CN113957113B - 一种牡蛎寡肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牡蛎寡肽及其制备方法，包括以下步骤：S1、取牡蛎肉，加入1.8‑2.2倍质量的纯化水进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为2‑4：6‑8：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，在40‑50℃条件下超声提取1‑2h；S2、在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1.2‑1.3：0.3‑0.5：0.8‑1.0的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，酶解130‑150min，灭酶，得到牡蛎酶解液；S3、牡蛎酶解液先在12000‑15000xg条件下离心3‑5min后收集上清液，将上清液以在70000‑80000xg条件下离心50‑60min，得到超速离心液；S4、将超速离心液经G‑10分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液；S5、将滤液于40‑50℃浓缩5‑8h，在‑80～‑90℃下真空冷冻干燥，得到目标牡蛎寡肽，对A549细胞抗Bap暴露导致的细胞损伤具有显著增强作用。
Description
技术领域
本发明涉及牡蛎加工技术领域，特别涉及一种牡蛎寡肽及其制备方法。
背景技术
牡蛎，别名又叫生蚝，为牡蛎科(ostreae)动物牡蛎(ostreagigastnunb)及其近缘动物的全体，是海产贝壳。在亚热带、热带沿海都适宜蚝的养殖，我国分布很广，北起鸭绿江，南至海南岛，沿海皆可产蚝。蚝乃软体有壳，依附寄生的动物，咸淡水交界所产尤为肥美。现有以牡蛎为原料，制备牡蛎肽具有抗菌、抗疲劳、抗氧化等作用。例如许旻等采用复合酶法制备了牡蛎抗氧化肽。进一步优化牡蛎寡肽制备工艺，开发牡蛎寡肽更多功效性，提高牡蛎寡肽应用范畴，具有较大意义。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种牡蛎寡肽及其制备方法，较大幅度增强产品功效。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种牡蛎寡肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取牡蛎肉，加入1.8-2.2倍质量的纯化水进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为2-4：6-8：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，在40-50℃条件下超声提取1-2h；
S2、在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1.2-1.3：0.3-0.5：0.8-1.0的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，酶解130-150min，灭酶，得到牡蛎酶解液；
S3、牡蛎酶解液先在12000-15000xg条件下离心3-5min后收集上清液，将上清液以在70000-80000xg条件下离心50-60min，得到超速离心液；
S4、将超速离心液经G-10分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液；
S5、将滤液于40-50℃浓缩5-8h，在-80～-90℃下真空冷冻干燥，得到牡蛎寡肽。
进一步，S1步骤中，所述匀浆温度为38-40℃。
进一步，S1步骤中，所述乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为3：7：1。
进一步，S1步骤中，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的4-6倍。
进一步，S2步骤中，所述复合酶的添加量为牡蛎肉浆质量的0.1-0.3％。
进一步，S2步骤中，所述酶解温度为35-38℃。
进一步，S3步骤中，牡蛎酶解液先在13000xg条件下离心4min后收集上清液，将上清液以在75000xg条件下离心60min，得到超速离心液。
进一步，S5步骤中，所述冷冻干燥时间为20-28h。更进一步，所述冷冻干燥时间为24h。
一种牡蛎寡肽，由本发明任一项所述的方法制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明制备的牡蛎寡肽，具有增强A549细胞抗Bap暴露诱导的氧化应激和炎性损伤的功能，提高在Bap暴露情况下A549细胞细胞活性，避免Bap暴露诱发氧化应激、炎性因子分泌所导致呼吸道上皮细胞损伤。其中本发明采用一定体积比的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，在一定条件下进行超声处理，采用一定质量比的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶进行酶解，本发明采用低速结合超高速离心处理，最后采用特定的分子筛凝胶层析纯化，较大程度充分提取，提高纯化水平，得到优质牡蛎寡肽，较大幅度增强产品功效作用。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种牡蛎寡肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取牡蛎肉，加入2倍质量的纯化水，在38℃温度条件下进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为3：7：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的5倍，在45℃条件下超声提取1.5h；
S2、在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1.2：0.4：0.8的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，所述复合酶的添加量为牡蛎肉浆质量的0.2％，在36℃温度条件下酶解140min，灭酶，得到牡蛎酶解液；
S3、牡蛎酶解液先在13000xg条件下离心4min后收集上清液，将上清液以在75000xg条件下离心60min，得到超速离心液；
S4、将超速离心液经Sephadex G-10分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液；
S5、将滤液于40-50℃浓缩6h，在-80～-90℃温度下真空冷冻干燥24h，得到牡蛎寡肽。
实施例2
一种牡蛎寡肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取牡蛎肉，加入2倍质量的纯化水，在40℃温度条件下进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为2：8：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的4倍，在50℃条件下超声提取1h；
S2、在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1.2：0.5：1.0的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，所述复合酶的添加量为牡蛎肉浆质量的0.1％，在35℃温度条件下酶解130min，灭酶，得到牡蛎酶解液；
S3、牡蛎酶解液先在12000xg条件下离心5min后收集上清液，将上清液以在70000xg条件下离心60min，得到超速离心液；
