CN113957156B

CN113957156B - 一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法

Info

Publication number: CN113957156B
Application number: CN202111337551.3A
Authority: CN
Inventors: 毛建军; 刘小平; 张礼生; 王孟卿; 李玉艳
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2021-11-10
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-11-10
Also published as: CN113957156A

Abstract

本发明涉及一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法，包括以下步骤：通过检测精巢特异蛋白基因的表达水平来评价昆虫质量。采用上述方法可以评价雄虫寿命、交配后雌虫繁殖能力等。特别是用于评价经过室内多代饲养后或研制人工饲料时昆虫的繁殖能力。采用本发明的检测方法评价昆虫群体质量仅需1天，而用传统的方法计数昆虫寿命与产卵量来评价昆虫质量，通常需要至少1个月时间。本发明的检测方法涉及的材料易于获得，操作方便、快捷、高效，适合于在昆虫规模化生产中推广应用。

Description

一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法

技术领域

本发明属于农业害虫生物防治技术领域，尤其涉及一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法。

背景技术

利用天敌昆虫防治害虫是一种非常重要的农业害虫防治方法，对于保障农产品质量、保护生态环境具有重大的战略意义。要利用天敌昆虫，首先必须大量生产天敌昆虫。在天敌昆虫生产过程中有一个普遍的问题，就是经过连续多代饲养后，天敌昆虫质量可能下降，主要表现为死亡率升高、寿命缩短、产卵量减少、卵质量下降等。但是，目前在天敌昆虫释放前还缺乏全面而快捷有效的评价整个天敌昆虫种群质量的方法。现有方法都是评价雌虫，不涉及雄虫。这种方法不太全面，也不太科学，因为雌虫的繁殖能力在很大程度上受与之交配的雄虫的影响。雌虫的质量好，但雄虫质量不好，雌虫的繁殖能力仍然不会高。

大草蛉(Chrysopa pallens)是一种非常重要的捕食性天敌昆虫。其能捕食各种蚜虫，鳞翅目害虫的卵与低龄幼虫，粉虱等各种害虫。大草蛉捕食量大，单头幼虫每日可捕食上百头蚜虫，被称为“蚜狮”。大草蛉繁殖能力强，单头雌成虫一生可产卵上千粒，甚至达1500粒。大草蛉分布广，在全世界主要的农林生态系统都有分布。由此可见大草蛉具有非常好的应用前景。大草蛉在规模化饲养过程中，同样可能会出现种群质量下降的情况，包括寿命缩短，雄虫交配能力衰退，雌虫产卵量下降等，质量下降的种群严重影响产品质量与生产效率，并大幅提高生产成本。因此，快捷高效地评价种群质量至关重要。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法，通过检测精巢特异蛋白基因的表达水平，可以评价昆虫种群质量，例如与雄虫寿命、交配后雌虫繁殖能力等，具有方便快捷高效等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种精巢特异蛋白基因包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明提供精巢特异蛋白包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明的有益效果包括：本发明提供的精巢特异蛋白基因(tbp)是一个全新的基因，其核苷酸序列与氨基酸序列与以前的精液蛋白基因、附腺蛋白基因等生殖相关基因的序列完全不同。Tbp基因的开放阅读框很长，达到9201bp，编码精巢特异蛋白，是一个大蛋白，分子量达350.064kDa。发明人在研究中意外发现Tbp在雄虫与雌虫生殖中发挥非常重要的功能。精巢特异蛋白基因和/或精巢特异蛋白可以用于评价昆虫种群质量。

本发明提供精巢特异蛋白基因表达水平在评价昆虫种群质量中的应用。

本发明的有益效果包括：发明人在研究中意外发现精巢特异蛋白基因的表达水平与雄虫寿命、产卵总量、交配后雌虫繁殖能力成正相关，通过检测精巢特异蛋白基因的表达水平可以评价昆虫种群质量，具有方便、快捷、高效，适合于在昆虫规模化生产中推广应用等优点。

