CN113943829A - 检测抗als抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对、试剂盒及检测方法和应用，涉及分子生物学技术领域。本发明所述特异性条带特异性好，PCR目的条带清晰。利用本发明所述特异性引物对或包含所述特异性引物对的试剂盒，可准确专一的鉴定出抗ALS抑制剂类除草剂雀麦，检测方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。本发明还提供了基于所述特异性引物对和试剂盒的检测方法，可以高效、准确的检测田间疑似抗性的雀麦ALS突变位点和氨基酸突变类型，可以指导是否可以继续使用ALS抑制剂类除草剂来防除抗性雀麦。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
小麦是我国主要粮食作物之一，其产量高低与国计民生休戚相关。杂草危害是导致小麦减产的主要因素之一。随着全球环境变化、农业种植制度的改变、机械化农事操作的应用和不同地区小麦引种等原因导致小麦田杂草种群发生了变化。目前雀麦已演替为小麦田恶性杂草之一。雀麦发生地块平均造成小麦减产15～30％，发生严重地块小麦产量损失达70％左右。目前生产上主要采用氟唑磺隆对其进行防治。
氟唑磺隆属于乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂，用作茎叶处理剂，通过抑制杂草体内ALS活性，造成杂草体内亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Iie)、缬氨酸(Val)合成受阻，导致杂草因营养物质匮乏而死。因常年连续使用雀麦对氟唑磺隆产生了抗药性，导致氟唑磺隆对雀麦的防治效果明显降低，因此造成了加大用药剂量的不良处理方案，其后果导致杂草防治成本增加和小麦药害风险升高，同时加大了更多抗性杂草出现的可能性，违背了我国当前农药减量使用的绿色农业发展策略，对粮食增产、农民增收和国家粮食安全造成严重危害。因此，开发一种高效、快速、简便的抗药性杂草检测方法迫在眉睫。
当前主要采用盆栽法对抗药性杂草进行鉴定。采集成熟度一致的田间疑似抗药性杂草种子，温室内播种于大小适宜的盆钵内，待杂草长至3～4叶期，间苗定株喷药，药后2～4周剪取地上部分称重计算EC50(对杂草鲜重抑制达50％时除草剂用量)和抗药性指数。此方法可以直观的评价杂草对除草剂的抗药性水平，但是占用空间多和工作量大，检测周期长，并且无法直接指导科学用药。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对、试剂盒及检测方法和应用，利用更简单的分子生物学技术检测ALS基因保守区的突变位点来确定抗ALS抑制剂类除草剂抗性是否存在，速度快、成本低、准确度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物对。
优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。
本发明还提供了上述特异性引物对或上述试剂盒在检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦中的应用。
本发明还提供了一种检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的方法，包括以下步骤：以雀麦基因组DNA为模板，利用上述特异性引物对或上述试剂盒中的特异性引物对进行PCR扩增，对扩增产物的氨基酸序列与ALS蛋白进行比对，如在所述ALS蛋白的保守位点发生点突变，则为抗ALS抑制剂类除草剂雀麦；
所述保守位点包括第122位、197位、205位、376位、574位、653位和654位中的一个或多个位点。
优选的，所述PCR扩增的体系以25μL计，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各0.5μL，2×Es Taq MasterMix 12.5μL，模板1μL和余量的双蒸水。
优选的，所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
优选的，所述保守位点的点突变包括第122位的丙氨酸突变为苏氨酸，第197位的脯氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或组氨酸，第205位的丙氨酸突变为缬氨酸，第376位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第574位的色氨酸突变为亮氨酸，第653位的丝氨酸突变为天冬酰胺，第654位的丝氨酸突变为酪氨酸。
优选的，所述ALS蛋白的编码基因的NCBI登记号为NP_190425。
本发明还提供了上述特异性引物对或上所述试剂盒或上述方法在指导ALS抑制剂类除草剂用药中的应用。
有益效果：本发明提供了检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对，所述特异性条带特异性好，PCR目的条带清晰。利用本发明所述特异性引物对或包含所述特异性引物对的试剂盒，可准确专一的鉴定出抗ALS抑制剂类除草剂雀麦，检测方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。
本发明还提供了利用上述特异性引物对的检测方法，对不同冬小麦田采集的对ALS抑制剂类除草剂产生抗性的雀麦进行PCR扩增后测序，通过对不同雀麦种群ALS基因编码区DNA序列进行比对分析，明确抗性雀麦ALS保守位点突变情况。本发明实施例中，对河北省不同冬小麦田采集的18个雀麦种群，按照本发明的检测方法进行检测，结果表明，有11个种群的ALS第197位脯氨酸突变为了丝氨酸，有3个种群的ALS第197位脯氨酸突变为了苏氨酸，有1个种群的ALS第197位脯氨酸突变为了精氨酸，有1个种群的ALS第376位天冬氨酸突变为谷氨酸，有2个种群为敏感种群。综上，利用本发明所述方法可以高效、准确的检测田间疑似抗性的雀麦ALS突变位点和氨基酸突变类型，可以指导是否可以继续使用ALS抑制剂类除草剂来防除抗性雀麦。
