CN113943741B - 水稻品质性状基因的基因编辑及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农作物领域，尤其涉及粳稻品种品质改良育种香味控制和淀粉合成基因的基因编辑方法及其应用。本发明公开了一种基因编辑转化载体，其以pCambia3301为载体骨架，还包括ZmU6启动子、ZmUBI1启动子；还包括针对Badh2和Waxy基因的不同外显子区域可识别位点设计的多个gRNA片段；所述gRNA片段位于所述ZmU6启动子、ZmUBI1启动子之间，且通过ZmU6启动子进行同步表达；所述gRNA片段通过tRNA技术交互连接。本发明通过构建基因编辑遗传转化载体，用农杆菌介导方法转化粳稻品种，实现了再生植株Badh2和Waxy基因目标区域核苷酸序列的多种编辑，并最终获得了具有香味的糯稻、非转基因、稳定遗传的纯合编辑水稻品系。

Description

水稻品质性状基因的基因编辑及应用
技术领域
本发明属于农作物领域，尤其涉及粳稻改良品系香味控制基因和淀粉合成酶基因的基因编辑方法及其应用。
背景技术
近年来快速发展的基因编辑技术利用特异性核酸内切酶选择性切断细胞中的特定基因，通过细胞固有的两种DNA修复机制，非同源末端链接Non-homologous end joining(NHEJ)和同源依赖修复Homology dependent repair(HDR)，修复断口，保障细胞存活。NHEJ的修复效率高，不需要模板，占主导地位，但切断点链接过程会引入插入或缺失突变，从而使基因失活；HDR需要依照模板，虽然修复精准，但所占比例很小，如果提供预先设计好的DNA片段作为模板，可以将该片段定点插入预选位点，将目标基因修改，但是效率极低，严重影响其广泛应用。两种编辑途径产生的后代经遗传分离后最终产品均可不含任何外源DNA，为非转基因产品，并且已经被许多国家相关管理部门认定为与常规育种产品等同，因此可以避免复杂昂贵的转基因产品监管审批过程和费用，适宜于快速生产应用。
基于酿脓链球菌Streptococcus pyogenes获得性免疫系统CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)的基因编辑技术2013年首次实现体内基因编辑(Jinek et al.,2012,Science 337:816-821；Cong et al.,2013,Science 339:819-823；Mali et al.,2013,Science 339:823-826)，Cas9核酸内切酶与导引gRNA形成核蛋白酶复合体，通过gRNA中20bp长的RNA序列与被编辑DNA序列的碱基配对识别目标，特异性高，酶切活性强，实验设计简单易行，使得CRISPR/Cas9基因编辑系统迅速在不同动植物系统中得到广泛的成功应用，也是基因编辑技术植物育种的优选方法，实现了多种植物大量基因的以NHEJ途径为主的敲除编辑以及少数HDR介导的精准设计编辑(Li et al.,2015Plant Physiol 169:960-970；Ma et al.,2016,Mol Plant 9:961-974；Chen et al.,2019,Annu Rev Plant Biol 70:667-97；Mao et al.,2019,Natl Sci Rev6:421-437)。结合多重gRNA同步表达技术，CRISPR/Cas9技术可以同时对多个基因多个位点进行高效NHEJ途径编辑，实现多种性状的同步改良(Xie et al.,2015,Proc Natl AcadSci USA 112:3570-3575；Hsieh-Feng and Yang 2020,aBIOTECH:doi.org/10.1007/s42994-019-00014-w)。但由于通过HDR途径的CRISPR/Cas9编辑效率往往远低于1％，而许多疾病治疗和育种改良需要对基因序列进行精准的编辑而不是简单敲除，因此迫切需要高效精准的改进HDR或替代基因编辑技术。
近期研发的单碱基编辑技术包括胞嘧啶编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺瞟呤编辑器(Adenine base editor,ABE)可以分别通过不可逆的C-T或A-G转换实现单个碱基的特定编辑，无需DNA双链断裂诱导的NHEJ或HDR修复途径参与。胞嘧啶编辑器由胞嘧啶核苷脱氨酶(Cytidine deaminase)和突变的nSpCas9(D10A)核酸切口酶或失活的dSpCas9核酸内切酶融合形成(Kim et al.,2017,Nat Biotechnol 35:371-376；Komor etal.,2016,Nature 533:420-424；Nishida et al.,2016,Science 353:aaf8729)，可以在动植物细胞中将Cas9-gRNA识别序列的第4到第8位窗口间的胞嘧啶有效地转换成胸腺嘧啶(Li et al.,2017,Mol Plant10:526-529；Lu and Zhu,2017,Mol Plant 10:523-525)。腺嘌呤编辑器由腺嘌呤核苷脱氨酶和突变的nSpCas9(D10A)核酸切口酶融合形成，可以类似地将腺嘌呤转换成鸟嘌呤(Gaudelli et al.,2017,Nature 551:464-471)，并也已成功的用于植物单碱基编辑(Hua et al.,2018,Mol Plant 11:627-630；Yan et al.,2018,MolPlant 11:631-634)。通过借助CBE和ABE两种编辑器，4种DNA碱基转换突变C-T,G-A和A-G,T-C都可以实现，但尚没有任何单碱基编辑器可以实现包括C-A,C-G,G-C,G-T,A-C,A-T,T-A,T-G的DNA碱基置换编辑。
