CN113959928A - 多潜能基质细胞(msc)群体的免疫调节潜力 - Google Patents

多潜能基质细胞(msc)群体的免疫调节潜力 Download PDF

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Abstract

提供了评估多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的方法。这些方法的方面包括评价与MSC群体的样本中的MSC关联的CD54/IL‑6的量，以获得CD54/IL‑6结果并且基于获得的CD54/IL‑6结果提供MSC群体的免疫调节潜力的评估。还提供了在实践这些主题方法中发现用途的系统和试剂盒。

Description

多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力
本申请是申请日为2014年10月31日、申请号为201480051414.5、发明名称为“多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力”、进入中国国家阶段日为2016年03月17日的中国专利申请的分案申请。
相关申请交叉参考
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年11月4日提交的美国临时专利申请序列号61/899,835的提交日期的优先权，并将该申请的披露通过引用结合于此。
引言
由于其再生特性和免疫调节潜力，多潜能基质细胞(MSC)，在该领域中也称为间充质干细胞具有多种治疗用途。通过它们对塑料的粘附，它们的CD73、CD90和CD105的表达，和它们产生多个间充质谱系(特别是成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞)的潜力，细胞疗法国际联协会(The International Society for Cellular Therapy)将MSC进行分类。然而，MSC没有明确的定义，这是由于源自起源组织和培养条件的MSC群体中的差异。MSC典型地是免疫抑制性的，并且已经示出，抑制T细胞和B细胞增殖，促进T细胞的某些亚群的T细胞分化为调节性T细胞，并且抑制单核细胞分化为树状细胞。当MSC激活后，例如通过暴露于IFN-γ和/或TNF-α，这一免疫调节潜力典型地增加。可溶性因子和直接细胞间接触是MSC免疫调节活性的机制。
此类免疫调节潜力使MSC成为一种候选细胞疗法，用于自身免疫的和/或炎症疾病，包括但不限于移植物抗宿主疾病、克罗恩病、和多发性硬化症。另外的因素使MSC成为用于细胞疗法的甚至更强的候选者，包括：它们易于分离和扩展至临床规模；冷冻保存后潜能的保持；和当同种异体MSC移植后，不引起不良反应。
MSC典型地收获自骨髓或脂肪组织。由于MSC和生成MSC的干细胞的相对稀少(通常是百分之几的一个分数)，所以典型地在治疗用途之前，在体外扩增MSC。已理解，多个因素，例如起源组织和MSC在其下扩增的培养条件影响所得MSC群体的免疫调节潜力和效价，这些会进而影响用于基于细胞疗法的MSC群体的质量。
概述
提供了评估多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的方法。这些方法的方面包括评价与MSC群体的样本中的MSC关联的CD54/IL-6的量，以获得CD54/IL-6结果并且基于获得的CD54/IL-6结果提供MSC群体的免疫调节潜力的评估。还提供了在实践这些主题方法中发现用途的系统和试剂盒。
附图简要说明
图1提供了用于通过流式细胞术，分离多潜能基质细胞(MSC)、中幼粒细胞和淋巴细胞群体的门控策略。基于前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)连同CD45、CD73、CD14和CD3表达的组合，来分离细胞群体。可以在不同条件(例如单独培养或共培养、刺激之前和之后)下，针对表面标志和/或细胞因子，进一步筛选每一群体。在此具体门控策略中，由于对CD3的门控，淋巴细胞亚群(处于红色)主要由T细胞组成。
图2A至2C提供了流式细胞计数测定的结果，示出了MSC对T细胞表达IFN-γ和T细胞增殖的免疫调节活性。图2A提供了用于获得在图2B和2C中测定的外周血单核细胞(PBMC)确切地是CD3+T细胞的门控策略。图2B示出了在静息的PBMC中、在刺激的PBMC中的IFN-γ表达。单独培养刺激的PBMC，或将其与源自骨髓(BM MSC)抑或脂肪组织(AT MSC)的MSC共培养。图2C示出了在对图2B所述的条件下，PBMC的紫色增殖染色(VPD)。
图3A和3B提供了流式细胞计数测定的结果，示出了在BM MSC或AT MSC中的CD54、CD274和IL-6的表达。图3A示出了对于获得MSC有用的门控策略。图3B示出了在与刺激的PBMC共培养之前(红色方块)和之后，在BM MSC和AT MSC中CD54、CD274、和IL-6的表达。
图4A至4C提供了流式细胞计数测定的结果，示出了在静息的BM MSC和AT MSC中，CD54和IL-6的表达。图4A示出了与BM MSC相比，CD54和IL-6在AT MSC中的表达更高。图4B示出了与BM MSC共培养的T细胞相反，在与AT MSC共培养的T细胞中IFN-γ表达减少。图4C示出了与BM MSC相比，与AT MSC共培养的T细胞的减少的增殖。
发明详述
提供了评估多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的方法。这些方法的方面包括评价与MSC群体的样本中的MSC关联的CD54/IL-6的量，以获得CD54/IL-6结果并且基于获得的CD54/IL-6结果提供MSC群体的免疫调节潜力的评估。还提供了在实践这些主题方法中发现用途的系统和试剂盒。
在进一步描述本发明之前，应理解的是本发明不被限制于描述的具体实施例，因为这些当然可以改变。还应理解的是，在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并且不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供了一个范围的值时，应理解每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文清晰地另外指示)，该范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在陈述范围内的中间值均被涵盖在本发明之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在本发明之内，服从于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限制时，排除了那些被包括的限制的任一个或两者的范围也被包括在本发明之内。
本文所叙述的方法可按照所叙述事件的任何逻辑上可能的顺序以及所叙述的事件顺序而进行。
除非另外定义，在此使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，现在将对优选方法和材料进行描述。
本文的所有出版物通过引用并入本文，以公开和描述与被引用的出版物相关的方法和/或材料。
应指出，如在此使用的，并且在所附权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”、以及“该”包括复数指代物，除非上下文另外清晰地指示。应当进一步指出，权利要求书可以撰写以排除任何任选的要素。因此，这样的陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，在此描述和说明的单独实施例中的每一个具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本发明的范围或精神的情况下易于与任何其他若干实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序进行任何叙述的方法。
只提供在本申请的申请日之前的本文所讨论的出版物的公开内容。本文不应被解释为承认由于先前发明而本发明不能获得比此种出版物更早的申请日。另外，所提供的出版物的日期可以不同于实际公开日期，实际公开日期可能需要被独立确认。
