CN113957032A - 一种高乙醇耐受性菌种的选育方法 - Google Patents
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Abstract
申请涉及菌种选育领域，尤其涉及一种高乙醇耐受性菌种的选育方法；所述方法包括：得到发酵菌株株系；将发酵菌株株系进行第一筛选培养，得到纯种菌株；将纯种菌株进行第一培养，至乙醇浓度达到第一设定浓度为止，得到发酵醪液；将乙醇逐步加入到发酵醪液中，至乙醇浓度达到第二设定浓度为止，并进行第二筛选培养，得到多个高耐受性的菌种；将多个高耐受性的菌种进行扩大培养，后进行第一培养和第二培养，分别得到高耐受性的菌株和乙醇产率；根据乙醇产率，判断高耐受性的菌株是否合格；若是，将高耐受性的菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；通过上述方法，能准确筛选出高乙醇耐受性的菌种，进而得到高乙醇耐受性的乙醇梭菌。
Description
技术领域
本申请涉及菌种选育领域，尤其涉及一种高乙醇耐受性菌种的选育方法。
背景技术
生物燃料乙醇(Bioethanol)是目前一种可行的替代化石燃料的能源，越来越受到世界各国的关注，发展潜力巨大。目前除以淀粉质和纤维素为原料生产燃料乙醇外，以气体一氧化碳为原料发酵生产燃料乙醇则是引起全世界瞩目的新技术新工艺。
目前以气体一氧化碳为原料发酵生产燃料乙醇存在的问题是发酵后的成熟醪液的酒精浓度较低，导致后端工序乙醇蒸馏及废液处理等的成本升高，因此提高发酵成熟醪液中乙醇的浓度能够减少后续乙醇精馏及废液处理等的运行成本，而提高发酵液成熟醪液中乙醇的浓度，将导致乙醇梭菌的生长繁殖受抑制。因此如何提高乙酸梭菌的乙醇耐受性，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种高乙醇耐受性菌种的选育方法，以解决现有技术中乙醇梭菌的乙醇耐受性难以提高的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种高乙醇耐受性菌种的选育方法，所述方法包括：
得到发酵菌株株系；
将所述发酵菌株株系进行第一筛选培养，得到纯种菌株；
将所述纯种菌株进行第一培养，至发酵培养体系中的乙醇浓度达到第一设定浓度为止，得到发酵醪液；
将乙醇分批次加入到所述发酵醪液中，以使所述发酵醪液中乙醇的终浓度呈梯度升高，至所述发酵醪液中的乙醇浓度达到第二设定浓度为止，并进行第二筛选培养和分离，得到多个高耐受性的菌种；
将多个高耐受性的所述菌种进行扩大培养，后进行第一培养和第二培养，分别得到高耐受性的菌株和乙醇产率；
根据所述乙醇产率，判断高耐受性的所述菌株是否合格；
若是，将高耐受性的所述菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，所述第一培养的气氛为CO、N2和CO2的混合气，所述第二培养的气氛为工业尾气；
所述第一设定浓度为45g/L～50g/L，所述第二设定浓度为75g/L～80g/L。
可选的，所述梯度为2g/L～5g/L。
可选的，所述逐步加入的间隔时间为12h～24h。
可选的，以体积分数计，所述第一培养的气氛包括：CO：50％～55％，N2：25％～30％和CO2：15％～20％；
第二培养的气氛：CO：50％～65％，CO2：10％～20％和N2：20％～30％，其余为不可避免的杂质。
可选的，所述第一培养的时间为3～4周，所述第二培养的时间为3～4周，所述第一筛选培养的时间为2～3周，所述第二筛选培养的时间为3～4周。
可选的，所述扩大培养的培养基为液态培养基，所述第一筛选培养的培养基为固态培养基，所述液态培养基和所述固态培养基都包括无氧培养基。
可选的，所述第一筛选培养包括：通过平板培养的方式进行第一筛选培养；
所述第一筛选培养的时间为2～3周。
可选的，所述纯种菌株的数量为10株～20株，所述高耐受性的菌种的数量为3株～5株。
可选的，所述得到发酵菌株株系，具体包括：
得到连续发酵的终端发酵后的发酵废液；
将所述发酵废液进行过滤和离心，后洗涤，得到发酵菌株株系。
可选的，所述根据所述乙醇产率，判断高耐受性的所述菌株是否合格，具体包括：
得到设定乙醇产率；
根据所述设定乙醇产率和所述乙醇产率的大小，判断高耐受性的所述菌株是否合格；
若所述设定乙醇产率≥所述乙醇产率，判定高耐受性的所述菌株不合格，重新进行所述发酵菌株株系的获得；