发明人在研究中意外发现Tbp是雄虫精子发生所必须的，此基因功能缺失会导致精子尾部出现明显缺陷，精子活力显著下降，雄虫寿命显著缩短。同时，tbp的表达也对交配后雌虫的卵子发生具有重大影响。如果雄虫tbp的功能缺失，与野生型雌虫交配后，雌虫的卵子发生受到严重影响，卵巢干细胞分化受到明显抑制，产卵量显著下降，卵重与孵化率显著下降。所以，通过检测tbp基因的表达水平，可以同时评价雄虫与雌虫，甚至后代的质量。本发明的实验证明，通过检测精巢特异蛋白基因的表达水平可以用于评价群体中雄虫寿命及雌虫的繁殖能力，特别是经过室内多代饲养后或研制人工饲料时昆虫的繁殖能力。

在具体应用时，可以用于大草蛉的昆虫种群质量的评价，例如：用于评价产卵总量、寿命、卵重、孵化率等指标。

进一步，精巢特异蛋白基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

进一步，精巢特异蛋白基因编码的蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明提供用于检测精巢特异蛋白基因的表达水平的物质在评价昆虫种群质量中的应用。

本发明提供一种用于评价昆虫种群质量的引物，包括用于检测精巢特异蛋白基因的表达水平的引物。

例如：在本发明的实施例中，用于检测精巢特异蛋白基因的表达水平的引物包括包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。采用上述引物进行检测时，具有特异性好、扩增效果高等优点。

本发明提供一种用于评价昆虫种群质量的试剂盒，包括上述的引物。采用上述试剂盒可以方便、快捷、高效的评价昆虫种群质量，尤其是评价大草蛉的产卵总量、寿命、卵重、孵化率等指标。

所述试剂盒除了包括上述引物外，还可以包括其他用于荧光定量PCR检测的试剂，例如以下试剂中的一种或几种的组合：水、缓冲液、荧光定量PCR检测所用的酶、镁离子、dNTPs、荧光染料、内参基因引物等。

上述内参基因的引物序列可以包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明提供上述引物和/或上述试剂盒在评价昆虫种群质量中的应用。采用上述引物或试剂盒评价昆虫种群质量具有方便、快捷、高效等优点。

本发明提供一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法，包括以下步骤：检测精巢特异蛋白基因的表达水平。

采用上述方案的有益效果是：采用本发明的方法评价昆虫群体质量仅需1天，而用传统的方法计数昆虫寿命与产卵量，通常需要至少1个月时间。本发明的检测方法涉及的材料易于获得，操作方便、快捷、高效、结果准确，适合于在昆虫规模化生产中推广应用。

进一步，采用实时荧光PCR方法检测精巢特异蛋白基因的表达水平。

进一步，荧光定量PCR方法采用的引物包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列和SEQID NO:4所示的核苷酸序列。

在具体实施过程中，荧光定量PCR的反应体系可以包括：待检测cDNA模板、检测精巢特异蛋白基因的表达水平的引物、内参基因引物、水、缓冲液、荧光定量PCR用酶、镁离子、dNTPs、荧光染料。在反应体系中还可以包括对照组。

荧光定量PCR的反应条件可以包括：95℃、2min；95℃、10s，60℃、30s，40个循环；95℃、10s，65℃、60s；97℃、1s。

采用上述的反应体系和反应条件，有利于保障引物的特异性，减少非特异性扩增，真实反映基因的表达水平。

用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法的评价标准包括：调节cDNA浓度，将内参基因的ct值控制在15.5-16.5之间。当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)等于或小于15.73时，说明群体的质量正常；当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)大于15.73时，说明群体的质量下降，差值越大，群体质量越差。

具体的，当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)等于或小于15.73时，说明群体寿命正常；当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)大于15.73时，说明群体寿命下降，差值越大，群体寿命下降越多。