本发明的进一步说明的实施例中，将首先更详细地说明这些方法的实施例的方面。接下来，综述了可以用于实践本发明的方法的系统和试剂盒的实施例。
方法
如以上总结，本发明的实施例针对评估多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的方法。MSC可以是塑料粘附的并且能够分化为多个间充质谱系，例如成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和成软骨细胞。对于表面标志CD73、CD90、和CD105，人MSC可以是阳性的，并且对于表面标志CD34、CD45、CD14、CD11b、和CD19，人MSC可以是阴性的。此外，在鉴定和/或表征人MSC或其亚群中，其他标志，例如CD271、COX2、IDO、CD274、CD44、CD166、STRO-1会是有用的。MSC群体和MSC表面标志的全面综述发现于哈斯(Hass R.)等人，细胞通信信号(CellCommun Signal)(2011)14；9:12。
在某些方面中，可以通过从哺乳动物组织首先获得细胞(包括MSC和/或干细胞(SC))来产生MSC群体。哺乳动物组织可以获得自人类、非人类灵长动物、鼠类、或另一种适合的哺乳动物。该组织可以是适合产生MSC的骨髓、脂肪组织、外周血、或另一种组织。
为了从组织分离细胞，如所希望的，可以使用适当的分散液或悬浮液。该溶液可以是平衡盐溶液，例如生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中方便地补充有胎牛血清、人血小板裂解物、或其他因子，结合处于低浓度，例如从5-25mM的可接受的缓冲液。方便的缓冲液包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。可以在维持细胞生命力的任何适当的培养基中收集分离的细胞。不同培养基是可商购的，并且可以根据细胞的性质进行使用，这些培养基包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、伊斯科夫培养基(Iscove’s medium)等，其中经常补充有胎牛血清或人血小板裂解物。
然后可以在适合MSC生产和/或扩增的条件下，培养获得的细胞。培养条件可以包括一次或更多次传代，并且在一些实例中，包括十次或更少次传代。培养条件可以包括用于维持细胞中的多潜能性的一个或多个因素。此类因素的实例包括胎牛血清(FBS)、人血小板裂解物、用于转染用于诱导/维持多能性的基因的载体等。如所希望的，在使用前，可以冷冻MSC群体(例如在5％或更大浓度的DMSO中并且在液氮温度下)。
如所希望的，可以使用促进增殖而不促进分化的培养条件，在培养中连续地增殖如上所述的MSC。细胞可以维持在培养基，例如DMEM、RPMI等中，在胎牛血清或无血清替换物存在下，无分化。可以使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、胶原酶等，在75％至95％会合时，将细胞传代。由于MSC的多潜能性，并且尽管在其起源组织中其相对稀少(通常是百分之几的一个分数)，在培养中增殖的MSC可以被富集至适合临床应用的水平。
在某些方面中，可以通过富集MSC或作为前体的SC来获得MSC的基本上纯的群体，其中可以采用用于做到这一点的任何方便的实验方案。例如，可以使用共轭至特异性结合非MSC表面标志的抗体(或另一种结合分子)的珠粒来排除非MSC细胞。共轭至特异性针对MSC表面标志的抗体的珠粒可以被用于从其他细胞中分离MCS。在另一个实例中，可以在荧光激活细胞分选仪(FACS)上采用类似于图1中说明的门控策略的门控策略以便纯化MSC群体。
MSC群体的免疫调节潜力可以是MSC群体抑制某些免疫细胞，例如T细胞、B细胞、NK细胞、或它们的组合的增殖和/或激活的能力。MSC群体的免疫调节潜力还可以包括在群体中的MSC调节免疫细胞发育(例如诱导T细胞分化为调节性T细胞、防止单核细胞分化为树突细胞等)的能力。例如，如在图2中所说明，与刺激的PBMC一起共培养骨髓源MSC(BM MSC)或脂肪组织源MSC(AT MSC)减弱了T细胞IFN-γ表达和增殖。
在主题方法的一些实例中，样品(例如等分部分)是获得自MSC群体并且对其进行测定以获得从中获得样品的MSC群体的免疫调节潜力的评估。在用于在此披露的方法的多个方面之前，MSC群体的样品(在此与“等分部分”和“样品”可互换地使用)可以被培养(例如，在与如上所述针对以上MSC群体类似的条件下)和/或冷冻。
本发明的方面包括使感兴趣的MSC群体的样品与一种或多种可检测标记接触，以获得标记的样品。可检测标记可以包括特异性结合域和标记域。术语“特异性结合”(specific binding、specifically binds等)是指相对于溶液或反应混合物中的其他分子或部分，域的优先结合(例如同一结合对的一个结合对成员结合至另一个结合对成员)。特异性结合域可以结合(例如共价地或非共价地)至细胞内的特异性表位。在某些方面中，特异性结合域非共价地结合至一个靶。在此类实例中，与结合性靶标(例如CD54、IL-6或另一生物标记)关联的特异性结合域可以由以下KD(解离常数)表征：10-5M或更小、10-6M或更小、例如10-7M或更小、包括10-8M或更小，例如10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-13M或更小、10-14M或更小、10-15M或更小、包括10-16M或更小。可以将多种不同类型的特异性结合域用作捕获配体。感兴趣的特异性结合域包括但不局限于抗体结合剂、蛋白、肽、半抗原、核酸等。如在此使用，术语“抗体结合剂”包括足以结合感兴趣的分析物的多克隆抗体或单克隆抗体或片段。例如，抗体片段可以是单体Fab片段、单体Fab'片段、或二聚F(ab)'2片段。还在术语“抗体结合剂”的范围内的是由抗体工程产生的分子，例如单链抗体分子(scFv)或产生自单克隆抗体的人源化抗体或嵌合抗体，通过替换重链和轻链的恒定区以产生嵌合抗体，或替换恒定区和可变区的框架部分二者以产生人源化抗体。
基于例如荧光发射最大值、荧光极化、荧光寿命、光散射、质量、分子量、或它们的组合，标记域是可检测的。在某些方面，标记域可以是荧光团(即荧光标记、荧光染料等)。荧光团可以选自适合用于分析应用(例如流式细胞术、成像等)的多种染料中的任一种。可从多个来源(例如像分子探针(Molecular Probes)公司(Eugene(尤金)，俄勒冈州)和激发子(Exciton)公司(代顿(Dayton)，俄亥俄州)商购大量染料。可以并入微颗粒的荧光团的实例包括但不局限于4-乙酰氨基-4'-异硫代氰茋-2,2'二磺酸；吖啶和衍生物，例如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红、和吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐(荧光黄VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素和衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(氯杀鼠灵151)；菁蓝和衍生物例如玫瑰红、Cy3、Cy5、Cy5.5、和Cy7；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫代氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二乙烯三胺五醋酸盐；4,4'-二异硫代氰酰二氢-茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫代氰酰茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)；4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物，例如曙红和曙红异硫氰酸酯；藻红和衍生物，例如藻红B和藻红异硫氰酸酯；乙锭；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、荧光素氯三嗪基、萘并荧光素、和QFITC(XRITC)；荧胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；造礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；丽丝胺罗丹明、荧光黄；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻位甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；B-藻红蛋白；o-邻苯二甲醛；芘和衍生物，例如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(CibacronTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物，例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽配合物衍生物；呫吨；或它们的组合。