因为CBE和ABE两种编辑器只能编辑大概5个碱基窗口中的对应单碱基，可以编辑的位点数直接受制于是否存在SpCas9要求的PAM序列，这种限制可以通过使用对PAM序列要求较为宽松的特殊SpCas9突变体例如xCas9,Cas-NG，和SpG而突破(Hu et al.,2018,Nature 556:57-63；Kleinstiver et al.,2015,Nature523:481-485；Nishimasu et al.,2018,Science 361:1259-1262；Walton et al.,2020,Science 368：290-296)，这些突变的SpCas9除识别NGG之外，能够不同程度地识别NGH(H＝A,C,T)PAM序列，有效地扩大了可以进行各类编辑的目标基因识别位点。
最新研发并成功应用的导引编辑技术(Prime editing)在精准基因编辑方面取得了突破性进展(Anzalone et al.,2019,Nature 576:149-157)。作者巧妙利用SpCas9(H840A)核酸切口酶在目标DNA被编辑链序列PAM上游产生的3’端单链游离末端，以其作为引物，将一小段编辑模板和与该引物对应的配对序列设计在gRNA的3’延伸片段区统称导引编辑gRNA(Prime editing gRNA,pegRNA)，并将RNA逆转录酶(Moloney murine leukemiavirus reverse transcriptase,MMLV-RT)融合在SpCas9(H840A)核酸切口酶的羧基端，当SpCas9(H840A)-MMLV-RT-pegRNA复合体识别并在PAM上游3bp处切口被编辑DNA链，产生的3’单链游离端头可以作为引物与pegRNA的3’延伸片段区的对应序列配对，由融合的MMLV-RT启动RNA逆转录，按照pegRNA的3’延伸片段区中的编辑模板将这个引物延伸，伸长后的3’单链游离端头可作为原位合成的单链DNA模板通过HDR方式将PAM上游的DNA缺口修复，同时将模板序列插入，从而在SpCas9(H840A)切口下游实现包括碱基转换、置换，小片段缺失、插入、替换等各种类型的精准基因编辑。
香味是水稻重要的食味品质性状，具有独特香味特性的稻米倍受消费者的欢迎。对香稻米的香气成分进行分析研究，检测出上百种挥发性的物质，其中的2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrrolin，2AP)是稻米香气的主要成分。2AP的生物合成前体是氨基丁醛(gamma-aminobutyraldehyde，GABald)，甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehydedehydrogenase，Badh，LOC_Os08g32870.1)可以将该前体转化成不具香味的氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)。如果将甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2突变失活，则阻断了氨基丁醛转化为氨基丁酸的途径，迫使氨基丁醛更多的转化为香味物质2-乙酰-1-吡咯啉，可以使稻米获得特殊香味(Bradbury et al.,2005，Plant Biotechnol J 3:363-370；Shanet al.,2015，Plant Biotechnol J 13:791-800)。
淀粉主要由线性的葡萄糖多聚糖直链淀粉和具大量分枝的支链淀粉构成，两种淀粉的比例决定谷粒的质地和口感。水稻淀粉合成酶基因Waxy即Granule-bound starchsynthase 1LOC_Os06g04200(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)是胚乳中直链淀粉合成的关键酶，其活性水平直接影响直链淀粉的含量(Zhou et al.,2016,ProcNatl Acad Sci USA 113:12844–12849)。用CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除Waxy基因可在不降低总淀粉含量的前提下将直链淀粉比例从约20％降低到约3％，将米粒半透明的普通水稻改造成米粒明显不透明且粘糯的糯稻(Ma et al.,2016,Mol Plant 9:961–974；Zhanget al.,2018,J Integr Plant Biol 60:369-375)。然而如何利用基因编辑手段对不同水稻品种进行多基因、多位点的同步基因编辑，以得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑粳稻品系还鲜有报道。
发明内容
本发明同时以控制水稻香味的甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2(LOC_Os08g32870.1)和控制直链与支链淀粉比例的淀粉合成酶基因Waxy(LOC_Os06g04200)为编辑目标，通过基因编辑手段对不同水稻品种进行多基因、多位点的同步基因编辑，以得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑粳稻品系。