若所述设定乙醇产率＜所述乙醇产率，判定高耐受性的所述菌株合格，将高耐受性的所述菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，所述设定乙醇产率≥90kg/h。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种高乙醇耐受性菌种的选育方法，通过对发酵的菌株体系进行分离纯化，再通过以高浓度乙醇进行梯度浓度的定向培养，最后通过扩大培养、第一培养和第二培养进行发酵验证，结合菌株分离纯化工艺、定向筛选培养工艺和发酵验证试验工艺，从而能准确筛选出高乙醇耐受性的菌种，进而得到高乙醇耐受性的乙醇梭菌。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的方法的详细流程示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请一个实施例中，如图1所示，提供一种高乙醇耐受性菌种的选育方法，所述方法包括：
S1.得到发酵菌株株系；
S2.将所述发酵菌株株系进行第一筛选培养，得到纯种菌株；
S3.将所述纯种菌株进行第一培养，至发酵培养体系中的乙醇浓度达到第一设定浓度为止，得到发酵醪液；
S4.将乙醇分批次加入到所述发酵醪液中，以使所述发酵醪液中乙醇的终浓度呈梯度升高，至所述发酵醪液中的乙醇浓度达到第二设定浓度为止，并进行第二筛选培养和分离，得到多个高耐受性的菌种；
S5.将多个高耐受性的所述菌种进行扩大培养，后进行第一培养和第二培养，分别得到高耐受性的菌株和乙醇产率；
S6.根据所述乙醇产率，判断高耐受性的所述菌株是否合格；
若是，将高耐受性的所述菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，所述第一培养的气氛为CO、N2和CO2的混合气，所述第二培养的气氛为工业尾气；
所述第一设定浓度为45g/L～50g/L，所述第二设定浓度为75g/L～80g/L，第一培养的培养基为：10kg的质量分数为85％H3PO4、2kg的MgSO4·7H2O、1.5kg的FeSO4·7H2O、10kg的CaCl2、5L的Wolfe维生素溶液、5L的微量元素和1m3的水。
本申请中，第一设定浓度为45g/L～50g/L的积极效果是在该设定浓度范围内，能在第一培养的条件下，初步将具有乙醇耐受性的菌株体系筛选出；当设定浓度的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是过高的第一设定浓度将影响后续第二筛选培养的进行，影响对菌株的乙醇耐受性的评价，当设定浓度的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过低的第一设定浓度，无法在第一培养的条件下，有效的将乙醇耐受的菌株体系筛选出。
第二设定浓度为75g/L～80g/L的积极效果是在该设定浓度的范围内，已达到乙醇的高浓度条件，因此通过第二设定浓度的筛选，能将高乙醇耐受的菌种筛选出；当设定浓度的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是过高的第二设定浓度将导致菌株死亡，影响筛选的结果，当设定浓度的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过低的第二设定浓度将无法达到高浓度乙醇的需求，导致筛选出结果不准确。
作为一个可选的实施方式，所述梯度为2g/L～5g/L。
本申请中，限定梯度为2g/L～5g/L的积极效果是在该浓度范围内，能逐步细分不同菌种的乙醇耐受的上限，同时对菌种本身的伤害程度低，方便精准的分离出高乙醇耐受性的菌种。
作为一个可选的实施方式，所述逐步加入的间隔时间为12h～24h。
本申请中，逐步加入的间隔时间为12h～24h的积极效果是在该时间范围内，能使在不同梯度浓度的乙醇条件下的菌株有足够的时间繁殖；当时间的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是过长的间隔时间将增加整体的时间，不利于节约原则，当时间的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过短的间隔时间将无法保证菌株有足够的时间繁殖，影响对菌株是否对高浓度乙醇耐受的判断。
作为一个可选的实施方式，以体积分数计，所述第一培养的气氛包括：CO：50％～55％，N2：25％～30％和CO2：15％～20％；
第二培养的气氛：CO：50％～65％，CO2：10％～20％和N2：20％～30％，其余为不可避免的杂质。