还可以使用本领域普通技术人员已知的其他荧光团或它们的组合，例如从分子探针(Molecular Probes)公司(尤金(Eugene)，俄勒冈州)和激发子(Exciton)公司(代顿(Dayton)，俄亥俄州)可得的那些荧光团。基于荧光发射最大值，并且任选地进一步基于光散射或消光，荧光标记可以是可区分的。
在其他方面中，标记域可以是通过质谱，金属同位素可检测的，例如通过用于质量流式细胞术的飞行时间质谱仪，例如描述于公开为WO/2010/097070的国际专利申请序列号PCT/US2012/020950中，将其披露内容通过引用结合在此。
在某些方面中，MSC群体的样品接触(例如暴露于、染色有、标记有)特异性结合CD54的第一可检测标记。CD54也称为细胞间粘附分子1(ICAM-1)，被了解为结合整合素(CD11a/CD18和CD11b/CD18)，并且由此稳定了细胞间相互作用。除了其他位置以外，人CD54还描述于以下网页，该网页具有通过在“omim.org/entry/147840？search＝cd54&highlight＝cd54”之前放置“http://”而生成的地址。MSC群体的样品还可以与特异性结合IL-6的第二可检测标记接触。IL-6活性是背景依赖的，并且它具有促炎的和抗炎的特性。除了其他位置以外，人IL-6还描述于以下网页，该网页具有通过在“omim.org/entry/147620？search＝il6&highlight＝il6”之前放置“http://”而生成的地址。
在某些方面中，该方法可以涉及例如在使该样品(和在此的细胞)与MSC群体的样品中的第二可检测标记接触之前，用蛋白转运抑制剂处理MSC群体的样品。如所希望的，蛋白转运抑制剂的实例包括布雷菲德菌素A和阿霉素，尽管还可以采用其他蛋白转运抑制剂。用蛋白转运抑制剂预处理MSC群体可以允许以其他方式难以检测的正常分泌性蛋白(例如IL-6或其他细胞因子)的累积。可以用蛋白转运抑制剂预处理MSC群体持续一个量的时间，这段时间足以累积正常分泌性蛋白，例如从5分钟至1天，30分钟至6小时，或1小时制2小时。
在某些方面中，该方法可以包括固定样品，例如在使样品与第一和第二可检测标记之前，在使样品与第二可检测标记接触之前，和/或在使样品与第二可检测标记接触之后。可以通过暴露于多种细胞固定剂(即固定试剂)中的任一种，例如多聚甲醛、戊二醛、甲醇、丙酮、福尔马林、或它们的任何组合，来固定样品的细胞。如所希望的，可以采用其他固定剂和固定方法。固定时间可以变化，并且在一些实例中，范围是从1分钟和1小时，例如5分钟和30分钟。固定发生的温度可以变化，并且在一些实例中，温度范围是从-30℃至30℃。
在某些方面中，可以在样品与第二可检测标记接触之前，用透化剂处理样品。透化可以允许第二可检测标记进入样品中的细胞并且特异性结合IL-6。透化可以发生在先前所述的固定之前、之后、或与之同时。可以通过暴露于多种细胞透化剂中的任一种，例如甲醇，丙酮或洗涤剂(例如曲通、NP-40、皂苷、吐温20、毛地黄皂苷、leucoperm等)，或它们的组合，来透化样品中的细胞。透化时间可以变化，并且在一些实例中，范围是从1分钟至1小时，例如从5分钟至30分钟。透化发生的温度可以变化，并且在一些实例中，温度可以范围是从0℃至50℃。
MSC群体的样品可以任选地与一种或多种另外的可检测标记接触。另外的可检测标记可以特异性结合感兴趣的另外的生物标志(例如指示MSC免疫调节潜力的生物标志)。例如，另外的生物标志可以是CD271、COX2、IDO、CD274、CD44、CD166、STRO-1、或了解为在MSC细胞间相互作用、增殖、和/或免疫调节潜力中起作用的任何其他生物标志。任选地，对于区别MSC与其他细胞类型，另外的生物标志会是有用的。
可以与此同时或依次地，使样品与可检测标记(例如第一、第二、和/或另外的可检测标记)接触。可以使样品与足够量的可检测标记接触并且持续足够长的时段，以允许可检测标记与其特异性靶(例如CD54、IL-6、另外的生物标记等)结合。例如，样品可以接触持续在5分钟和若干小时之间的时间，例如在30分钟和2小时之间的时间。在该接触步骤期间，样品可以被维持在任何方便的温度，例如在冷冻温度和室温之间。如所希望的，然后可以进行洗涤步骤，例如，以除去任何未结合的可检测标记和其他样品组分。可以使用任何方便的实验方案，例如通过使反应混合物与适合的洗涤缓冲液(例如PBS、HEPES)结合，并且从该流体分离细胞。如所希望的，给定洗涤实验方案可以包括一个或多个不同的洗涤步骤。在任何洗涤实验方案后，可以在适合的液体(例如洗涤缓冲液或另一种缓冲液)中重新悬浮细胞。
在使MSC群体的样品与可检测标记接触以获得标记的样品后(例如，如以上所述)，这些方法的方面包括评价(例如量化)与样品中的一种或多种MSC关联的第一和第二可检测标记的量，以获得CD54/IL-6结果。评价可以是定性的，例如确定该量是高于或低于预定阈值，或是定量的，例如确定表示靶分子的拷贝数的值或水平。基于由与细胞关联的可检测标记的标记域产生的信号的强度(例如荧光强度)，与细胞关联的，例如结合至细胞的表面，存在于细胞内等的可检测标记的量可以被评价，例如量化。CD54/IL-6结果可以是单个MSC中第一和第二可检测标记的量化的量，或作为跨越多个MSC的平均的量。CD54/IL-6结果可以涉及CD54和IL-6的表达水平。该方法可以任选地包括量化一种或多种另外的可检测标记的量，以获得另外的结果(例如按针对CD54/IL-6结果所描述的方式中的任一种进行量化)。
在某些实施例中，量化可检测标记(即第一、第二、和/或另外的可检测标记)中每一种的量可以包括基于荧光发射最大值来区别可检测标记。例如，具有光谱重叠的两种或更多种可检测标记之间的荧光代偿可以用来区别源自可检测标记中的每一种的信号(例如荧光发射)。还可以基于光散射、荧光寿命、激发光谱、或它们的组合来区别两种或更多种可检测标记。
在一些实例中，可以通过流式细胞术来量化可检测标记。流式细胞术是使用多参数数据的方法学，以鉴定和区别流体介质中彼此变化(例如在标记、尺寸、粒度等方面)的不同颗粒，例如细胞或珠粒。在用流式细胞术分析颗粒(例如，如上所述制备的细胞)中，首先将包含这些颗粒的液体介质引入流式细胞仪的流动路径。如所希望的，当在该流动路径中时，颗粒基本上一次一个穿过一个或多个传感区域，在那里颗粒中的每一个独立暴露于单色光源，并且光散射参数和/或荧光发射的测量(例如两个或更多个光散射参数和一个或多个荧光发射的测量)被针对每个颗粒分开记录。如所希望的，实时分析针对每个颗粒记录的数据，并且将这些数据存储在数据存储和分析装置，例如计算机中。美国专利号4,284,412描述了装备有单个光源的典型流式细胞仪的配置和用途，同时美国专利号4,727,020描述了装备有两个光源的流式细胞仪的配置和用途。通过引用将这些专利的披露内容结合在此。还可以采用具有多于两个光源的流式细胞仪。
更确切地说，在流式细胞仪中，在悬浮液中的颗粒基本上一次一个进入流动路径通过一个或多个传感区域，在那里的每个区域中，由能量源照亮每个颗粒。该能量源可以包括发射单波长的光的发光器，例如由激光(例如He/Ne或氩)或具有适当滤光片的水银灯提供的光。例如，在488nm的光可以被用作具有单个传感区域的流式细胞仪中的发射波长。对于以两个不同的波长发射光的流式细胞仪，可以采用另外波长的发射光，其中感兴趣的具体波长包括但不限于：535nm、635nm等。