附图说明
图1为特异性引物PCR扩增效率和特异性检测；其中泳道1为DNA Marker DL2000；泳道2～13为不同雀麦种群ALS基因PCR扩增条带；
图2为PCR扩增不同雀麦种群ALS基因结果；其中泳道1为DNA Marker DL2000；泳道2～11为不同雀麦种群ALS基因PCR扩增条带；
图3为18个雀麦种群ALS基因PCR扩增目的条带胶回收电泳图；其中泳道1为DNAMarker DL2000；泳道2～19为不同雀麦种群ALS基因PCR扩增条带；
图4为不同雀麦种群ALS第197位氨基酸突变情况；其中A为抗性雀麦种群2、3、4、8、10、12、13、14、16、17、18等ALS第197位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸；B为抗性雀麦种群1、9、11等ALS第197位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸；C为抗性雀麦种群7的ALS第197位氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；D敏感雀麦种群5和6等ALS第197位氨基酸为脯氨酸；
图5为不同雀麦种群ALS第376位氨基酸突变情况；其中A为抗性雀麦种群15的ALS第376位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸；B为敏感雀麦种群5和6等ALS第376位氨基酸为天冬氨酸。
具体实施方式
本发明提供了检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明所述特异性引物对优选根据NCBI网站登录的旱雀麦ALS基因序列片段(登记号AF488771.1)设计得到，且扩增目的片段长度为1686bp。本发明所述特异性引物对的PCR产物序列包含ALS的第122位、197位、205位、376位、377位、574位、653位、654位等与杂草抗性产生有关的8个氨基酸突变位点。本发明所述特异性引物对的序列如下：
正向引物ALS-F：5’-CGCCGACATCCTCGTCGAGGC-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物ALS-R：5’-ATGATGTCCTTAAAAGCACCAC-3’(SEQ ID NO.2)。
利用本发明所述特异性引物对，进行PCR扩增，结果显示目的条带长度正确、清晰明亮，说明引物扩增效率高，特异性强。
本发明还提供了一种检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物对。
本发明所述试剂盒优选还包括PCR扩增试剂，更优选包括2×Es Taq MasterMix和双蒸水。
本发明还提供了上述特异性引物对或上述试剂盒在检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦中的应用。
利用本发明所述特异性引物对可特异性扩增雀麦ALS基因序列片段，并且扩增产物包含ALS的第122位、197位、205位、376位、377位、574位、653位、654位等与杂草抗性产生有关的8个氨基酸突变位点，可用于检测雀麦ALS基因突变位点，从而确定是否产生了ALS抑制剂类除草剂抗性。
本发明还提供了一种检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的方法，包括以下步骤：以雀麦基因组DNA为模板，利用上述特异性引物对或上述试剂盒中的特异性引物对进行PCR扩增，对扩增产物的氨基酸序列与ALS蛋白进行比对，如在所述ALS蛋白的保守位点发生点突变，则为抗ALS抑制剂类除草剂雀麦；
所述保守位点包括第122位、197位、205位、376位、574位、653位和654位中的一个或多个位点。
本发明所述PCR扩增的体系优选以25μL计，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各0.5μL，2×Es Taq MasterMix 12.5μL，模板1μL和余量的双蒸水。在本发明所述体系中，引物的浓度优选均为10pmol/L，模板的浓度不低于50ng/μL。本发明对所述模板的获取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规基因组DNA提取方法即可，在本发明实施例中利用CTAB法进行基因组DNA的提取，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明所述PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
本发明优选将经所述PCR扩增后获得的扩增产物测序，抗性和敏感雀麦种群ALS基因测序后进行序列比对分析，明确ALS保守位点是否发生点突变，所述保守位点的点突变包括第122位的丙氨酸突变为苏氨酸，第197位的脯氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或组氨酸，第205位的丙氨酸突变为缬氨酸，第376位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第574位的色氨酸突变为亮氨酸，第653位的丝氨酸突变为天冬酰胺，第654位的丝氨酸突变为酪氨酸。在本发明中，用于进行比对的所述ALS蛋白为来源于拟南芥的蛋白，其编码基因的NCBI登记号为NP_190425。
利用本发明所述检测方法可以高效、准确的检测田间疑似抗性的雀麦ALS突变位点和氨基酸突变类型，可以指导是否可以继续使用ALS抑制剂类除草剂来防除抗性雀麦和选用不同作用靶标的除草剂对抗性雀麦进行防治。
本发明还提供了上述特异性引物对或上所述试剂盒或上述方法在指导ALS抑制剂类除草剂用药中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对、试剂盒及检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、雀麦基因组DNA的提取