本申请中，第一培养的气氛中，CO的体积分数为50％～55％的积极效果是该体积分数范围，是乙醇梭菌生长繁殖的最适浓度，能保证菌体健康生长，同时保证菌体代谢选择性趋向目标产物乙醇；当体积分数的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是CO占比过多，导致碳源供过于求，菌体生长将受到抑制，当体积分数的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是CO占比不足，导致菌体代谢选择性趋于其他产物。
CO2、N2的体积分数的积效果是，在各自的体积分数范围内，能模拟工业尾气。
第二培养的气氛为工业尾气实事数据。
作为一个可选的实施方式，所述第一培养的时间为3～4周，所述第二培养的时间为3～4周，所述第一筛选培养的时间为2～3周，所述第二筛选培养的时间为3～4周。
本申请中，第一培养的时间为3～4周的积极效果是在该时间范围内，能保证菌株有足够的时间生长繁殖，且进入生长代谢稳定期；当时间的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是过长的培养时间将增加工艺的整体耗时，不利于节约原则，当时间的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过短的培养时间将无法保证菌株有足够的时间生长繁殖及代谢，影响对菌株是否对高浓度乙醇具有耐受性的判断。
第二培养的时间为3～4周的积极效果是该时间范围内，能保证菌株有足够的时间生长繁殖，且进入生长代谢稳定期；当时间的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是过长的培养时间将增加工艺的整体耗时，不利于节约原则，当时间的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过短的培养时间将无法保证菌株有足够的时间生长繁殖及代谢，影响对菌株是否对高浓度乙醇具有耐受性的判断。
第一筛选培养的时间为2～3周的积极效果是在该时间范围内，能保证平板培养对细菌菌落的形态和特征有明显的区别作用；当时间的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是时间过长，将导致培养基营养匮乏，致使部分细菌死亡，同时菌落特征衰退，影响后续的判断过程，当时间的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过短的培养时间将无法保证细菌菌落特征的明显区别。
第二筛选培养的时间为3～4周的积极效果是菌株有足够的时间生长繁殖，且进入生长代谢稳定期；当时间的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是过长的培养时间将增加整体的时间，不利于节约原则，当时间的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过短的培养时间将无法保证菌株有足够的时间生长繁殖及代谢，影响对菌株是否对高浓度乙醇耐受的判断。
作为一个可选的实施方式，所述扩大培养的培养基为液态培养基，所述第一筛选培养的培养基为固态培养基，所述液态培养基和所述固态培养基都包括无氧培养基，其中，无氧培养基的成分包括1.0g的NH4Cl、0.1g的KCl、0.2g的MgSO4·7H2O、0.8g的NaCl、10.0mg的CaCl2·2H2O、1.0g的酵母粉、10.0mL的微量元素、10.0mL的Wolfe维生素溶液、2.0g的NaHCO3、5.0g的果糖和980.0mL的蒸馏水。
作为一个可选的实施方式，所述第一筛选培养包括：通过平板培养的方式进行第一筛选培养；
所述第一筛选培养的时间为2～3周。
本申请中，通过平板培养的方式进行第一筛选培养的积极效果是由于平板培养对菌种的形态和特征有明显的区别作用，因此通过平板培养，可将无氧特性的微生物筛选出。
第一筛选培养的时间为2～3周的积极效果是在该时间范围内，能保证平板培养对细菌菌落的形态和特征有明显的区别作用；当时间的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是培养时间过长，导致培养基营养匮乏，部分细菌死亡，从而使菌落特征衰退，影响后续判断过程，当时间的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是过短的培养时间将无法保证细菌菌落特征的明显区别，影响后续判断过程。
作为一个可选的实施方式，所述纯种菌株的数量为10株～20株，所述高耐受性的菌种的数量为3株～5株。