与传感区域串联，检测器模块包括一个或多个检测器，例如聚光器，例如光电倍增管(或“PMT”)并且被用来随着颗粒穿过传感区域并且由能量源照亮而记录穿过每个颗粒的光(一般称为前向光散射)、与颗粒流动穿过传感区域的方向正交反射的光(一般称为正交的或侧向的光散射)、和从颗粒发射的荧光(如果它标记有一种或多种荧光标志)。前向光散射(或FSC)、正交光散射(SSC)、和荧光发射包括针对每个颗粒(即每个“事件”)的分开的参数。因此，可以从标记有两种不同的荧光标志的颗粒收集(并且记录)两个、三个、四个或更多个参数。
相应地，如所希望的，在用流式细胞术测定颗粒中，通过使颗粒暴露于激发光并且测量在一个或多个检测通道中的每个颗粒的荧光，来检测并且唯一地鉴定可以包括不同量的第一、第二、和/或另外的可检测标记的颗粒。激发光可以来自一个或多个光源并且可以是狭窄的抑或宽带的。激发光源的实例包括激光、发光二极管、和弧光灯。可以在用单个光源激发以后测量，或可以在用不同的光源激发以后分开地测量用来鉴定颗粒和与其关联的结合复合物的检测通道中发射的荧光。如果分开的激发光源被用来激发颗粒标记，则可以选择标记，这样使得所有标记都是由使用的激发光源中的每一个可激发的。
流式细胞仪进一步包括数据采集、分析和记录装置，例如计算机，其中多个数据通道记录随着颗粒穿过传感区域，来自每个颗粒发射的光散射和荧光的每个检测器的数据。分析系统的目的是分类并且计数颗粒，其中每个颗粒自身存在为一组数字化的参数值。在本发明的方法中，在用流式细胞术测定颗粒中，流式细胞仪可以被设置为在选择的参数上触发，以便从背景和噪音区别感兴趣的颗粒。“触发”是指用于检测参数的预设阈值。它典型地被用作用于对通过颗粒通过激光束进行检测装置。超过针对选择的参数的预设阈值的事件的检测触发针对颗粒的光散射和荧光数据的采集。并未针对引起低于阈值的反应的正测定的介质中的颗粒或其他组分采集数据。触发参数可以是颗粒通过光束而引起的前向散射光的检测。然后流式细胞仪检测并且收集针对颗粒的光散射和荧光数据。
可以基于针对整个样品收集的数据，通过“门控”进一步分析感兴趣的具体亚群。为了选择适当的门，标绘数据以便获得可能的亚群的最佳分离。典型地通过在二维点图上标绘前向光散射(FSC)对比侧向(即正交)光散射(SSC)，来实现这一程序。然后流式细胞仪操作员选择颗粒的希望的亚群(即在该门内的那些细胞)并且排除不在该门内的颗粒。希望地，操作员可以通过使用计算机屏幕上的光标，围绕希望的亚群划线，来选择门。然后通过标绘针对那些颗粒的其他参数，例如荧光，来进一步分析该门内的仅有的那些颗粒。然后基于荧光的门控可以被用于进一步分离细胞的亚群。例如，可以根据图1中概述的策略，来给MSC进行门控。然后可以如以下所述，进一步评估门控的MSC。
在某些方面中，该方法进一步包括提供MSC群体的免疫调节潜力的评估。该评估可以基于先前描述的CD54/IL-6结果。任选地进一步，该评估还可以基于另外的结果(如先前所描述，获得自特异性针对另外的生物标志的一种或多种另外的可检测标记的信号)。该评估可以被提供为数字的、定性的或定量的评估。例如，当该结果(例如CD54/IL-6和/或另外的结果)高于阈值时，MSC群体可以被评估为具有增强的免疫调节潜力。该阈值可以是预定的，或可以是基于标准化对照确定的。
在一些实施例中，当结合至与MSC关联的CD54的可检测标记的中位数荧光强度(例如，如通过流式细胞术确定)超过预定阈值时，MSC被确定为具有增强的免疫调节潜力。例如，在实施例中，当结合至与MSC关联的CD54的可检测标记的中位数荧光强度超过250或更大、例如500或更大、例如750或更大并且包括1000或更大的中位数荧光强度时，MSC可以被确定为具有增强的免疫调节潜力。在其他实施例中，当结合至与MSC关联的IL-6的可检测标记的中位数荧光强度(例如，如通过流式细胞术确定)超过预定阈值时，例如当结合至与MSC关联的IL-6的可检测标记的中位数荧光强度超过1000或更大，例如1500或更大、例如2000或更大、例如2500或更大、例如5000或更大的阈值，并且包括10000或更大的中位数荧光强度时，MSC可以被确定为具有增强的免疫调节潜力。
在某些实施例中，方法进一步包括确定用于评估MSC是否具有增强的免疫调节潜力的中位数荧光强度(MFI)阈值。在一些实例中，通过测量结合至与对照细胞关联的生物标志的可检测标记的中位数荧光强度来确定中位数荧光强度(MFI)阈值，这些对照细胞来自具有高免疫调节潜力的一个或多个MSC群体。在某些实施例中，确定中位数荧光强度阈值包括取结合至与对照细胞关联的生物标志的可检测标记的平均中位数荧光强度，这些对照细胞来自具有高免疫调节潜力的两个或更多个不同MSC群体(例如具有高免疫调节潜力的三个或更多个不同MSC群体、例如具有高免疫调节潜力的四个或更多个并且包括五个或更多个不同MSC群体)。在一个实例中，方法包括确定结合至与MSC关联的CD54的可检测标记的中位数荧光强度阈值。在另一个实例中，方法包括确定结合至与MSC关联的IL-6的可检测标记的中位数荧光强度阈值。
在其他实施例中，当具有超过预定阈值的结合至CD54的可检测标记的荧光强度(例如，如通过流式细胞术测量)的MSC群体的百分比高于具体截止点时，MSC被确定为具有增强的高免疫调节潜力。例如，在一些实例中，当2％或更大的MSC群体具有超过预定阈值的结合至CD54的可检测标记的荧光强度，例如5％或更大、例如10％或更大、例如25％或更大、例如50％或更大、例如75％或更大时，并且包括当90％或更大的MSC群体具有超过预定阈值的结合至CD54的可检测标记的荧光强度时，MSC被确定为具有增强的高免疫调节潜力。在这些实例中，结合至CD54的可检测标记的荧光强度的预定阈值可以变化，例如250或更大、例如500或更大、例如750或更大、例如1000或更大、例如1500或更大的荧光强度，并且包括5000或更大的荧光强度。
仍在其他实施例中，当具有超过预定阈值的结合至IL-6的可检测标记的荧光强度(例如，如通过流式细胞术测量)的MSC群体的百分比高于具体截止点时，MSC被确定为具有增强的高免疫调节潜力。例如，在一些实例中，当2％或更大的MSC群体具有超过预定阈值的结合至IL-6的可检测标记的荧光强度，例如5％或更大、例如10％或更大、例如25％或更大、例如50％或更大、例如75％或更大时，并且包括当90％或更大的MSC群体具有超过预定阈值的结合至IL-6的可检测标记的荧光强度时，MSC被确定为具有增强的高免疫调节潜力。在这些实例中，结合至IL-6的可检测标记的荧光强度的预定阈值可以变化，例如1000或更大、例如1500或更大、例如2000或更大、例如2500或更大、例如5000或更大的荧光强度，并且包括10000或更大的荧光强度。
在一些实施例中，当与标准化对照相比时，MSC被确定为具有增强的免疫调节潜力。在一个实例中，标准化对照可以是对照颗粒，例如荧光对照珠粒或对照细胞。对照颗粒可以用作阳性的或阴性的对照。例如，来自具有高免疫调节潜力的MSC群体的对照细胞可以具有相对高的CD54/IL-6结果(即CD54和IL-6的高表达)。对照细胞CD54/IL-6结果可以被设置为阈值。如果与这一阈值相比，标记的样品的可检测标记的量化获得更高CD54/IL-6结果，则标记的样品的MSC群体可以被评估为具有增强的(或高的)高免疫调节潜力。
在某些实施例中，方法包括确定MSC群体是否适合用作阳性对照。在一些实例中，在MSC将激活的免疫细胞(例如，如上所述，T细胞、B细胞、NK细胞、PBMC或它们的组合)的一种或多种生物标志的表达抑制或降低例如10％或更多、例如25％或更多、例如50％或更多、例如75％或更多并且包括90％或更多或2倍或更多、例如3倍或更多、例如5倍或更多并且包括10倍或更多的情况下，MSC群体被确定为适合用作阳性对照。例如，在MSC将激活的T细胞的CD3表达抑制或降低10％或更多、例如25％或更多、例如50％或更多、例如75％或更多并且包括90％或更多的情况下，MSC群体可以被确定为适合用作阳性对照。在其他实例中，在将激活的T细胞的CD3表达降低2倍或更多、例如3倍或更多、例如5倍或更多并且包括降低CD3表达10倍或更多的情况下，MSC群体被确定为适合用作阳性对照。