本发明通过建立基于CRISPR的植物基因编辑体系(李忠森等，中国专利申请号202010675272.7)，设计并构建针对甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2(LOC_Os08g32870.1)和淀粉合成酶基因Waxy(LOC_Os06g04200)的基因编辑遗传转化载体，用农杆菌介导方法转化粳稻品种，实现了再生植株Badh2基因目标区域及Waxy基因目标区域核苷酸序列的多种编辑，并最终获得了具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑粳稻品系。
本发明涵盖从编辑载体设计和构建到转化植株后代基因编辑确认的完整过程，所用技术方案主要步骤包括基因编辑转化载体的设计构建，水稻栽培品种的遗传转化，转化事件的分子生物学分析和基因编辑确认，再生植株非转基因纯合编辑后代的筛选，实现了用基因编辑方法高效编辑目标性状基因。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种基因编辑转化载体，所述基因编辑转化载体以pCambia3301为载体骨架，其包括ZmU6启动子、ZmUBI1启动子；还包括针对被编辑目标基因的不同区域可识别位点设计的多个gRNA片段；所述gRNA片段位于所述ZmU6启动子、ZmUBI1启动子之间，且通过ZmU6启动子进行同步表达；所述gRNA片段通过tRNA技术交互连接。所述基因编辑转化载体核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
优选的，所述被编辑目标基因为Badh2和Waxy。优选的，所述ZmU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，或与SEQ ID NO：8序列具有至少90％同源性且功能相同的序列；
更优选的，所述ZmUBI1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9序列具有至少90％同源性且功能相同的序列；
更优选的，所述基因编辑转化载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，或与SEQ IDNO：7序列具有至少90％同源性且功能相同的序列。
本发明第二个方面公开了一种基因编辑转化载体的构建方法，包括：针对被编辑目标基因的不同区域可识别位点设计gRNA，多个所述gRNA通过tRNA技术交互连接后用克隆方法插入到转化载体的ZmU6启动子和gRNA骨架之间，由同一个ZmU6启动子同步表达，即得到所述基因编辑转化载体。优选的，所述被编辑目标基因为Badh2和Waxy基因。优选的，设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11-14所示的四个gRNA，与tRNA和gRNA骨架交互排列为tRNA-OsB2-G3-gRNA-tRNA-OsB2-G6-gRNA-tRNA-OsWx1-G3-gRNA-tRNA-Os Wx1-G4片段。
更优选的，所述tRNA-OsB2-G3-gRNA-tRNA-OsB2-G6-gRNA-tRNA-OsWx1-G3-gRNA-tRNA-Os Wx1-G4片段的两端分别有20bp的额外序列，所述额外序列与ZmU6启动子末端和gRNA骨架的5’末端序列同源。
更优选的，所述tRNA-OsB2-G3-gRNA-tRNA-OsB2-G6-gRNA-tRNA-OsWx1-G3-gRNA-tRNA-Os Wx1-G4片段位于所述ZmU6启动子和gRNA骨架之间的BsaI酶切位点上。
本发明第三个方面公开了一种水稻粳稻品种的遗传转化方法，通过农杆菌介导，将上述的基因编辑转化载体或上述方法得到的基因编辑转化载体导入水稻细胞，再筛选得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑水稻品系。
优选的，上述植物品种的遗传转化方法包括以下步骤：
(1)受体水稻进行遗传转化得到再生水稻；
(2)检测再生水稻的基因编辑是否成功；
(3)筛选得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑水稻品系。
更优选的，步骤(2)包括：
S21：采样再生植株叶片，提取基因组DNA后进行PCR1扩增，能获得特异性扩增片段的植株即为转化阳性；
S22：设计PCR2引物，获得目标基因片段，将再生植株的DNA片段与野生型序列进行对比，若再生植株DNA片段与野生型有确定的序列差异，则为基因编辑水稻。
本发明中序列的差异包括碱基的缺失、替换和插入。更优选的，步骤(3)中，预先用PCR3筛选T1植株，挑选纯合基因编辑植株。
优选的，步骤(3)中，预先用PCR3筛选T1植株，挑选纯合编辑植株，并测序编辑目标区域确认。在本发明的一些具体实施例中，步骤(3)中，将再生植株T0的种子种植萌发后得到后代植株T1，进行检测筛选得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合基因编辑后代植株。
本发明第四个方面公开了一种后代植株，通过上述方法制备得到。