当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)等于或小于15.73时，说明产卵总量正常；当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)大于15.73时，说明产卵总量下降，差值越大，产卵总量下降越多。

当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)等于或小于15.73时，说明群体的卵重正常；当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)大于15.73时，说明卵重下降，差值越大，卵重下降越多。

当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)等于或小于15.73时，说明群体的孵化率正常；当ct值之差(tbp基因ct值-内参基因ct值)大于15.73时，说明孵化率下降，差值越大，孵化率下降越多。

在本发明实施例中，内参基因为actin基因。

附图说明

图1为本发明实施例中扩增雄虫精巢特异蛋白基因tbp与内参基因actin的引物的熔解曲线。

图2为本发明实施例第1代成虫和第20代成虫的tbp的表达水平的检测结果(图中不同的字母表示有显著性差异)。

图3为本发明实施例第1代成虫和第20代成虫的产卵总量的检测结果(图中不同的字母表示有显著性差异)。

图4为本发明实施例第1代成虫和第20代成虫的寿命的检测结果(图中不同的字母表示有显著性差异)。

图5为本发明实施例第1代成虫和第20代成虫的卵重的检测结果(图中不同的字母表示有显著性差异)。

图6为本发明实施例第1代成虫和第20代成虫的卵孵化率检测结果(图中不同的字母表示有显著性差异)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫群体质量的方法，通过检测大草蛉精巢特异蛋白基因的表达水平，预测大草蛉雄虫寿命，及与其交配后雌虫的繁殖能力，从而全面、快捷、高效、准确地评价大草蛉种群质量。

本发明所提供的一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫群体质量的方法，包括大草蛉雄虫精巢特异蛋白基因cDNA序列，以及通过检测此精巢特异蛋白基因的表达水平，全面、快捷、高效地评价大草蛉种群质量。

上述昆虫具体可以为大草蛉(Chrysopa pallens)。

上述精巢特异蛋白基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:1所示的序列，氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:2所示的序列。

上述用精巢特异蛋白基因评价昆虫群体质量的方法，是用实时荧光PCR检测精巢特异蛋白基因的表达水平，预测大草蛉雄虫寿命情况，及与其交配后雌虫的繁殖能力。

下面通过具体实施例来进一步介绍。在实施例中，检测两种大草蛉雄虫精巢特异蛋白基因的表达水平，预测雄虫的寿命及与雌虫交配后雌虫的繁殖能力。

实施例1检测雄虫精巢特异蛋白基因表达

设两个处理组，羽化后将大草蛉雌虫与雄虫配对，用蚕豆蚜饲养，温度为26-27℃,相对湿度为60％。

处理组1为野外采集的大草蛉个体在室内饲养得到的第1代成虫；处理组2为野外采集的大草蛉个体在室内饲养得到的第20代成虫。

1.1提取整虫总RNA

采用北京兰易科技有限公司的LanEasy高纯总RNA快速提取试剂盒提取总RNA，型号LY-0003。提取整虫总RNA的方法包括以下步骤：

(1)羽化后第5天，将大草蛉单头雄成虫在液氮中磨碎，每个处理随机挑选4头。每50-100mg组织中加1ml的裂解液RL后匀浆，将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全裂解。

(2)每1ml裂解液RL加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下静置3分钟。

(3)于4℃条件下，12,000rpm离心10分钟，样品分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中，取上层水相小心转移到新管中(不要碰到中间层)，记录水相体积。

(4)加入水相体积一半的无水乙醇，混匀，将得到的溶液一起转入吸附柱RA中，12,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新套回收集管中。

(5)加入500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心1分钟，弃废液。

(6)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心1分钟，弃废液。

(7)重复步骤(6)一次。

(8)将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液。

(9)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附柱中间部位加入50μlRNase free water，室温静置2分钟，12,000rpm离心1分钟。将所得样品在-80℃冰箱中保存。