在其他实例中，在MSC将激活的T细胞的IFN-γ表达抑制或降低10％或更多、例如25％或更多、例如50％或更多、例如75％或更多并且包括90％或更多的情况下，MSC群体被确定为适合用作阳性对照。在其他实例中，在MSC将激活的T细胞的IFN-γ表达降低2倍或更多、例如3倍或更多、例如5倍或更多并且包括降低IFN-γ表达10倍或更多的情况下，MSC群体被确定为适合用作阳性对照。
在一些实施例中，在MSC显示出超过预定阈值的CD54的中位数荧光强度(例如，如通过流式细胞术确定)，例如超过250或更大、例如500或更大、例如750或更大的CD54的中位数荧光强度，并且包括1000或更大的中位数荧光强度的情况下，MSC群体被确定为适合用作阳性对照。在其他实施例中，在MSC显示出超过预定阈值的IL-6的中位数荧光强度(例如，如通过流式细胞术确定)，例如超过1000或更大、例如1500或更大、例如2000或更大、例如2500或更大、例如5000或更大的CD54的中位数荧光强度，并且包括10000或更大的中位数荧光强度的情况下，MSC群体被确定为适合用作阳性对照。
在另外的方面中，可以基于它们的CD54/IL-6结果，并且任选地进一步基于它们的另外的结果，来比较来自不同MSC群体的多个样品。
如以上所述，起源组织和培养条件会导致具有不同特征(例如表面标志表达)和免疫调节特性的MSC群体。像这样，MSC的不同批次会显示不同治疗效能。因此，MSC群体的免疫调节潜力的评估可以被用作MSC治疗方案的质量控制。在某些实施例中，基于MSC群体是否具有增强的免疫调节潜力的评估可以或可以不治疗性地使用MSC群体。
MSC的多种潜力和已知治疗用途是在本文披露的实施例内的。确切地，MSC群体可以被用于治疗或预防特征在于自身免疫和/或炎症的疾病，例如移植物抗宿主疾病(GvHD)、克罗恩病、I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿关节炎、硬皮病和本领域普通技术人员熟悉的其他自身免疫的和/或炎症的疾病。由达拉尔(Dalal J)等人2012，儿科研究(PediatrRes.)71(4Pt 2):445-51提供了用于克罗恩病的MSC治疗学实验的综述，将其披露内容通过引用结合在此。由勒布朗克(Le Blanc K)等人2008，柳叶刀(Lancet)10；371(9624):1579-86提供了针对GvHD的基于MSC的治疗的临床试验的描述，将其披露内容通过引用结合在此。MSC在治疗其主要特征并不在于自身免疫和/或炎症的疾病中的治疗用途也在本文披露的实施例的范围内，这些疾病例如心肌梗塞、慢性阻塞性肺病、和某些退行性疾病(例如成骨不全)。由帕尔卡丹(Parekkadan B.)等人，生物医学工程年鉴(Annu Rev Biomed Eng.)(2010)12:87-117提供了MSC治疗法的一般综述。
出于本发明的目的，相对于接受者，MSC群体可以是异源的、自体的、或异种的。MSC至少部分地免除了免疫排斥，并且因此同种异体移植不需要组织相容性抗原的完美匹配。在一些实例中，提供了至少一个HLA匹配，更通常是两个匹配、三个匹配、四个匹配、五个匹配、或更多个。要移植的细胞的数目将随着希望的具体治疗、接受者的尺寸等等而变化。总的来说，对于人类，MSC的剂量可以包括105个细胞、并且通常是106个细胞、107个细胞、或108个细胞或更多个细胞。可以按剂量将MSC给予患者，例如是一天一次、一周多次、一周一次、或一月一次。可以局部地(例如，在患病组织的位置或在MSC可以从其运送至患病组织的位置)和/或全身地给药MSC。
在一个实例中，可以与感兴趣的细胞或组织一起给药MSC(例如用来防止移植的排斥)。用于移植的感兴趣的细胞包括但不限于心肌细胞及其祖细胞；神经祖细胞，例如用于神经元或视网膜的再生，等；胰岛细胞，特别是胰岛B细胞；造血干细胞和祖细胞；肌卫星细胞；内皮细胞或其祖细胞；等。感兴趣的组织包括肝组织、肾组织、心脏组织、肺组织、皮肤组织、脑组织；脊髓组织；胰岛；视网膜组织；骨髓；等。
对于医用配制品发明的一般性规则，读者参考细胞治疗：干细胞移植、基因治疗、和细胞免疫治疗(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy)，由莫顿(G.Morstyn)&谢里丹(W.Sheridan)编辑，剑桥大学出版社，1996。将根据用于给药的途径和装置，来改适组合物的细胞赋形剂和任何伴生要素的选择。可以通过注射、导管、或类似方式来引入细胞。可以在液氮温度下冷冻细胞并且长期存储，在解冻时能够使用。
装置和系统
本发明的方面包括用于实践主题方法的系统。本发明的系统可以包括被配置为通过测量信号(例如FSC、SSC、荧光发射最大值、光散射、质量、分子量等)来测定颗粒(例如珠粒、细胞，例如MSC等)的流式细胞仪。该系统可以进一步包括配置为接收信号并且输出MSC群体的免疫调节潜力的评估的信号处理模块。感兴趣的流式细胞仪包括但不限于在以下美国专利号中描述的那些装置：4,704,891；4,727,029；4,745,285；4,867,908；5,342,790；5,620,842；5,627,037；5,701,012；5,895,922；和6,287,791；将其披露内容通过引用结合在此。在一些实例中，流式细胞仪包括：流动通道；检测器模块，该检测器模块包括配置为从该流动通道的测定区域接收第一信号的第一检测器和配置为从该流动通道的测定区域接收第二信号的第二检测器。该流式细胞仪可以任选地进一步包括配置为将光导向该流动通道的测定区域的至少一个第一光源(其中在一些实例中，该细胞仪包括两个或更多个光源)。在某些方面中，可以由特异性结合CD54的可检测标记产生第一信号，并且可以由特异性结合IL-6的可检测标记产生第二信号。任选地进一步，流式细胞仪可以包括一个或多个另外的检测器和/或用于检测一种或多种另外的信号的光源。可以由特异性结合指示MSC群体的免疫调节潜力的生物标志的一种或多种另外的可检测标记产生一种或多种另外的信号。
本发明的方面进一步包括配置为从第一和第二检测器接收信号并且输出MSC群体的免疫调节潜力的评估(例如，如以上所述，MSC群体是否具有增强的免疫调节潜力)的信号处理模块。信号处理模块可以作为单个装置被整合进细胞仪，或分配自信号处理模块和细胞仪彼此连通(例如经由有线的或无线的通信协议)的细胞仪。在以下与计算机有关的实施例部分中进一步描述了信号处理模块的另外的多个方面。
相应地，本发明的方面进一步包括系统，例如基于计算机的系统，例如，如以上所述，该系统被配置为检测第一和第二可检测信号的存在。“基于计算机的系统”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置、和数据存储装置。本发明的基于计算机的系统的最小硬件包括中央处理器(CPU)、输入装置、输出装置和数据存储装置。技术人员可以容易地理解，目前可用的基于计算机的系统中的任一种都适用于本发明。数据存储装置可以包括任何包括以下项的产品：对如上所述的本发明信息的记录、或可以访问这种产品的存储访问装置。
为了“记录”数据，计算机可读介质上的编程信息或其他信息是指存储信息的过程，使用如本领域已知的任何此类方法。基于用于访问存储的信息的装置，可以选择任何方便的数据存储结构。多种数据处理器程序和格式可以用于存储，例如文字处理文本文件、数据库格式等。
“处理器”引用了将执行它所需要的功能的任何硬件和/或软件组合。例如，在此的任何处理器可以是可编程数字微处理器，例如，按以下形式可用：电子控制器、大型机、服务器或个人计算机(台式机或便携式计算机)。在处理器是可编程的情况下，适合的编程可以从远端位置传递至该处理器，或预先保存在计算机程序产品中(例如便携式或固定式计算机可读存储介质，无论是基于磁性的、视觉的或固态的装置)。例如，磁介质或光盘可以携带编程，并且可以由在其相应的基站与每一处理器连通的适合的读取器来读取。
除了传感器装置和信号处理模块，例如，如以上所述，本发明的系统可以包括多个另外的部件，例如数据输出装置(例如监测器和/或扬声器)、数据输入装置(例如接口端口、键盘等)、流体处理部件、电源等。
在一些实例中，该系统可以进一步包括如根据上述主题方法的方面中的任一个制备的样品(例如加载在流动通道上)。在某些方面中，该流式细胞仪可以是荧光激活细胞分选仪(FACS)或质量细胞仪。在另一个方面中，该系统可以是荧光计。
实用性