优选的，所述的第一组后代植株为R14-1、R14-2、R14-3、R14-4、R14-5、R14-6、R14-7、R14-8、R14-9和R14-10，所述R14-1、R14-2、R14-3、R14-4、R14-5、R14-6、R14-7、R14-8、R14-9和R14-10中的Badh2基因分别如SEQ ID NO：28-37所示，Waxy基因分别如SEQ ID NO：38-47所示。所述的第二组后代植株为R31-1、R31-2、R31-3、R31-4、R31-5、R31-6、R31-7、和R31-8，所述R31-1、R31-2、R31-3、R31-4、R31-5、R31-6、R31-7、和R31-8中的Badh2基因分别如SEQ ID NO：48-55所示，Waxy基因分别如SEQ ID NO：56-63所示。所述的第三组后代植株为R52-1、R52-2、R52-3、R52-4、和R52-5，所述R52-1、R52-2、R52-3、R52-4、和R52-5中的Badh2基因分别如SEQ ID NO：64-68所示，Waxy基因分别如SEQ ID NO：69-73所示。
本发明第五个方面公开了一种植株，所述植株以上述的后代植株为原材料进行育种得到。
本发明第六个方面公开了如下应用：
(a)根据上述的基因编辑转化载体或上述的构建方法得到的基因编辑转化载体在水稻育种领域中的应用；
(b)根据上述的方法、上述的后代植株或上述的植株在水稻育种领域中的应用；
优选的，所述应用为在水稻食味改良育种领域的应用。
在本发明的一些优选实施例中，包括：
一、基因编辑转化载体的构建：
基于酿脓链球菌Streptococcus pyogenes获得性免疫系统CRISPR核酸内切酶Cas9的基因编辑已经在多种植物中实现，NHEJ编辑效率常常高达90％，参考基因编辑农杆菌转化载体pHSE401设计(Xing et al.,2014,BMC Plant Biol 14:327)，通过使用单子叶植物专用启动子等增强Cas9和gRNA表达，有助于在水稻中实现高效基因编辑。为了分别提高Cas9和gRNA基因在水稻中的表达，根据相关基因的公开DNA序列设计特异性引物(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，用PCR扩增方法克隆玉米泛素基因GRMZM2G409726启动子ZmUBI1 pro和位于未知基因GRMZM2G148773下游的一个U6 snRNA基因启动子ZmU6 pro，分别用于在水稻和玉米等禾本科植物中高效表达Cas9和gRNA基因。最终形成的基因编辑专用农杆菌转化DNA双元载体由三个基因表达单元ZmU6 pro:gRNA:AtU6-26 term，ZmUBI1pro:SpCas9:PsE9 term，和35S pro:HYG:35S term组成，ZmU6 pro和gRNA之间留有BsaI酶切位点，可将载体线性化后用DNA连接酶或Gibson克隆方法将任何gRNA序列插入(李忠森等，中国专利申请号202010675272.7)。
水稻甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2(LOC_Os08g32870.1)的结构比较复杂(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，总长6268bp(SEQ ID NO：1)，由15个外显子和14个内含子组成(图1a)，预期的编码序列长1509bp(SEQ ID NO：2)，编码含502氨基酸长的甜菜碱醛脱氢酶BADH2(SEQ ID NO：3)。中国著名的黑龙江五常优质香米稻花香的特殊香味是由第7个外显子8个碱基GATTATGG的缺失突变造就的。为了用基因编辑方法通过定点突变Badh2基因，敲除甜菜碱醛脱氢酶功能，挑选Badh2基因的不同外显子区域多个SpCas9可识别位点设计了gRNA，多个gRNA通过tRNA技术交互连接，用Gibson克隆方法插入到上述基因编辑专用农杆菌转化DNA双元载体的ZmU6启动子和gRNA骨架之间的BsaI酶切位点，由同一个ZmU6启动子同步表达。
淀粉主要由线性的葡萄糖多聚糖直链淀粉和具大量分枝的支链淀粉构成，两种淀粉的比例决定谷粒的质地和口感。水稻淀粉合成酶基因Waxy(LOC_Os06g04200)是胚乳中直链淀粉合成的关键酶，其活性水平直接影响直链淀粉的含量。Waxy基因LOC_Os06g04200比较复杂，由14个外显子和13个内含子组成(图1b)，总长5035bp(SEQ ID NO：4)，蛋白编码序列(SEQ ID NO：5)始于第二个外显子，编码609aa长的酶蛋白(SEQ ID NO：6)。为了用基因编辑方法通过定点突变Waxy基因，敲除淀粉合成酶功能，挑选Waxy基因的不同外显子区域多个SpCas9可识别位点设计了gRNA，多个gRNA通过tRNA技术交互连接，用Gibson克隆方法插入到上述基因编辑专用农杆菌转化DNA双元载体的ZmU6启动子和gRNA骨架之间的BsaI酶切位点，由同一个ZmU6启动子同步表达。
设计的OsB2-G3，OsB2-G6，OsWx1-G3，OsWx1-G4四个gRNA(SEQ ID NO：11-14)与tRNA和gRNA骨架交互排列为tRNA-OsB2-G3-gRNA-tRNA-OsB2-G6-gRNA-tRNA-OsWx1-G3-gRNA-tRNA-Os Wx1-G4片段(SEQ ID NO：10)，并且两端分别有20bp额外序列与基因编辑载体KF50(SEQ ID NO：7)ZmU6启动子3’末端和gRNA骨架的5’末端序列同源，人工合成后用NEBuilder克隆方法(New England Biolabs)，插入到ZmU6启动子和gRNA骨架之间，构建成为基因编辑载体KF50。用ZmU6-F2引物(SEQ ID NO：15)测序确认无误后，转入水稻转化用农杆菌菌株EHA105，于-80℃冰箱保存备用。
二、农杆菌介导的水稻遗传转化：