1.2RNA质量检测

(1)分光光度计检测RNA浓度和纯度：吸取1μl RNA样品检测其浓度及OD260/OD280、OD260/OD230。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性：取5μl样品与1μl 6x DNA loading buffer混匀，点入胶孔中，140V，15min，于凝胶成像仪下，根据条带分布和亮度判断RNA是否完整。

1.3去除第一链cDNA的合成及gDNA

使用北京全式金生物技术有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix试剂盒获取cDNA，型号AT311。包括以下步骤：

(1)在离心管中加入以下组分：

(2)轻轻混匀，置于PCR仪中，42℃15分钟。

(3)85℃加热5秒。

(4)将反应产物放于-20℃保存。

1.4实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR检测tbp基因，选择actin基因作为内参基因。

使用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的Hieff Universal BlueqPCR SYBR Master Mix(型号11184ES08)配制反应体系。

(1)根据转录组数据中的序列，利用Primer Premier5.0软件设计qPCR引物，以cDNA为模板(即步骤1.3获得的反应产物)，按照下列反应体系，在冰上配制。每头个体设置3个技术重复。

(2)扩增程序：

表1荧光定量引物序列

表1中所有引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1中，引物qCpTBP-F为扩增tbp基因部分片段的正向引物，引物qCpTBP-R为扩增tbp基因部分片段的反向引物；引物actin-F为扩增actin基因部分片段的正向引物，引物actin-R为扩增actin基因部分片段的反向引物。

(3)实时荧光定量PCR检测结果：

如图1所示，扩增雄虫精巢特异蛋白基因tbp与内参基因actin的引物的熔解曲线都呈现单峰，说明两对引物的特异性好，扩增效率高。表2为内参基因actin与tbp基因的ct值。如图2所示，第20代雄成虫tbp的表达水平显著低于第1代雄成虫tbp的表达水平。两个处理组tbp的相对表达水平如图2所示。基因的相对表达水平采用2^-△△CT方法计算，计算公式为：△△CT＝(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。目的基因相对表达量＝2^-△△CT，表示的是实验组目的基因表达量相对于对照组目的基因表达量的倍数。

表2各处理基因表达定量检测ct值

从表2中可以看出，第1代的ct值之差为15.73，说明群体的质量正常；第20代的ct值之差大于15.73时，说明群体的质量下降。

实施例2雄虫寿命与雌虫繁殖能力检测

对上述第1代大草蛉、第20代大草蛉分别检测大草蛉的产卵总量、寿命、卵重和孵化率等指标。

检测方法及结果如下：

取野外采集的大草蛉个体在室内饲养后得到的第1代成虫36对，野外采集的个体在室内饲养后得到的第20代成虫33对。羽化后将雌雄虫配对饲养，每日观察雄虫存活，雄虫全部死亡后，统计雄虫寿命，第20代雄虫寿命显著缩短(图4)。每日记录雌虫产卵量，统计产卵总量，第20代雌雄虫交配后产卵总量显著减少(图3)。羽化后第2周每天随机挑选卵100粒以上，用分析天平称重，统计卵重，第20代雌雄虫交配后产的卵显著减轻(图5)。称重后将卵保留，置于光照培养箱，观察孵化，及时将孵出的幼虫转移走，每日观察与转移3次，计算孵化率，第20代雌雄虫交配后产的卵孵化率显著下降(图6)。由此可见，当大草蛉雄成虫的两个基因ct值之差(tbp基因ct值-actin基因ct值)小于15.73时，雄虫寿命将短于33.03天，同一群体中雌虫产卵总量将低于980粒，卵重将低于110.97微克/粒，卵孵化率将低于89.8％。当大草蛉雄成虫的两个基因ct值之差(tbp基因ct值-actin基因ct值)为16.93时，雄虫寿命将缩短至约28.21天，同一群体中雌虫产卵总量将下降到约527粒，卵重将下降到约99.19微克/粒，卵孵化率将下降到约43.8％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9201