主题方法和系统在其中希望评估MSC群体的免疫调节潜力的多种不同应用中发现了用途。此类应用包括治疗方案的质量控制连同研究、和预后应用。例如，评估MSC群体是否展示出预测增强的(或足够的)免疫调节潜力的特异性标志(CD54+IL6+)可以指导MSC群体是否在细胞治疗中有用，并且由此通过质量控制改进护理标准。此外，可以基于评估的免疫调节潜力来比较两个或更多个MSC群体，并且评估为具有最高免疫调节潜力的MSC群体可以用于治疗方案中。在研究应用中，主题方法可以用于检查MSC培养条件对MSC免疫调节潜力的影响。在评估用基于MSC的细胞治疗来治疗的患者的预后中，用于细胞治疗的MSC群体的免疫调节潜力的评估可以被用于预测结果。
主题方法和系统的上述应用是方便的，因为它们涉及不是时间密集的单个测定。这可以与多种测定的组合相比，这些测定例如是通常分别用于确定表面的和细胞因子的标志的流式细胞术和酶联免疫吸附测定(ELISA)。此外，MSC免疫调节活性的功能测定通常需要MSC与PBMC、T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的共培养。在比较中，主题方法和系统提供了时间更不密集并且并不需要除了MSC以外的细胞类型的测定。
在此描述的方法和组合物的实施例还在基于表面标志CD54的表达来纯化具有高免疫调节能力的MSC亚群方面发现了用途。例如，如以上所述，可以经由FACS分选或磁选来实现细胞纯化。可以结合或可以不结合IL6检测和/或分选来实现这一点。
计算机有关的实施例
本发明的方面进一步包括多个计算机有关的实施例。确切地，可以使用计算机来执行在先前部分中描述的方法的量化和评估步骤。相应地，本发明提供了用于分析使用以上方法产生的数据的基于计算机的系统，以便量化第一、第二、和/或另外的可检测标记的量，并且以便提供MSC群体是否具有增强的免疫调节潜力的评估。
在某些实施例中，将这些方法以“编程”的形式编码到物理计算机可读介质上，其中，如在此使用，术语“计算机可读介质”是指参与提供指令和/或数据至计算机以便执行和/或处理的任何存储介质或传输介质。存储介质的实例包括软盘、磁带、CD-ROM、硬盘驱动器、ROM或集成电路、磁光盘或计算机可读卡，例如PCMCIA卡等，无论此类装置对于计算机而言是否是内部的或外部的。含信息文件(例如与一个或多个“事件”关联的光散射的和/或荧光的信号，CD54/IL-6结果，阈值，高于该阈值的CD54/IL-6结果可以指示具有增强的免疫调节潜力的MSC群体等)可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，这样使得在以后的时间，它由计算机可访问并且可检索。在某些方面中，信息可以存储在“永久性存储器”(即不能通过终止计算机或处理器的电力供应而擦除的存储器)或“非永久性存储器”中。计算机硬盘驱动器、CD-ROM、软盘和DVD都是永久性存储器的实例。随机存取存储器(RAM)是非永久性存储器的实例。在永久性存储器中的文件可以是可编辑并且可重写的。
在某些方面中，模块(例如先前描述系统的信号处理模块)可以用于鉴定具有增强的免疫调节潜力的间充质基质细胞(MSC)。该模块可以被配置为从检测器接收第一和第二信号(例如荧光发射最大值和/或强度、荧光寿命、光散射、质量、分子量等)。例如，该检测器可以是流式细胞计数系统、荧光计、或用于实施主题方法的任何方便的系统的一部分。可以由特异性结合CD54的第一可检测标记产生第一信号，并且可以由特异性结合IL-6的第二可检测标记产生第二信号。任选地进一步，该模块可以被配置为接收由另外的可检测标记产生的一种或多种另外的信号，这些可检测标记结合指示MSC免疫调节潜力的生物标志。
该模块还可以被配置为处理第一和第二信号，以获得CD54/IL-6结果。任选地进一步，该模块可以被配置为处理一种或多种另外的信号，以获得另外的结果。该模块可以被配置为基于CD54/IL-6的和/或另外的结果，输出MSC群体的免疫调节潜力的评估。该模块可以基于CD54/IL-6的和/或另外的结果是否高于阈值，来输出评估。该模块可以被配置为基于与另一MSC群体和/或标准化对照(例如在主题方法中的描述)的比较，来确定阈值。另外，该模块可以被配置为在获得CD54/IL-6结果之前，基于FSC、SSC、和/或荧光，来自动地对来自其他细胞的MSC门控。例如，该模块可以被配置为基于以上描述的MSC表面标志等，基于图1的门控策略，来对MSC门控。
在某些方面中，该模块可以是荧光激活细胞分选仪(FACS)系统或质量细胞计数系统的一部分。
试剂盒
在另一个方面中，例如，如以上所述，本发明提供了用于实践主题方法的试剂盒。主题试剂盒可以包括第一和第二可检测标记和任选地一种或多种另外的可检测标记。第一可检测标记可以特异性结合CD54，并且第二可检测标记可以特异性结合IL-6。可检测标记(例如第一、第二、和/或另外的可检测标记)可以是如在主题方法的任一个方面中描述。此外，该试剂盒可以包括一种或多种蛋白转运抑制剂(例如布雷菲德菌素A和阿霉素等)。该试剂盒还可以包括一种或多种细胞固定试剂，例如多聚甲醛、戊二醛、甲醇、丙酮、福尔马林、或它们的任何组合或缓冲液。另外，该试剂盒可以包括细胞透化试剂，例如甲醇、丙酮或洗涤剂(例如曲通、NP-40、皂苷、吐温20、毛地黄皂苷、leucoperm)，或它们的任何组合或缓冲液、技术人员熟悉的其他蛋白转运抑制剂、细胞固定试剂和细胞透化试剂在主题试剂盒的范围内。
该试剂盒可以进一步包括用于执行流式细胞计数测定的试剂。所述试剂的实例包括用于第一和第二可检测分子的复水和稀释中的至少一者的缓冲液、用于使细胞样品与第一和第二可检测分子中的一者或两者接触的缓冲液、洗涤缓冲液、对照细胞、对照珠粒、用于流式细胞仪校准的荧光珠粒和它们的组合。
可以按液体的或干燥的(例如冻干的)形式提供以上描述的可检测标记和/或试剂。以上组分中的任一者(可检测标记和/或试剂)可以存在于分开的容器(例如分开的管、瓶、或在多孔条带或板中的孔)中。此外，一种或多种组分可以被并入单个容器，例如玻璃的或塑料的小瓶、管或瓶中。
在某些方面中，该试剂盒可以包括一个或多个标准化对照。标准化对照可以是对照颗粒，例如对照珠粒或对照细胞。例如，阴性对照细胞可以来自具有低免疫调节潜力和/或CD54/IL-6的低表达的MSC群体。例如，阳性对照细胞可以来自具有增强的免疫调节潜力和/或CD54/IL-6的高表达的MSC群体。
除了以上组成部分之外，主题试剂盒可以进一步包括用于实践这些主题方法的说明书。这些说明书可以呈多种形式存在于这些主题试剂盒中，这些形式中的一个或多个可以存在于该试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是打印在适合的介质或基底上(例如，在其上打印信息的一张或多张纸)、打印在试剂盒的包装中、打印在包装插入物等中的信息。又另外的手段可以是在其上已经记录有信息的计算机可读取介质，例如磁盘、CD、DVD、便携闪存驱动器等。可以存在的又另外的手段是可以在远离的地方经由因特网来获取信息的网址。任何便利的手段可以存在于这些用具包中。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实验
实例1
方法
刺激的外周血单核细胞(PBMC)被单独培养、与骨髓源MSC(BM MSC)共培养、和与脂肪组织源MSC(AT MSC)共培养。根据图1中概述的策略，来给T细胞(CD3+PBMC)门控。通过流式细胞术来测定IFN-γ的T细胞表达和紫色增殖染色(VPD)的水平。将静息的PBMC提供为阴性对照。
结果(图2)
如通过IFN-γ表达和通过T细胞增殖测量，在刺激的PBMC与BM MSC抑或AT MSC的共培养中抑制了T细胞激活。与BM MSC相比，AT MSC更强烈地抑制T细胞IFN-γ表达。AT MSC完全消除了T细胞增殖，而BM MSC抑制似乎是被延迟了一代。
实例2
方法
BM MSC和AT MSC被单独培养或与刺激的PBMC共培养。根据图1中概述的策略，来给BM MSC门控。通过流式细胞术测定CD54、CD274、和IL-6的MSC表达。
结果(图3)
如与静息的BM MSC相比，静息的AT MSC表达了更高水平的CD54和IL-6。如与BMMSC和AT MSC群体的阴性对照相比，当通过与刺激的PBMC共培养激活时，它们都表达更高水平的CD54、CD274、和IL-6。
实例3
方法