农杆菌介导的水稻遗传转化通过侵染胚性愈伤组织，以不定芽发生方式获得再生植株，操作简单，不需要昂贵复杂的实验设备，容易实施，转化周期短，所用成熟种子外植体容易获得，从外植体制备到抗性再生植株驯化移栽仅需约3-4个月(Nishimura A et al.,2007,Nat Protoc 1:2796-2802)。遗传转化实验使用的各种基本培养基配方列于表1，主要步骤的操作如下所述：
(1)水稻愈伤组织的诱导：挑取成熟饱满、健康干净的水稻种子，剥去颖壳，置于100毫升无菌玻璃瓶中备用。先用75％乙醇清洗3次，加入等体积的无菌水和浓度为10％的次氯酸钠NaClO，两滴吐温Tween 20，震荡灭菌处理20分钟，用无菌水清洗3-5次，直至将泡沫洗掉。用无菌滤纸吸干种子表面水分，平置于诱导培养基上，在33℃恒温培养箱中暗培养3-4周，直到愈伤组织从胚处长出。
(2)水稻愈伤组织的继代培养：挑选并剥离生长旺盛的健康愈伤组织，置于新的诱导培养基上继代培养1-2周，扩繁并保持愈伤组织的活力。
(3)愈伤组织的侵染：从-80℃低温冰箱中取出携带目标基因编辑载体的农杆菌甘油保存管，取少量农杆菌划线接种于含相应抗生素的固体YEP培养基平板上，28℃暗培养2-3天。挑取单菌落接种5毫升YEP液体培养基，28℃暗培养过夜，取少量菌液提取质粒DNA进行载体特异性PCR检测，确认菌株携带目标载体。同时取部分菌液涂YEP培养基平板培养观察。用于侵染的农杆菌必须无杂菌污染，全平板要求平滑无颗粒状或其他颜色的真菌或霉菌等杂菌产生，以保证所得农杆菌的纯度，并严格执行无菌操作，确保在后续工作中无污染。
在确定农杆菌平板无污染后，直接将菌体刮置于含有25毫升悬浮侵染培养基的100毫升三角瓶中，在25℃的旋转摇床上，以100-120转/分培养2-3小时，取样测OD600值，用悬浮侵染培养基调农杆菌的OD600值为0.1-0.2后用于愈伤组织侵染。挑取小颗粒状健康愈伤组织于250毫升无菌玻璃瓶中，加农杆菌手摇侵染3-5分钟后，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面菌液，置于共培养培养基的滤纸上，共培养培养基上预先放置一层无菌滤纸防止农杆菌生长，28℃暗中共培养3天。
(4)抗性愈伤组织筛选和鉴定：共培养3天后，转移水稻愈伤组织到消毒灭菌的250毫升玻璃瓶中，无菌水清洗数次，直至水澄清透亮，最后用最终浓度约为250毫克/升的羧苄青霉素在100转/分的摇床上浸泡清洗0.5小时。转移愈伤组织到培养皿中，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分，置于无菌操作超净工作台中风干2.5小时后，将愈伤组织分装摆放于筛选培养基上，在33℃恒温培养箱中暗培养3-4周。
筛选培养基中含有400毫克/升羧苄青霉素抑制农杆菌生长，50毫克/升潮霉素筛选转化细胞，非转化细胞在筛选培养基上停止生长并逐渐死亡，培养3-4周后成功转化的细胞会长出抗性愈伤组织。抗性愈伤组织继续长大后适量取样，提取基因组DNA，用转化载体特异的引物进行PCR鉴定，每一个PCR阳性愈伤组织为一个独立转化事件。必要时也可以用目标基因特异性的引物PCR扩增被编辑DNA片段，直接或克隆后测序，分析基因编辑效果。
(5)愈伤组织分化成苗：将PCR鉴定阳性并长大的抗性愈伤组织转移到含有分化培养基的培养瓶中，保持每天16小时光照，28℃培养2-3周后可见分化出绿点，部分绿点约2周后可分化成苗并生长伸长。
(6)生根培养：将高约2-5厘米，形态正常的分化苗移栽到含生根培养基的培养瓶中，每天16小时光照，28℃培养1-2周壮苗，并直到分化出健康根系。
(7)抗性再生植株驯化移栽：当幼苗根系长约3-4厘米且较健壮时，打开培养瓶封口膜并加入少量蒸馏水，炼苗24小时后，小心用镊子将植株夹出，避免损伤茎和根，用清水冲洗根部附着的培养基，移栽至含蛭石营养土的苗盘中，加盖保持湿度，在16/8小时光照的28℃/24℃人工气候室或温室内培养，直到有新叶长出后，移苗到较大花盆中泡水培养，适量施肥，直到开花结实。期间可取样这些T0植株的叶片，提取DNA进行转基因鉴定和基因编辑分析。
表1粳稻农杆菌遗传转化实验使用的基本培养基组成及制备方法
三、抗性植株的转化和基因编辑分子鉴定：
抗性再生植株必须用分子生物学方法检测，确认遗传转化是否成功。常用的简单又可靠的检测方法是PCR扩增。根据转化载体DNA序列设计载体特异的一对或多对DNA引物，采样再生植株叶片，提取少量基因组DNA进行PCR1扩增，能获得特异性扩增片段的植株则为转化阳性，可进一步检测目标基因编辑效果。
目标基因编辑情况常用PCR扩增结合DNA二代测序，特异性荧光定量PCR，PCR结合Surveyor酶切，PCR结合大肠杆菌T7核酸内切酶I酶切等方法进行检测，效率低，费用高，结果可靠性差。本发明设计并实施了PCR扩增结合DNA片段直接测序的快速分析方法，效率高，费用低，简单可靠。根据目标基因DNA序列和预期的Cas9切断点位置，设计PCR2引物覆盖切断位点上、下游各约300bp长度，从再生植株叶片或其它组织来源的DNA扩增长约400-800bp的目标基因片段，纯化后直接用同样的上游或下游引物测序。如果再生植株的DNA片段序列与野生型序列没有差异，则没有基因编辑；如果测得的DNA序列在预期的Cas9切断位点附近出现套峰，则说明所测序的PCR片段为混合模板，再生植株应为杂合编辑；如果再生植株DNA片段与野生型有确定的序列差异，则为纯合基因编辑。上述杂合编辑植株目标基因的PCR片段可以进一步用PCR片段克隆试剂盒克隆后，挑选至少3个克隆用载体特异的引物测序，确认目标基因序列的具体编辑变化。