<212> DNA

<213> 大草蛉(Chrysopa pallens)

<400> 1

atggcatctt ttgtttttaa aactgaagct tacccaaaaa caacgggttt ttataaaaaa 60

actttttatc caccttcacg agttgatttg tatgatgaag ctcaatattg ttatacaaca 120

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ggtttaaaaa atcagcctgt attgttattt gatgattttg ctcagattaa tgaagaaaat 5220

ccatatttat tagatcaaat tacagatttg tttaatttaa agtcatctgc tatttataat 5280

cctcctatgg ctgcagtaga agaaaagaat ttgaggtata atccaaagct tgttgttttg 5340

tgtactaata ccccgtatcc tgtaccacaa ggtatagcta gtgtttctgc ttttcataga 5400

cgaagggata tgatgattag tatcagatgg aagaaggagt ttaaggataa aacagtttta 5460

acattaccat ctattataaa gaatacatat caacatttac aatttgcgat tcgagctagt 5520

tcaactaaga atgatgttat tccagaagat gcttggttag attctttgga agaactttat 5580

gaaaaaatag aagagaggta tgatgctttt tatgagaatg aatctaataa tttccaaatg 5640

cgattaaata gattacgaag tgttcaagaa gagaatttgg atatattaag tttgaatgct 5700

attaaggaag aataccatgc tgttatagct ttagcggcat cacaaggtac ttatgattat 5760

gcaccattaa aacaacaggt tatggaaaca tatagtggat acaatataga aaagaagcgt 5820

aagtattgta ctcttttaaa taagaatata gaaatggaat catctaatat atttgaagat 5880

atcacaagtg ctttagaagc gatggatttg aaagttcaac ctgaagctga ttttgcgatt 5940

gaagaaaatg tagattgtat gcatttattg tgttttcctg aaacattaaa aggctttgat 6000

attacaaaat tgaaagatag tatatatata agtaggaagg aagttgagag ttgtgtaagt 6060

ccagctttat tgaatgaaga agtttcagag atatatagag aaatgtttaa aggaaataca 6120

gagtggaatt taagttcgtt taatgaaggc ttatttatat tacctcaatc aaagtctttt 6180

ataccagttc ctgttgctaa gtgttgtaaa aaaggaaaag gaacaacaga ttgtattatg 6240

catgatgaat tagtatatca aagttttaga aaggctatta aatactggtt tgataattta 6300

gtagaagatg agagacaatt tctgttaaga ttttcaaaag gagaaaaagc agaggataat 6360

catttacctt ttatattatt aaaagatttg ttgtttgaaa aaactcctgt aaaaatttct 6420

aaagcttttg aggaatgtgt tcaaaatgct gaaaaagatg taacttggtt atcgaaagga 6480

gttcgttata tttggacatt gattaaaggt ttgacttggg ttttatgtaa aatggcatcg 6540

tacgcagtat tctttggtgg aatgtctgct ttagtaactt tttccaaccc attatctgag 6600

tcaaatattc gaaacggtat aaacggtgct atagtgaaaa caacaaaaga tttaacaggt 6660

tcaaatattg cagctactgc tatgggatta gttgttcaca aaggagattt aggttcgtca 6720

ttaaaaagtg ttataggaac agaagtactt tggggtggga agaaaaatcc agagatgtct 6780

tatacacaat ataatacgaa agctgtccct actattcagg gcgctattaa gataataaga 6840

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actaatattt tggtagtaga tcatatggtt gattatataa gaaagagttt tgatgatgat 7020

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attgatgttt tattattgga agattcagta tatcgtatta taaattgtaa gtttcatatg 7140

ccaaaattta aatcattagt aaaatatatg caaaatcaaa aagctagtgg cgcatgtgct 7200

ccagatgggt atttagttga acctacttta attatagata aagctaaacc atcaacatat 7260

acagtagata taacgataca tcgacaatct actttagaag ttgcgcataa tgtagcaata 7320

acaggtgata aatcaaaagg tatacaacca tcttgtgcta gagattgtta tacatatcaa 7380

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tattccaaat ttagaccaca aggtttttct tcaaaacgat ggttatttga tataaattat 8040

