制备过程中未加入靶向骨组织获成骨细胞分子得到的脂质体)分别使用膜染料Dir进行标记，与MC3T3细胞孵育，然后用4％的甲醛于4℃下固定过夜，使用激光共聚焦拍照，检测成骨细胞靶向性能，通过图8可以看出，与非靶向组相比，本发明实施例1制备的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统在成骨细胞内荧光强度增强，说明该递送系统具有成骨细胞靶向能力，可有效靶向成骨细胞。
图9为本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式递送系统的体外超声响应药物释放性能图；药物释放性能测试具体是：将本发明实施例1提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统，置于超声下进行超声处理，分别选用处理时间1min，2min，4min，处理后，使用10000Da的透析袋进行透析2h，去除释放的的钙黄绿素，检测透析袋内该递送系统未释放的钙黄绿素荧光强度含量，计算药物释放率评估脂质体超声触发释药性能，通过图9可以看出，该递送系统在超声激发可实现药物的释放，并可随着超声时间的延长，该递送系统内部药物释放量越大，说明超声可实现该药物的控制释放。
综上所述，本发明实施例提供的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统，通过外部脂质体上修饰的骨靶向分子首先靶向骨组织，并在骨组织中富集，根据需要治疗的骨折部位与骨损伤部位，采用局部超声触发精准控制内部脂质体释放，内部脂质体借助成骨细胞靶向分子进一步向成骨细胞富集，将携载的成骨治疗药物高效递送至成骨细胞，提高成骨细胞成骨能力，实现骨折、骨损伤的精准层级靶向、可控药物释放治疗，可有效提高药物利用度，按需精准释放，降低毒副作用，加快治疗进程。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种骨层级靶向-超声触发式药物递送系统，其特征在于，由外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体组成，所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体均为两亲性磷脂分子形成的具有亲水性外壳和内核以及疏水性双层间结构的脂质体，所述内部二级成骨细胞靶向载药脂质体包载于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的亲水性内核内；
所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体和内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的亲水性外壳上分别连接有一级骨组织靶向分子和二级成骨细胞靶向分子，所述外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的亲水性外壳或疏水双层间上连接有声敏分子，内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的亲水性内核内包载有成骨治疗药物；
所述的一级骨组织靶向分子为天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸六重复序列(DSS)6，二级成骨细胞靶向分子为核酸片段适体CH6，声敏分子为吲哚菁绿，成骨治疗药物为CKIP-1siRNA；
所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，由以下步骤组成：
S1、将一级骨组织靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺反应，反应结束后，冷冻干
燥，得到骨组织靶向脂质；
S2、将二级成骨细胞靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺反应，反应结束后，冷冻
干燥，得到成骨细胞靶向脂质；
S3、将胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺与声敏分子在室温避光下反应，反应结束后，冷冻
干燥，得到声敏脂质；
S4、将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000、步骤S1得到的骨组织靶向脂质和步骤S3得到的声敏脂质在溶剂中混合，氮气吹干、干燥、水化、冷冻、挤压，加入冻干保护剂冷冻干燥，得到外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体；
S5、将(2 ,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙
酰胺-聚乙二醇2000和步骤S2得到的成骨细胞靶向脂质在溶剂中混合，氮气吹干、干燥、水
化、冷冻、挤压，得到成骨细胞靶向脂质体，然后加入成骨治疗药物，室温孵育20～60min，透析除去未包载的成骨治疗药物，加入冻干保护剂冷冻干燥，得到内部二级成骨细胞靶向载
药脂质体；
S6、将步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二
级成骨细胞靶向载药脂质体在室温下混合，并加入氯化镁孵育20～60min，使内部二级成骨
细胞靶向载药脂质体融合于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的内部，除去多余的 Mg2+，得到所述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统。
2.一种根据权利要求1所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将一级骨组织靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺反应，反应结束后，冷冻干
燥，得到骨组织靶向脂质；
S2、将二级成骨细胞靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺反应，反应结束后，冷冻
干燥，得到成骨细胞靶向脂质；
S3、将胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺与声敏分子在室温避光下反应，反应结束后，冷冻
干燥，得到声敏脂质；
S4、将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000、步骤S1得到的骨组织靶向脂质和步骤S3得到的声敏脂质在溶剂中混合，氮气吹干、干燥、水化、冷冻、挤压，加入冻干保护剂冷冻干燥，得到外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体；
S5、将(2 ,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙
酰胺-聚乙二醇2000和步骤S2得到的成骨细胞靶向脂质在溶剂中混合，氮气吹干、干燥、水
化、冷冻、挤压，得到成骨细胞靶向脂质体，然后加入成骨治疗药物，室温孵育20～60min，透析除去未包载的成骨治疗药物，加入冻干保护剂冷冻干燥，得到内部二级成骨细胞靶向载
药脂质体；
S6、将步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到的内部二
级成骨细胞靶向载药脂质体在室温下混合，并加入氯化镁孵育20～60min，使内部二级成骨
细胞靶向载药脂质体融合于外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体的内部，除去多余的 Mg2+，得到所述骨层级靶向-超声触发式药物递送系统。
3.根据权利要求2所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，其特征在
于，步骤S1中，所述一级骨组织靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为1～3: 1，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，反应时间为24h。
4.根据权利要求2所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述二级成骨细胞靶向分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为1～3:1，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，反应时间为24h，步骤S1和步骤S2中，还包括除去未反应的反应物。
5.根据权利要求2所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述声敏分子与胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为1～3:1，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，反应时间为24h，步骤S3中还包括除去未反应的反应物。
6.根据权利要求2所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000、
步骤S1得到的骨组织靶向脂质和步骤S3得到的声敏脂质的摩尔比为40～60:30～40:5:1～ 5:1～5，溶剂为氯仿；
步骤S5中，所述(2 ,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000和步骤S2得到的成骨细胞靶向脂质的摩尔比为40～70:15:15～40:1～5:1～5，且成骨治疗药物与成骨细胞靶向脂质体的摩尔比为1:10，溶剂为氯仿；
步骤S6中，所述步骤S4得到的外部一级骨组织靶向-超声触发式脂质体与步骤S5得到
的内部二级成骨细胞靶向载药脂质体的摩尔比为1:1，步骤S4和步骤S5中，所述冻干保护剂为甘露糖、乳糖、葡萄糖、氨基酸、蔗糖和聚乙二醇中的一种或至少两种组合。
7.一种根据权利要求1所述的骨层级靶向-超声触发式药物递送系统在制备治疗骨损伤制剂中的应用。
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