四、基因编辑植株后代的遗传分离和分子鉴定：
基因编辑育种的突出优点是可以预先选定目标基因进行精准编辑，并且由于目标基因不与进入细胞的转化载体连锁，通过后代的简单遗传分离就可获得不携带任何外源基因的基因编辑后代，是精准的定向突变育种，遗传上与传统的突变育种没有本质区别。水稻通过自花授粉进行繁殖，遗传转化再生的T0植株自然结实产生的T1种子就已经完成遗传分离，如果T0植株的单个目标基因位点被编辑，其T1种子会按照孟德尔遗传分离为1:2:1的纯合编辑、杂合编辑、和非编辑的野生型三种后代。
本发明设计并实施了PCR扩增快速鉴定非转基因纯合编辑后代的方法，效率高，费用低，简单可靠。收获T1种子适时播种萌发，由于涉及到目标基因和插入到基因组的转化载体、即Cas9-gRNA编辑工具两个位点的重组分离，需要播种分析至少16株T1植株。采样叶片，提取DNA进行三次PCR扩增分析。PCR1用转化载体特异的一对DNA引物扩增，能获得特异性扩增片段的植株仍然携带转化载体，可以淘汰；未能获得特异性扩增片段的植株则不携带转化载体，为非转基因分离T1后代，进一步用PCR2分析目标基因编辑情况。PCR2使用位于Cas9切断点上、下游各约300bp的一对引物，获得的PCR扩增片段可直接用同样的上游或下游引物测序，确认目标基因被编辑后的DNA序列变化，未编辑的DNA片段序列与野生型序列没有差异；杂合编辑的DNA片段序列在预期的Cas9切断位点附近会有套峰，片段序列可以经克隆后再测序确定；纯合编辑的DNA片段序列与野生型序列会有缺失、插入、碱基替换等明显差异。
为减少测序数量，也可以预先用PCR3筛选T1植株群体，挑选纯合编辑植株。PCR3使用的一个引物的3’末端必须跨越并终止于Cas9切断点对面1-3bp，另一个引物位于Cas9切断点的上、或下游约300bp，如果目标基因为纯合编辑，两个等位基因的Cas9切断点处均发生DNA缺失或插入等变化，不能和第一个引物配对，不能获得扩增，样品可能为纯合编辑T1后代；如果目标基因为杂合编辑或未编辑，则至少一条同源染色体的Cas9切断点处的序列未发生变化，仍为野生型，因此PCR3可获得扩增，样品为杂合或未编辑T1后代。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)通过优化基因编辑载体设计，分别使用单子叶植物专用高效启动子驱动Cas9和gRNA等表达，构建了独特的基因编辑遗传转化载体，可以一步克隆构建新的基因编辑载体，实现了水稻品种的多基因、多位点的高效基因编辑。
(2)用上述基因编辑遗传转化载体介导的基因编辑方法成功编辑修改了一个主栽粳稻品种的重要内源基因，获得了具不同编辑基因序列的多个独立事件。
(3)通过基因编辑植株的自然结实和遗传分离，结合编辑基因序列的简单快速鉴定分析，获得了稳定遗传的纯合、非转基因、编辑家系，每个编辑家系具有自然界尚不存在的独特基因编辑序列，可以直接成为改良品种，也可以作为具香味的资源材料，通过常规杂交育种用于改良其它水稻品种的食味。
(4)编辑家系的后代植株综合农艺表现正常，与原品种的表现一致，但产生的种子米实现了食味改良，使该粳稻品种增加获得了稻花香品种的特有香味。
附图说明
图1为水稻甜菜碱醛脱氢酶基因和淀粉合成酶基因结构和选择的编辑位点示意图(图中：(a)甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2(LOC_Os08g32870.1)由15个外显子和14个内含子构成。香米品种稻花香在其Badh2基因外显子7中部有8bp缺失。外显子6和7各有一个位点被选用设计OsB2-G3和OsB2-G6 gRNA，各自的上、下游分别设计PCR特异引物OsB2G3-F1和OsB2-R1用于扩增和测序分析编辑区域DNA片段；(b)淀粉合成酶酶基因Waxy(LOC_Os06g04200)由14个外显子和13个内含子构成。外显子6和8各有一个位点被选用设计OsWx1-G3和OsWx1-G4gRNA，各自的上、下游分别设计PCR特异引物OsWx-F5和OsWx-R1用于扩增和测序分析编辑区域DNA片段)。
图2为基因编辑转化载体KF50示意图(图中：ZmU6 pro是玉米U6 snRNA基因启动子；AtU6 term是拟南芥U6 snRNA基因终止子；ZmUBI1 pro是玉米泛素基因启动子；Cas9是酿脓链球菌Streptococcus pyogenes获得性免疫体系CRISPR的核酸内切酶；PsE9 term是豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基E9蛋白基因终止子；CaMV35S pro是花椰菜花叶病毒35S启动子；HygR是潮霉素磷酸转移酶；CaMV35S term是花椰菜花叶病毒35S终止子)。
图3为基因编辑的PCR分析快速检测方法示意图(图中：PCR1分析为Cas9基因特异，检测基因编辑载体在基因组中的整合。PCR2为编辑位点区域特异，扩增的片段用其中的一个引物直接测序，如果在预期的Cas9酶切点处出现重叠序列，该样品就可能是一个编辑事件，克隆测序后可以确定具体编辑情况。PCR3可用于筛选T1后代分离植株，因为其中一个引物位于预期的Cas9酶切点处并与野生型序列匹配，纯合编辑植株将不会产生PCR3产物)。