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acagatcttg ctaattactt attatcaaat agtgaacata tagttacagg tgattataaa 8400

aattttggcc ctacattaat ggctgcttgt gttagtaaag cttttgaaat aattagagaa 8460

tggtatcatt ttaattcaaa ggattttaaa gttgatccaa atgatgattt aattagatat 8520

attttaggat atgagatgac gtattcttat caccttatgg aagatcttgt atatcaagtc 8580

tgttgtggcg ctccttcagg atcgccacta acagtagttt taaataattt ggttaatggg 8640

ttatatatcc gttatgcttg gttgtgttta atgaaaaata caggtatata ttcatcttta 8700

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ttaaaaaatt taggtatgta a 9201

<210> 2

<211> 3066

<212> PRT

<213> 大草蛉(Chrysopa pallens)

<400> 2

Met Ala Ser Phe Val Phe Lys Thr Glu Ala Tyr Pro Lys Thr Thr Gly

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Glu Ala Gln Tyr Cys Tyr Thr Thr Gly Asp Glu Asn Leu Val Ser Trp

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Phe Glu Gln Val Phe Asp Arg Asn Phe Lys Lys Asn Ser Asn Ile Thr

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Tyr Asn Leu Leu Glu Val Glu Tyr Asp Asn Lys Gln Tyr His Ile Val

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Thr Glu Ile Asn Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Val Tyr Tyr Arg Ile Asp

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Glu Val Trp Glu Tyr Ser Pro Glu Leu Gly Lys Leu Gly Phe Val Tyr

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Phe Lys Arg Val Asn Val Asp Pro Leu Pro Ile Tyr Gln His Leu Ser

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Asp Ser Cys Val Ala Pro Leu Lys Ser Glu Cys Asn Cys Ile Tyr Lys

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Asn Ile Val Asn Arg Val Val Lys His Lys Ile Asp Lys Met Ser Phe

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Pro Ser Arg Ser Ile Met Leu Leu Tyr Lys Ile Lys Val Leu Ile Asp

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Lys Leu Lys Ser Ile Arg Cys Asn Ile Ile Gln Leu Lys Arg Phe Asp

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Phe Arg Ala His Asn Ser Ile Glu Lys Ala Val Glu Ala Leu Glu Leu

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Glu Tyr Ile Gln Pro Glu Met Pro Gly Asp Thr Pro Leu Asp Asp Leu

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Lys Leu Thr Thr Asp Thr Met Val Ser Leu Arg Leu Phe Gly Asp Val

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Leu Ser Thr Leu Lys Glu Ser Pro Val Thr Ser Met Phe Asn Tyr Phe

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Met Pro His Val Lys Ile Asp Ala Ser Lys Ala Asn Glu Val Glu Leu

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Ala Tyr Ser Asp Asp Tyr Ser Tyr Gly Arg Phe Met Val Met Pro Ile

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Phe Lys Val Thr Ser Arg Leu Leu Lys Thr Asp Ser Asp Asp Glu Tyr

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Tyr Ala Val Ser Leu Ile Val Asn Gly Asp Lys Asp Thr Tyr Lys Tyr