通过流式细胞术测定CD54和IL-6的静息BM MSC表达和静息AT MSC表达。通过流式细胞术测定在与BM MSC或AT MSC共培养后，T细胞的IFN-γ表达和VPD水平。
结果(图4)
如通过T细胞中IFN-γ表达和增殖的抑制所测量的，在AT MSC群体中CD54和IL-6的更高表达关联增强的免疫调节。
虽然有所附条款，但是还通过以下条款来限定在此列出的披露内容：
1.一种评估多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的方法，该方法包括：
(a)评价与该MSC群体的MSC关联的CD45/IL-6的量，以获得CD54/IL-6结果；并且
(b)基于该CD54/IL-6结果，提供该MSC群体的免疫调节潜力的评估。
2.根据条款1所述的方法，其中，该评价包括使该MSC群体的样品与特异性结合CD54的第一可检测标记和特异性结合IL-6的第二可检测标记接触，以产生标记的样品；并且量化在该标记的样品中的与MSC关联的第一和第二标记的量，以获得该CD54/IL-6结果。
3.根据条款1或2所述的方法，进一步包括产生该MSC群体。
4.根据条款3所述的方法，其中，通过以下项产生该MSC群体：
从人类组织获得干细胞；并且
在适合MSC群体的培养条件下，培养这些干细胞。
5.根据条款4所述的方法，其中，该人类组织是骨髓。
6.根据条款4所述的方法，其中，该人类组织是脂肪组织。
7.根据条款4至6中任一项所述的方法，其中，这些培养条件包括人血小板裂解物。
8.根据条款4至6中任一项所述的方法，其中，这些培养条件包括胎牛血清。
9.根据条款1至8中任一项所述的方法，进一步包括在获得该样品之前培养该MSC群体。
10.根据条款1至9中任一项所述的方法，进一步包括用蛋白转运抑制剂处理该样品。
11.根据条款1至10中任一项所述的方法，进一步包括在使该样品与特异性结合IL-6的第二可检测标记接触之前，用固定试剂处理该样品。
12.根据条款1至11中任一项所述的方法，进一步包括在使该样品与特异性结合IL-6的第二可检测标记接触之前，用透化试剂处理该样品。
13.根据条款1至12中任一项所述的方法，进一步包括使该样品与一种或多种另外的可检测标记接触，这些可检测标记特异性结合至指示MSC免疫调节潜力的一种或多种另外的生物标志。
14.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中，该第一和第二可检测标记各自包括特异性结合域和标记域。
15.根据条款14所述的方法，其中，该特异性结合域包括抗体或其结合片段。
16.根据条款14和15中任一项所述的方法，其中，该标记域包括荧光标记。
17.根据条款14和15中任一项所述的方法，其中，该标记域包括金属同位素。
18.根据条款2至16中任一项所述的方法，其中，该量化包括从该样品获得荧光发射最大值数据。
19.根据条款18所述的方法，其中，该方法进一步包括从该样品获得光散射数据。
20.根据条款2至19中任一项所述的方法，其中，该量化包括流式细胞术。
21.根据条款1至20中任一项所述的方法，其中，该评估包括当该CD54/IL-6结果高于阈值时，将该MSC群体鉴定为具有增强的免疫调节潜力。
22.根据条款21所述的方法，其中，CD54/IL-6结果高于该阈值表明该MSC群体具有希望的免疫调节潜力。
23.根据条款21或22所述的方法，进一步包括基于标准化对照来确定该阈值。
24.根据条款20所述的方法，其中，该标准化对照包括对照颗粒。
25.根据条款1至24中任一项所述的方法，其中，该方法进一步包括基于CD54表达，富集具有高免疫调节潜力的MSC亚群。
26.一种样品，包括：
多潜能基质细胞(MSC)群体的等分部分；
特异性结合CD54的可检测标记；以及
特异性结合IL-6的可检测标记。
27.根据条款26所述的样品，其中，已经用蛋白转运抑制剂处理该等分部分。
28.根据条款26和27中任一项所述的样品，其中，已经用固定试剂处理该等分部分。
29.根据条款26至28中任一项所述的样品，其中，已经用透化试剂处理该等分部分。
30.根据条款26至29中任一项所述的样品，其中，该样品已经与一种或多种另外的可检测标记接触，该一种或多种另外的可检测标记特异性结合至指示MSC免疫调节潜力的一种或多种另外的生物标志。
31.根据条款26至30中任一项所述的样品，其中，该第一和第二可检测标记各自包括特异性结合域和标记域。
32.根据条款31所述的样品，其中，该特异性结合域包括抗体或其结合片段。
33.根据条款31所述的样品，其中，该标记域包括荧光标记。
34.根据条款33所述的样品，其中，该第一和第二可检测标记是可区别的。
35.根据条款34所述的样品，其中，基于荧光发射最大值，该第一和第二可检测标记是可区别的。
36.根据条款31所述的样品，其中，该标记域包括金属同位素。
37.根据条款26至37中任一项所述的样品，进一步包括标准化对照。
38.根据条款37所述的样品，其中，该标准化对照包括对照颗粒。
39.根据条款26至38中任一项所述的样品，其中，该MSC群体包括人MSC。
40.一种系统，包括：
流动通道；
检测器模块，该检测器模块被配置为从该流动通道的测定区域接收光；以及
信号处理模块，该信号处理模块被配置为从该检测器模块接收第一和第二信号并且输出对MSC群体的免疫调节潜力的评估。
41.根据条款40所述的系统，进一步包括光源，该光源被配置为将光导向该流动通道的测定区域。
42.根据条款40和41中任一项所述的系统，其中，该流动通道加载有MSC群体的样品。
43.根据条款42所述的系统，其中，已经用蛋白转运抑制剂处理该样品。
44.根据条款42至43中任一项所述的系统，其中，已经用固定试剂处理该样品。
45.根据条款42至44中任一项所述的系统，其中，已经用透化定试剂处理该样品。
46.根据条款42至45中任一项所述的系统，其中，该样品进一步包括特异性结合CD54的第一可检测标记和特异性结合IL-6的第二可检测标记。
47.根据条款46所述的系统，其中，该第一可检测标记提供该第一信号并且该第二可检测标记提供该第二信号。
48.根据条款46至47中任一项所述的系统，其中，该样品包括一种或多种另外的可检测标记，该一种或多种另外的可检测标记特异性结合指示MSC免疫调节潜力的一种或多种另外的生物标志。
49.根据条款40至49中任一项所述的系统，其中，该信号处理模块被配置为处理该第一和第二信号，以产生CD54/IL-6结果。
50.根据条款49所述的系统，其中，该信号处理模块被配置为基于该CD54/IL-6结果是否高于阈值来输出对该MSC群体的免疫调节潜力的评估。
51.根据条款50所述的系统，其中，CD54/IL-6结果高于该阈值表明该MSC群体具有希望的免疫调节潜力。
52.根据条款50和51中任一项所述的系统，其中，该信号处理模块被配置为基于标准化对照来确定该阈值。
53.根据条款52所述的系统，其中，该标准化对照包括对照颗粒。
54.根据条款40至53中任一项所述的系统，其中，该第一和第二信号是荧光发射。
55.根据条款54所述的系统，其中，基于荧光发射最大值，该第一和第二信号可以被彼此区别。
56.根据条款55所述的系统，其中，基于光散射，该第一和第二可检测标记可以被进一步区别。
57.一种用于提供多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的评估的模块，该模块被配置为：
接收由特异性结合CD54的第一可检测标记产生的第一信号和由特异性结合IL-6的第二可检测标记产生的第二信号；
处理该第一和第二信号，以获得CD54/IL-6结果；并且
基于该CD54/IL-6结果，输出对MSC群体的免疫调节潜力的评估。
58.根据条款57所述的模块，其中，从流式细胞计数系统的检测器模块接收该第一和第二信号。
59.根据条款57和58中任一项所述的模块，其中，该模块被配置为基于该CD54/IL-6结果是否高于阈值来输出对该MSC群体的免疫调节潜力的评估。
60.根据条款59所述的模块，其中，CD54/IL-6结果高于该阈值表明该MSC群体具有希望的免疫调节潜力。
61.根据条款59和60中任一项所述的模块，其中，该模块被配置为基于标准化对照来确定该阈值。
62.根据条款61所述的模块，其中，该标准化对照包括对照颗粒。
63.根据条款57所述的模块，其中，该第一和第二信号获得自荧光发射。
64.根据条款63所述的模块，其中，基于荧光发射最大值，该第一和第二信号可以被彼此区别。