S4、将超速离心液经Sephadex G-10分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液；
S5、将滤液于40-50℃浓缩6h，在-80～-90℃温度下真空冷冻干燥24h，得到牡蛎寡肽。
实施例3
一种牡蛎寡肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取牡蛎肉，加入2倍质量的纯化水，在38℃温度条件下进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为4：6：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的6倍，在40℃条件下超声提取2h；
S2、在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1.3：0.3：0.8的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，所述复合酶的添加量为牡蛎肉浆质量的0.3％，在38℃温度条件下酶解150min，灭酶，得到牡蛎酶解液；
S3、牡蛎酶解液先在15000xg条件下离心3min后收集上清液，将上清液以在80000xg条件下离心50min，得到超速离心液；
S4、将超速离心液经Sephadex G-10分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液；
S5、将滤液于40-50℃浓缩6h，在-80～-90℃温度下真空冷冻干燥24h，得到牡蛎寡肽。
对比例1
与实施例1主要区别在于，S1步骤中，乙酸乙酯、甲醇和纯化水的体积比为1：1：1。取牡蛎肉，加入2倍质量的纯化水，在38℃温度条件下进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为1：1：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的5倍，在45℃条件下超声提取1.5h。其他步骤与实施例1一致。
对比例2
与实施例1主要区别在于，S1步骤中，在60℃条件下超声提取2.5h。取牡蛎肉，加入2倍质量的纯化水，在40℃温度条件下进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为2：8：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的4倍，在60℃条件下超声提取2.5h。其他步骤与实施例1一致。
对比例3
与实施例1主要区别在于，S2步骤中，复合酶中胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的质量比为1：1：1：1。在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1：1：1的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，所述复合酶的添加量为牡蛎肉浆质量的0.2％，在35-38℃温度条件下酶解140min，灭酶，得到牡蛎酶解液。其他步骤与实施例1一致。
对比例4
与实施例1主要区别在于，S3步骤中，牡蛎酶解液先在75000xg条件下离心60min，后收集上清液，将上清液以在13000xg条件下离心4min得到离心液。其他步骤与实施例1一致。
对比例5
与实施例1主要区别在于，S4步骤中，G-10分子筛凝胶层析替换为G-25分子筛凝胶层析。将超速离心液经Sephadex G-25分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液。其他步骤与实施例1一致。
将上述实施例以及对比例制得牡蛎寡肽，检测其抗细胞损伤活性。试验方法如下：
将A549细胞在DMEM培养基(10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mmol/LL-谷氨酰胺)置于37℃5％的CO2培养箱中培养。A549细胞(3×104细胞/孔)接种于96孔培养板中培养12h。
Bap(10nmol/L)处理细胞3.0h后，离心，弃上清液，细胞分别与实施例1-3以及对比例1-5牡蛎寡肽(依次为试验组1-8)共培养12h，CCK8检测试剂盒检测细胞活性，各试验组牡蛎寡肽的加入量均为5mg/L。另外设置对照组，不添加牡蛎寡肽。同时设置正常组，未经Bap处理细胞，而且未加入牡蛎寡肽。将正常组细胞存活率设为100％，统计细胞存活率，并计算细胞存活率相对提高百分比。
细胞存活率＝试验组或对照组细胞存活数/正常组细胞存活数*100％；
细胞存活率相对提高百分比＝(试验组细胞存活率-对照组细胞存活率)/对照组细胞存活率*100％。
结果如下：
上述结果表明，结果表明实施例1-3以及对比例1-5制得牡蛎寡肽对A549细胞抗Bap暴露导致的细胞损伤具有一定增强作用，其中，相对于对照组，实施例1-3细胞存活率相对提高明显。另外，与对比例1-2对比，本发明采用一定体积比的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，结合一定超声条件，更好提高超声提取效果。与对比例3对比，本发明采用一定质量比的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶进行酶解，充分提高酶解效果。与对比例4对比，本发明采用低速结合超高速离心处理，进一步提高寡肽分离效果，改善了寡肽纯度。对比例5对比，本发明采用特定的分子筛凝胶层析，较大提高了纯化效果，提高了牡蛎寡肽品质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种牡蛎寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取牡蛎肉，加入2倍质量的纯化水进行匀浆，得到牡蛎肉浆；加入体积比为3：7：1的乙酸乙酯、甲醇和纯化水，在45℃条件下超声提取1.5h；
S2、在超声后的牡蛎肉浆中，加入质量比为1：1.2：0.4：0.8的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的复合酶，酶解130-150min，灭酶，得到牡蛎酶解液；
S3、牡蛎酶解液先在13000xg条件下离心4min后收集上清液，将上清液以在75000xg条件下离心60min，得到超速离心液；
S4、将超速离心液经G-10分子筛凝胶层析处理，收集层析滤液；
S5、将滤液于40-50℃浓缩5-8h，在-80～-90℃下真空冷冻干燥，得到牡蛎寡肽；
S1步骤中，所述乙酸乙酯、甲醇和纯化水的总质量为牡蛎肉浆质量的5倍；
S1步骤中，所述匀浆温度为38-40℃；
S2步骤中，所述酶解温度为36℃；
S2步骤中，所述复合酶的添加量为牡蛎肉浆质量0.2％。
2.根据权利要求1所述的牡蛎寡肽的制备方法，其特征在于，S5步骤中，所述冷冻干燥时间为20-28h。
3.根据权利要求2所述的牡蛎寡肽的制备方法，其特征在于，S5步骤中，所述冷冻干燥时间为24h。
4.一种牡蛎寡肽，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述的牡蛎寡肽的制备方法制得。
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| 复合酶提取牡蛎抗氧化肽的工艺研究;许旻等;《福建水产》;第36卷(第05期);第366-375页，特别是摘要、"1.2"、第366页全部 * |
| 鱼类脱脂方法研究进展;吴燕燕等;《核农学报》;第30卷(第06期);第1163-1168页，特别是"2" * |
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