本申请中，纯种菌株的数量为10株～20株的积极效果是在该数量范围内，既能节约试验时间，又不至于漏掉乙醇耐受性的菌株；当菌株的数量的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是菌株数量过多，增加整体筛选的时间，不利于节约原则，当菌株的数量的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是筛选出菌株过少，高乙醇耐受性的菌株漏掉的风险几率过大。
高耐受性的菌种的数量为3株～5株的积极效果是在该数量范围内，既能节约试验时间，又不至于漏掉乙醇耐受性的菌株；当菌株的数量的取值大于该范围的端点最大值，将导致的不利影响是菌株数量过多，增加整体筛选的时间，不利于节约原则，当菌株的数量的取值小于该范围的端点最小值，将导致的不利影响是筛选出菌株过少，高乙醇耐受性的菌株漏掉的风险几率过大。
作为一个可选的实施方式，如图2所示，所述得到发酵菌株株系，具体包括：
S11.得到连续发酵的终端发酵后的发酵废液；
S12.将所述发酵废液进行过滤和离心，后洗涤，得到发酵菌株株系。
作为一个可选的实施方式，如图2所示，所述根据所述乙醇产率，判断高耐受性的所述菌株是否合格，具体包括：
S61.得到设定乙醇产率；
S62.根据所述设定乙醇产率和所述乙醇产率的大小，判断高耐受性的所述菌株是否合格；
若所述设定乙醇产率≥所述乙醇产率，判定高耐受性的所述菌株不合格，重新进行所述发酵菌株株系的获得；
若所述设定乙醇产率＜所述乙醇产率，判定高耐受性的所述菌株合格，将高耐受性的所述菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，所述设定乙醇产率≥90kg/h。
本申请中，设定乙醇产率≥90kg/h的积极效果是能充分筛选出乙醇耐受菌种。
实施例1
如图2所示，一种高乙醇耐受性菌种的选育方法，所述方法包括：
S11.得到连续发酵的终端发酵后的发酵废液；
S12.将发酵废液进行过滤和离心，后洗涤，得到发酵菌株株系；
S2.将发酵菌株株系进行第一筛选培养，得到纯种菌株；
S3.将纯种菌株进行第一培养，至发酵培养体系中的乙醇浓度达到第一设定浓度为止，得到发酵醪液；
S4.将乙醇分批次加入到发酵醪液中，以使发酵醪液中乙醇的终浓度呈梯度升高，至发酵醪液中的乙醇浓度达到第二设定浓度为止，并进行第二筛选培养和分离，得到多个高耐受性的菌种；
S5.将多个高耐受性的菌种进行扩大培养，后进行第一培养和第二培养，分别得到高耐受性的菌株和乙醇产率；
S61.得到设定乙醇产率；
S62.根据设定乙醇产率和乙醇产率的大小，判断高耐受性的菌株是否合格；
若设定乙醇产率≥乙醇产率，判定高耐受性的菌株不合格，重新进行发酵菌株株系的获得；
若设定乙醇产率＜乙醇产率，判定高耐受性的菌株合格，将高耐受性的菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，设定乙醇产率≥90kg/h，第一培养的气氛为CO、N2和CO2的混合气，第二培养的气氛为工业尾气；
第一设定浓度为50g/L，第二设定浓度为0g/L。
梯度为2g/L～5g/L，分别形成乙醇终浓度为55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、73g/L、75g/L、77g/L和80g/L的梯度发酵醪液。
逐步加入的间隔时间为15h。
以体积分数计，第一培养的气氛包括：CO：53％，N2：28％和CO2：19％；
第二培养的气氛：CO：57％，CO2：17％和N2：24％，其余为不可避免的杂质。
第一培养的时间为23天，第二培养的时间为25天，第一筛选培养的时间为18天，第二筛选培养的时间为26天。
扩大培养的培养基为液态培养基，第一筛选培养的培养基为固态培养基，液态培养基和固态培养基都包括无氧培养基。
第一筛选培养包括：通过平板培养的方式进行第一筛选培养；
第一筛选培养的时间为18天。
纯种菌株的数量为15株，高耐受性的菌种的数量为4株。
实施例2
将实施例2和实施例1相对比，实施例2和实施例1的区别在于：取值范围的端点最小值第一设定浓度为45g/L，第二设定浓度为75g/L。
梯度为2g/L～5g/L，分别形成乙醇终浓度为55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、73g/L和75g/L的梯度发酵醪液。
逐步加入的间隔时间为12小时。
以体积分数计，第一培养的气氛包括：CO：50％，N2：30％和CO2：20％；
第二培养的气氛：CO：50％，CO2：10％和N2：20％，其余为不可避免的杂质。