取雀麦苗期叶片0.2g，研钵内加入液氮充分研磨，采用CTAB法提取雀麦基因组DNA，DNA浓度大于50ng/μL。
2、引物合成
由通用生物系统(安徽)有限公司合成SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。利用不同雀麦种群进行引物PCR扩增，结果显示目的条带长度正确、清晰明亮，说明引物扩增效率高，特异性强(图1)。
3、用于检测雀麦ALS突变位点的PCR反应体系
PCR反应体系，其中上下游引物(浓度10pmol/L)各0.5μL，2×Es TaqMasterMix12.5μL，DNA模板1μL，双蒸水10.5μL。
4、用于扩增雀麦ALS基因的反应程序
PCR扩增反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存。
5、PCR产物鉴定与测序
PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带清晰，亮度高(图2)。将PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。抗性和敏感雀麦种群ALS基因测序后进行序列比对分析，明确ALS突变位点。
实施例2
采集疑似产生抗性的雀麦种群，约取0.2g雀麦新鲜嫩叶迅速加入液氮研磨，采用CTAB法提取基因组DNA，DNA浓度大于50ng/μL。试验方法参见实施例1。特异引物扩增雀麦ALS基因具有较好的特异性，扩增ALS基因编码区片段约为1700bp(图3)。利用该引物扩增抗性和敏感雀麦ALS基因，对PCR产物分别进行测序，通过序列比对分析找出突变位点(图4、图5)。
对河北省不同冬小麦田采集的18个雀麦种群，按照本发明的检测方法进行检测，结果表明，有11个种群的ALS第197位脯氨酸突变为了丝氨酸，有3个种群的ALS第197位脯氨酸突变为了苏氨酸，有1个种群的ALS第197位脯氨酸突变为了精氨酸，有1个种群的ALS第376位天冬氨酸突变为谷氨酸，有2个种群为敏感种群(表1)。
采用温室盆栽法，将上述18个雀麦种群播种于直径15cm盆钵内，温室内22℃(16hD/8hN)培养，自然光照。雀麦长至3～4叶期，喷施70％氟唑磺隆WDG。氟唑磺隆剂量分别设为0.14、1.4、14、140、420g ai/亩，另设清水对照，每处理4次重复。喷药28d后取地上鲜重，计算各药剂处理雀麦鲜重相对于清水对照处理的百分率。根据Log-logistic模型，计算不同雀麦种群的ED50，明确不同抗性雀麦种群抗性倍数(表1)。结果表明ALS第197位和376位氨基酸发生突变的雀麦种群对氟唑磺隆的抗性倍数在600以上。该结果进一步验证了本研究开发的抗性雀麦检测方法的准确性。
表1雀麦ALS基因突变情况
由此可见，本发明建立的检测方法可以高效、准确的检测田间疑似抗性的雀麦ALS突变位点和氨基酸突变类型，可以指导是否可以继续使用ALS抑制剂类除草剂来防除抗性雀麦。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所
<120> 检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对、试剂盒及检测方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgccgacatc ctcgtcgagg c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatgtcct taaaagcacc ac 22
Claims (10)
1.检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.一种检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述特异性引物对。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。
4.权利要求1所述特异性引物对或权利要求2或3所述试剂盒在检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦中的应用。
5.一种检测抗ALS抑制剂类除草剂雀麦的方法，其特征在于，包括以下步骤：以雀麦基因组DNA为模板，利用权利要求1所述特异性引物对或权利要求2或3所述试剂盒中的特异性引物对进行PCR扩增，对扩增产物的氨基酸序列与ALS蛋白进行比对，如在所述ALS蛋白的保守位点发生点突变，则为抗ALS抑制剂类除草剂雀麦；
所述保守位点包括第122位、197位、205位、376位、574位、653位和654位中的一个或多个位点。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系以25μL计，包括：SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各0.5μL，2×EsTaq MasterMix12.5μL，模板1μL和余量的双蒸水。
7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述保守位点的点突变包括第122位的丙氨酸突变为苏氨酸，第197位的脯氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或组氨酸，第205位的丙氨酸突变为缬氨酸，第376位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第574位的色氨酸突变为亮氨酸，第653位的丝氨酸突变为天冬酰胺，第654位的丝氨酸突变为酪氨酸。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述ALS蛋白的编码基因的NCBI登记号为NP_190425。
10.权利要求1所述特异性引物对或权利要求2或3所述试剂盒或权利要求5～9任一项所述方法在指导ALS抑制剂类除草剂用药中的应用。
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