图4为基因编辑事件R14再生植株的PCR鉴定图(图中：(a)以各事件的再生T0植株叶片基因组DNA为模板，用Cas9基因特异引物Cas9-F1和Cas9-R1通过PCR扩增预期的540bp片段，成功扩增的为转化事件；(b)以同样DNA为模板，用HygR基因特异引物Hyg-F1和Hyg-R1通过PCR扩增预期的402bp片段，成功扩增的为转化事件；(c)以同样DNA为模板，用Badh2(LOC_Os08g32870.1)基因编辑区域特异引物OsB2G3-F1和OsB2-R1通过PCR扩增预期的824bp片段，测序分析DNA序列编辑情况；(d)以同样DNA为模板，用Waxy(LOC_Os06g04200)基因编辑区域特异引物OsWx-F5和OsWx-R1通过PCR扩增预期的916bp片段，测序分析DNA序列编辑情况；标记DNA片段长度分别为2000，1000，750，500，和250bp)。
图5为基因编辑R14家系在Badh2基因目标区域的DNA序列测序图(图中：(a)OsB2-G3位点附近的编辑DNA序列；(b)OsB2-G6位点附近的编辑DNA序列)。
图6为基因编辑R14家系在Waxy基因目标区域的DNA序列测序图(图中：(a)OsWx1-G3位点附近的编辑DNA序列；(b)OsWx1-G4位点附近的编辑DNA序列)。
图7为基因编辑事件R31再生植株的PCR鉴定图(图中：(a)以各事件的再生T0植株叶片基因组DNA为模板，用Cas9基因特异引物Cas9-F1和Cas9-R1通过PCR扩增预期的540bp片段，成功扩增的为转化事件；(b)以同样DNA为模板，用HygR基因特异引物Hyg-F1和Hyg-R1通过PCR扩增预期的402bp片段，成功扩增的为转化事件；(c)以同样DNA为模板，用Badh2(LOC_Os08g32870.1)基因编辑区域特异引物OsB2G3-F1和OsB2-R1通过PCR扩增预期的824bp片段，测序分析DNA序列编辑情况；(d)以同样DNA为模板，用Waxy(LOC_Os06g04200)基因编辑区域特异引物OsWx-F5和OsWx-R1通过PCR扩增预期的916bp片段，测序分析DNA序列编辑情况；标记DNA片段长度分别为2000，1000，750，500，和250bp)。
图8为基因编辑R31家系在Badh2基因目标区域的DNA序列测序图(图中：(a)OsB2-G3位点附近的编辑DNA序列；(b)OsB2-G6位点附近的编辑DNA序列)。
图9为基因编辑R31家系在Waxy基因目标区域的DNA序列测序图(图中：(a)OsWx1-G3位点附近的编辑DNA序列；(b)OsWx1-G4位点附近的编辑DNA序列)。
图10为基因编辑事件R52再生植株的PCR鉴定图(图中：(a)以各事件的再生T0植株叶片基因组DNA为模板，用Cas9基因特异引物Cas9-F1和Cas9-R1通过PCR扩增预期的540bp片段，成功扩增的为转化事件；(b)以同样DNA为模板，用HygR基因特异引物Hyg-F1和Hyg-R1通过PCR扩增预期的402bp片段，成功扩增的为转化事件；(c)以同样DNA为模板，用Badh2(LOC_Os08g32870.1)基因编辑区域特异引物OsB2G3-F1和OsB2-R1通过PCR扩增预期的824bp片段，测序分析DNA序列编辑情况；(d)以同样DNA为模板，用Waxy(LOC_Os06g04200)基因编辑区域特异引物OsWx-F5和OsWx-R1通过PCR扩增预期的916bp片段，测序分析DNA序列编辑情况；标记DNA片段长度分别为2000，1000，750，500，和250bp)。
图11为基因编辑R52家系在Badh2基因目标区域的DNA序列测序图(图中：(a)OsB2-G3位点附近的编辑DNA序列；(b)OsB2-G6位点附近的编辑DNA序列)。
图12为基因编辑R52家系在Waxy基因目标区域的DNA序列测序图(图中：(a)OsWx1-G3位点附近的编辑DNA序列；(b)OsWx1-G4位点附近的编辑DNA序列)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
基因编辑育种的突出优点是可以预先选定目标基因进行编辑。技术原理是利用特异性核酸内切酶将目标基因在设计的位点切断，通过细胞自身的DNA损伤修复系统，将断裂的DNA以非同源末端链接(NHEJ)或同源依赖重组(HDR)两种主要方式修复。
本实施例包括：一、遗传转化编辑载体构建，将特异性核酸内切酶等分子工具构建到转化载体中；二、受体植物的遗传转化，将上述分子工具置于细胞中发挥作用；三、转化再生植株的分子生物学分析，检测目标基因编辑位点的状态，确认基因编辑是否成功；四、基因编辑植株后代的分子生物学分析，确认目标基因的编辑状态，并挑选不携带任何外源DNA、且稳定遗传的非转基因纯合编辑后代。具体的，包括以下步骤：
一、基因编辑转化载体KF50的构建：
基于酿脓链球菌Streptococcus pyogenes获得性免疫系统CRISPR核酸内切酶Cas9的基因编辑已经在多种植物中实现，NHEJ编辑效率常常高达90％，参考基因编辑农杆菌转化载体pHSE401设计(Xing et al.,2014,BMC Plant Biol 14:327)，通过使用单子叶植物专用玉米泛素基因启动子ZmUBI1 pro和一个玉米U6snRNA基因启动子ZmU6 pro，分别用于在水稻和玉米等禾本科植物中高效表达Cas9和gRNA基因，最终形成的基因编辑专用农杆菌转化DNA双元载体由三个基因表达单元ZmU6 pro:gRNA:AtU6-26 term，ZmUBI1 pro:SpCas9:PsE9 term，和35S pro:HygR:35S term组成，ZmU6 pro和gRNA之间留有BsaI酶切位点，可将载体线性化后用DNA连接酶或Gibson克隆方法将任何gRNA序列插入(李忠森等，中国专利申请号202010675272.7)。