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2690 2695 2700

Arg Leu Asn Asn Gln Ile Pro Phe Thr Leu Phe Thr Asp Ser Leu Lys

2705 2710 2715 2720

Asp Leu Lys Met Pro Ala Glu Lys Cys Ile Ile Pro Gly Lys Thr Arg

2725 2730 2735

Val Phe Ser Leu Cys Pro Val Asp Phe Leu Leu Asp Val Arg Val Tyr

2740 2745 2750

Phe Gly Asp Phe Val Ala Ser Tyr Thr Lys Ala Arg Leu Ser Ala Glu

2755 2760 2765

His Ala Val Gly Ile Asn Val Asn Ser Tyr Glu Trp Thr Asp Leu Ala

2770 2775 2780

Asn Tyr Leu Leu Ser Asn Ser Glu His Ile Val Thr Gly Asp Tyr Lys

2785 2790 2795 2800

Asn Phe Gly Pro Thr Leu Met Ala Ala Cys Val Ser Lys Ala Phe Glu

2805 2810 2815

Ile Ile Arg Glu Trp Tyr His Phe Asn Ser Lys Asp Phe Lys Val Asp

2820 2825 2830

Pro Asn Asp Asp Leu Ile Arg Tyr Ile Leu Gly Tyr Glu Met Thr Tyr

2835 2840 2845

Ser Tyr His Leu Met Glu Asp Leu Val Tyr Gln Val Cys Cys Gly Ala

2850 2855 2860

Pro Ser Gly Ser Pro Leu Thr Val Val Leu Asn Asn Leu Val Asn Gly

2865 2870 2875 2880

Leu Tyr Ile Arg Tyr Ala Trp Leu Cys Leu Met Lys Asn Thr Gly Ile

2885 2890 2895

Tyr Ser Ser Leu Lys Asp Phe His Asp Asn Val Arg Val Ile Phe Tyr

2900 2905 2910

Gly Asp Asp Ile Ile Met Ser Val Lys Glu Cys Val Leu Glu Tyr Phe

2915 2920 2925

Asn Ala Lys Lys Ile Ser Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Asn Ile Ile Phe

2930 2935 2940

Thr Asp Ser Ala Lys Ser Asn Cys Ile Lys Pro Ser Ser Ser Leu Tyr

2945 2950 2955 2960

Asp Glu Glu Thr Thr Phe Leu Lys Cys His Phe Val Pro His Pro Tyr

2965 2970 2975

Arg Ser Gly Thr Ile Leu Pro Arg Ile Asp Lys Arg Ala Ile Leu Glu

2980 2985 2990

Val Pro Asn Trp Ile Phe Lys Thr Lys Asp Glu Tyr Ala Ala Thr Ala

2995 3000 3005

Gln Ala Ile Gln Ser Met Phe Val Gly Leu Tyr Gly His Gly Glu Glu

3010 3015 3020

Phe Tyr Glu His Asn Lys Glu Lys Ile Ile Arg Ile Leu Lys Glu Asn

3025 3030 3035 3040

Glu Met Leu Tyr His Pro Ser Phe Arg Asn Leu Asn Ile Pro Ser Trp

3045 3050 3055

Arg Asp Val Asp Leu Lys Asn Leu Gly Met

3060 3065

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctttggtgga atgtctg 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatcccatag cagtagc 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacttcccga cggtcaagtc at 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgttggcgta caagtcctta cg 22

Claims

1.一种用精巢特异蛋白基因评价昆虫种群质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：检测精巢特异蛋白基因的表达水平；精巢特异蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；昆虫为大草蛉。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，包括以下步骤：采用荧光定量PCR方法检测精巢特异蛋白基因的表达水平；荧光定量PCR方法采用的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示和SEQ ID NO:4所示。

3.一种精巢特异蛋白基因，其特征在于，精巢特异蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

4.一种精巢特异蛋白，其特征在于，精巢特异蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.精巢特异蛋白基因的表达水平在评价昆虫种群质量中的应用，其特征在于，精巢特异蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；昆虫为大草蛉。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，精巢特异蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；和/或精巢特异蛋白基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2。

7.用于检测精巢特异蛋白基因的表达水平的物质在评价昆虫种群质量中的应用，其特征在于，精巢特异蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；昆虫为大草蛉；所述物质为试剂，试剂包括引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示和SEQ ID NO:4所示。