第一培养的时间为3周，第二培养的时间为3周，第一筛选培养的时间为2周，第二筛选培养的时间为3周。
扩大培养的培养基为液态培养基，第一筛选培养的培养基为固态培养基，液态培养基和固态培养基都包括无氧培养基。
第一筛选培养包括：通过平板培养的方式进行第一筛选培养；
第一筛选培养的时间为2周。
纯种菌株的数量为10株，高耐受性的菌种的数量为3株。
实施例3
将实施例3和实施例1相对比，实施例3和实施例1的区别在于：第一设定浓度为47g/L，第二设定浓度为77g/L。
梯度为2g/L～5g/L，分别形成乙醇终浓度为55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、73g/L、75g/L和77g/L的梯度发酵醪液。
逐步加入的间隔时间为24h。
以体积分数计，第一培养的气氛包括：CO：55％，N2：30％和CO2：15％；
第二培养的气氛：CO：65％，CO2：15％和N2：18％，其余为不可避免的杂质。
第一培养的时间为4周，第二培养的时间为4周，第一筛选培养的时间为3周，第二筛选培养的时间为4周。
扩大培养的培养基为液态培养基，第一筛选培养的培养基为固态培养基，液态培养基和固态培养基都包括无氧培养基。
第一筛选培养包括：通过平板培养的方式进行第一筛选培养；
第一筛选培养的时间为3周。
纯种菌株的数量为20株，高耐受性的菌种的数量为5株。
对比例1
将对比例1和实施例1相对比，对比例1和实施例1的区别在于：
不采用逐步加入的方式，直接将发酵醪液的乙醇浓度调整到第二设定浓度。
对比例2
将对比例2和实施例1相对比，对比例2和实施例1的区别在于：
将纯种菌株进行第一培养，至发酵培养体系中的乙醇浓度达到第二设定浓度为止，得到发酵醪液。
对比例3
将对比例3和实施例1相对比，对比例3和实施例1的区别在于：
只进行第一培养。
对比例4
将对比例4和实施例1相对比，对比例4和实施例1的区别在于：
只进行第二培养。
对比例5
将对比例5和实施例1相对比，对比例5和实施例1的区别在于：
设定乙醇产率≥80kg/h。
第一设定浓度为40g/L，第二设定浓度为70g/L。
梯度为2g/L～5g/L，分别形成乙醇终浓度为55g/L、60g/L、65g/L和70g/L的梯度发酵醪液。
逐步加入的间隔时间为10h。
第一培养的时间为15天，第二培养的时间为18天，第一筛选培养的时间为10天，第二筛选培养的时间为16天。
对比例6
将对比例6和实施例1相对比，对比例6和实施例1的区别在于：
第一设定浓度为55g/L，第二设定浓度为85g/L。
梯度为2g/L～5g/L，分别形成乙醇终浓度为55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、73g/L、75g/L、77g/L、80g/L、83g/L和85g/L的梯度发酵醪液。
逐步加入的间隔时间为28h。
第一培养的时间为30天，第二培养的时间为32天，第一筛选培养的时间为25天，第二筛选培养的时间为34天。
相关实验：
将实施例1-3和对比例1-6所得的高乙醇耐受性菌种，分别在相同的环境进行以气体一氧化碳为原料发酵生产燃料乙醇，检测生产过程中的相关参数，结果如表1所示。
相关实验的测试方法：CO利用率的计算公式：
UCo＝(QF*XFCo-QVG*XVGCO)/(QF*XFCO)
其中：QF为总进气量；XFCO为进气CO摩尔分数；QVG为尾气流量；XVGCO为尾气CO摩尔分数；XFCO为进气CO摩尔分数。
在生产过程中，气体进出发酵罐的流量由流量计检测、CO浓度由CO在线检测仪检测。
乙醇生产率的计算公式：
乙醇生产率＝每小时外排发酵醪液*乙醇浓度
其中，进行生产试验的发酵罐体积为20m3，有效体积约16m3，生产稳定期稀释率发酵罐中液体置换的速度为2.0，即可计算出每小时外排发酵醪液约为1.33m3。
表1
表1具体分析：
CO的利用率是指所筛选出的乙醇梭菌的菌种进行以气体一氧化碳为原料发酵生产燃料乙醇中，对原料CO的利用程度，当CO的利用率越高，说明所得的乙醇梭菌能充分利用CO，间接说明得到的乙醇产品越多。
乙醇生产率是指所筛选出的乙醇梭菌的菌种进行以气体一氧化碳为原料发酵生产燃料乙醇中，所得的乙醇产品的产出率，当乙醇生产率越高，说明得到的乙醇梭菌的乙醇耐受性越高。
从实施例1-3的数据可知：
实施例1-3中得到的菌株在生产验证中表现出：CO利用率高、乙醇生产率也高，说明筛选出的菌株适合生产工序。
从对比例1-6的数据可知：
如果不按照本申请实施例所提供的方法进行菌种选育，得到的菌株则不是最优菌株。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