65.根据条款57所述的模块，其中，该模块被配置为接收一种或多种另外的信号。
66.根据条款65所述的模块，其中，由指示MSC免疫调节潜力的一种或多种另外的生物标志产生该一种或多种另外的信号。
67.根据条款66所述的模块，其中，该模块被配置为处理该一种或多种另外的信号，以产生另外的结果。
68.根据条款67所述的模块，其中，该模块被配置为基于该CD54/IL-6结果和该另外的结果，来输出对该MSC群体的免疫调节潜力的评估。
69.一种用于评估多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的试剂盒，该试剂盒包括：
特异性结合CD54的第一可检测标记；以及
特异性结合IL-6的第二可检测标记。
70.根据条款69所述的试剂盒，进一步包括蛋白转运抑制剂。
71.根据条款69和70中任一项所述的试剂盒，进一步包括固定试剂。
72.根据条款69至71中任一项所述的试剂盒，进一步包括透化试剂。
73.根据条款69至72中任一项所述的试剂盒，其中，该第一和第二可检测标记各自包括特异性结合域和标记域。
74.根据条款73所述的试剂盒，其中，该特异性结合域包括抗体或其结合片段。
75.根据条款73和74中任一项所述的试剂盒，其中，该标记域包括荧光标记。
76.根据条款69至75中任一项所述的试剂盒，进一步包括特异性结合至指示MSC免疫调节潜力的另外生物标志的另外可检测标记。
本说明书所引用的所用出版物和专利申请都已通过引用结合在此，这就如同已将各个出版物或专利申请具体地并且单独地通过引用结合在此一样。任何出版物的引用是针对在提交日之前的披露，并且不应当解释为承认由于先前发明而本发明不能获得比此种出版物更早的申请日。
虽然上述发明已经通过说明和实例的方式出于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述，但是本领域技术人员根据本发明传授的内容很容易明白可以对其进行某些变化和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。

Claims (25)

1.一种评估样本中源自骨髓或脂肪组织的多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力的方法，该方法包括：
(a)产生源自骨髓或脂肪组织的MSC群体；
(b)获得包含标记的静息的MSC的样品，其中，所述获得包括使所述MSC群体的静息的MSC接触：第一可检测标记，其特异性结合存在于所述静息的MSC表面的CD54蛋白；透化试剂；以及第二可检测标记，其特异性结合所述静息的MSC内部的IL-6蛋白；
(c)评价该MSC群体的所述静息的MSC表面的CD54蛋白的量与所述静息的MSC内部的IL-6蛋白的量，以获得用于所述静息的MSC的CD54/IL-6结果，其中，该评价包括通过流式细胞仪测定样品来量化在该样品中的与所述标记的静息的MSC关联的第一和第二标记的量；以及
(d)基于用于所述静息的MSC的该CD54/IL-6结果，提供该MSC群体的免疫调节潜力的评估，其中，所述MSC群体的免疫调节潜力是所述MSC群体抑制免疫细胞增殖、抑制免疫细胞激活、或调节免疫细胞发育的能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述MSC群体的免疫调节潜力是所述MSC群体抑制免疫细胞增殖的能力。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述MSC群体的免疫调节潜力是所述MSC群体抑制免疫细胞激活的能力。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或其组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述T细胞中的IFN-γ表达的降低表明所述T细胞激活受到抑制。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述MSC群体的免疫调节潜力是所述MSC群体调节免疫细胞发育的能力。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，调节免疫细胞发育包括诱导T细胞分化为调节性T细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，调节免疫细胞发育包括防止单核细胞分化成树突细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括用蛋白质转运抑制剂处理所述静息的MSC。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，进一步包括在使该静息的MSC与特异性结合IL-6蛋白的第二可检测标记接触之前，用固定试剂处理所述静息的MSC。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，进一步包括使该静息的MSC与一种或多种另外的可检测标记接触，该一种或多种另外的可检测标记特异性结合至指示MSC免疫调节潜力的一种或多种另外的生物标志。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，该第一和第二可检测标记各自包括特异性结合域和标记域。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，该量化包括从该样品获得荧光发射最大值数据。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，该方法进一步包括从该样品获得光散射数据。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，该评估包括当该CD54/IL-6结果高于阈值时，将该MSC群体鉴定为具有增强的免疫调节潜力。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述MSC群体的免疫调节潜力用作MSC治疗方案的质量控制。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，MSC群体的增强的免疫调节潜力表明所述MSC群体可以用于治疗方案中。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，基于评估的免疫调节潜力来比较两个或更多个MSC群体，并且评估为具有最高免疫调节潜力的MSC群体可以用于治疗方案中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述治疗方案包括治疗或预防以自身免疫、炎症、或两者为特征的疾病。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述疾病选自移植物抗宿主疾病(GvHD)、克罗恩病、I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿关节炎、以及硬皮病。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述治疗方案包括治疗或预防主要不以自身免疫、炎症、或两者为特征的疾病。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述疾病选自心肌梗塞、慢性阻塞性肺病、以及某些退行性疾病。
23.一种系统，包括：
流动通道；
检测器模块，该检测器模块被配置为从该流动通道的测定区域接收光；以及
信号处理模块，该信号处理模块被配置为根据权利要求1至22中任一项所述的方法，从该检测器模块接收第一和第二信号并且输出对MSC群体的免疫调节潜力的评估。
24.一种由权利要求1至22中任一项所述的方法生产的样品。
25.一种试剂盒，用于在根据权利要求1至22中任一项对多潜能基质细胞(MSC)群体的免疫调节潜力进行评估中使用，该试剂盒包括：
特异性结合CD54的第一可检测标记；以及
特异性结合IL-6的第二可检测标记。
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