(1)本申请实施例所提供的方法，通过对菌株分离纯化工艺、定向筛选培养工艺和发酵验证试验工艺三者进行结合，对现有的以气体一氧化碳为原料发酵生产燃料乙醇的生产菌株进行筛选和驯化，从而增强其对生产产物乙醇的耐受性。
(2)本申请实施例所提供的方法，通过对菌种的乙醇耐受性的提升，可明显提高乙醇梭菌产乙醇的潜能，提高了CO的利用率和乙醇生产率。
(3)本申请实施例提供的方法，由于采用的高乙醇耐受性的菌种，因此可降低后续乙醇精馏及废液处理等的运行成本。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而目还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种高乙醇耐受性菌种的选育方法，其特征在于，所述方法包括：
得到发酵菌株株系；
将所述发酵菌株株系进行第一筛选培养，得到纯种菌株；
将所述纯种菌株进行第一培养，至发酵培养体系中的乙醇浓度达到第一设定浓度为止，得到发酵醪液；
将乙醇分批次加入到所述发酵醪液中，以使所述发酵醪液中乙醇的终浓度呈梯度升高，至所述发酵醪液中的乙醇浓度达到第二设定浓度为止，并进行第二筛选培养和分离，得到多个高耐受性的菌种；
将多个高耐受性的所述菌种进行扩大培养，后进行所述第一培养和第二培养，分别得到高耐受性的菌株和乙醇产率；
根据所述乙醇产率，判断高耐受性的所述菌株是否合格；
若是，将高耐受性的所述菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，所述第一培养的气氛为CO、N2和CO2的混合气，所述第二培养的气氛为工业尾气；
所述第一设定浓度为45g/L～50g/L，所述第二设定浓度为75g/L～80g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度为2g/L～5g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述间歇加入的间隔时间为12h～24h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以体积分数计，所述第一培养的气氛包括：CO：50％～55％，N2：25％～30％和CO2：15％～20％；
第二培养的气氛：CO：50％～65％，CO2：10％～20％和N2：20％～30％，其余为不可避免的杂质。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养的时间为3～4周，所述第二培养的时间为3～4周，所述第一筛选培养的时间为2～3周，所述第二筛选培养的时间为3～4周。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩大培养的培养基为液态培养基，所述第一筛选培养的培养基为固态培养基，所述液态培养基和所述固态培养基都包括无氧培养基。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述第一筛选培养包括：通过平板培养的方式进行第一筛选培养；
所述第一筛选培养的时间为2～3周。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯种菌株的数量为10株～20株，所述高耐受性的菌种的数量为3株～5株。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述得到发酵菌株株系，具体包括：
得到连续发酵的终端发酵后的发酵废液；
将所述发酵废液进行过滤和离心，后洗涤，得到发酵菌株株系。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据所述乙醇产率，判断高耐受性的所述菌株是否合格，具体包括：
得到设定乙醇产率；
根据所述设定乙醇产率和所述乙醇产率的大小，判断高耐受性的所述菌株是否合格；
若所述设定乙醇产率≥所述乙醇产率，判定高耐受性的所述菌株不合格，重新进行所述发酵菌株株系的获得；
若所述设定乙醇产率＜所述乙醇产率，判定高耐受性的所述菌株合格，将高耐受性的所述菌株进行冷冻保藏，得到高乙醇耐受性菌种；
其中，所述设定乙醇产率≥90kg/h。
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2021
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