水稻甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2(LOC_Os08g32870.1)的结构比较复杂(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，长6268bp(SEQ ID NO：1)，由15个外显子和14个内含子组成(图1a)，预期的编码序列长1509bp(SEQ ID NO：2)，编码含502氨基酸长的甜菜碱醛脱氢酶BADH2(SEQ ID NO：3)。中国著名的黑龙江五常优质香米稻花香的特殊香味是由第7个外显子8个碱基GATTATGG的缺失突变造就的。淀粉合成酶Waxy基因LOC_Os06g04200(SEQ ID NO：4)比较复杂，由14个外显子和13个内含子组成(图1b)，总长5035bp，蛋白编码序列长1830bp(SEQ ID NO：5)始于第二个外显子，编码609aa长的酶蛋白(SEQ ID NO：6)。为了用基因编辑方法通过定点突变Badh2和Waxy基因，分别敲除甜菜碱醛脱氢酶和淀粉合成酶功能，挑选Badh2和Waxy基因的不同外显子区域多个SpCas9可识别位点设计了gRNA，多个gRNA通过tRNA技术交互连接，用Gibson克隆方法插入到上述基因编辑专用农杆菌转化DNA双元载体的ZmU6启动子和gRNA骨架之间的BsaI酶切位点，由同一个ZmU6启动子同步表达。
设计的Badh2基因的OsB2-G3和OsB2-G6两个gRNA(SEQ ID NO：11，12)和Waxy基因的OsWx1-G3和OsWx1-G4两个gRNA(SEQ ID NO：13，14)与tRNA和gRNA骨架交互排列为tRNA-OsB2-G3-gRNA-tRNA-OsB2-G6-gRNA-tRNA-OsWx1-G3-gRNA-tRNA-Os Wx1-G4片段(SEQ IDNO：10)，并且两端分别有20bp额外序列与基因编辑载体KF50(SEQ ID NO：7)ZmU6启动子3’末端和gRNA骨架的5’末端序列同源，人工合成SEQ ID NO：10片段后，用NEBuilder克隆方法(New England Biolabs)，插入到ZmU6 pro和gRNA骨架之间，构建成为基因编辑载体KF50(图2)。用ZmU6-F2引物(SEQ ID NO：15)测序确认无误后，转入水稻转化用农杆菌菌株EHA105，于-80℃冰箱保存备用。图2中ZmU6启动子和ZmUBI1启动子的核苷酸序列分别如SEQID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
二、粳稻品种的遗传转化：
基因编辑必须通过将基因编辑载体转化入细胞内表达后才能实现，利用农杆菌介导方法，以垦丰种业自主粳稻品种龙垦201的健康成熟种子为外植体，将基因编辑载体KF50转化入细胞对Badh2和Waxy两个基因的各两个位点的DNA序列进行精准修改，遗传转化实验使用的各种基本培养基配方列于表1，具体操作流程如下：
(1)水稻愈伤组织的诱导：每个转化实验挑取约200粒成熟饱满、健康干净的水稻种子，剥去颖壳，置于100毫升无菌玻璃瓶中用75％乙醇清洗3次，加入等体积的无菌水和浓度为10％的次氯酸钠NaClO，两滴吐温Tween 20，震荡灭菌处理20分钟，用无菌水清洗3-5次，直至将泡沫洗掉。用无菌滤纸吸干种子表面水分，平置于诱导培养基上，在33℃恒温培养箱中暗培养3-4周，直到愈伤组织从胚处长出。
(2)水稻愈伤组织的继代培养：挑选剥离生长旺盛的健康愈伤组织，置于新的诱导培养基上继代培养1-2周，扩繁并保持愈伤组织的活力。
(3)愈伤组织的侵染：从-80℃低温冰箱中取出携带目标基因载体的农杆菌甘油保存管，取少量农杆菌划线接种于含50毫克/升卡那霉素的固体YEP培养基平板上，28℃暗培养2-3天。挑取单菌落接种5毫升YEP液体培养基28℃暗培养过夜，取少量菌液提取质粒DNA进行载体特异性PCR检测，确认菌株携带目标基因载体。同时取部分菌液涂YEP培养基平板培养观察(剩余培养基可在-80℃中暂时保存以备之后直接利用)。用于侵染的农杆菌必须无杂菌污染，全平板要求平滑无颗粒状或其他颜色的真菌或霉菌等杂菌产生，以保证所得农杆菌的纯度，并严格无菌操作确保在后续工作中无污染。
在确定农杆菌平板无污染后，直接将菌体刮置于含有25毫升悬浮侵染培养基的100毫升三角瓶中，在25℃的旋转摇床上，以100-120转/分培养2-3小时，取样测OD600值，用悬浮侵染培养基调农杆菌的OD600值为0.1-0.2后用于愈伤组织侵染。挑取小颗粒状健康愈伤组织于250毫升无菌玻璃瓶中，加农杆菌手摇侵染3-5分钟后，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面菌液，置于共培养培养基表面的滤纸上，共培养培养基上事先放置一无菌滤纸防止农杆菌生长，28℃暗中共培养3天。
(4)抗性愈伤组织筛选和鉴定：共培养3天后，转移水稻愈伤组织到消毒灭菌的250毫升玻璃瓶中，无菌水清洗数次，直至水澄清透亮，最后用最终浓度约为250毫克/升的羧苄青霉素在100转/分的摇床上浸泡清洗0.5小时。转移愈伤组织到培养皿中，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分，置于无菌操作超净工作台中风干2.5小时后，将愈伤组织分装摆放于筛选培养基上，在33℃恒温培养箱中暗培养3-4周。
筛选培养基中含有400毫克/升羧苄青霉素抑制农杆菌生长，50毫克/升潮霉素筛选转化细胞，非转化细胞在筛选培养基上停止生长并逐渐死亡，培养3-4周后成功转化的细胞会长出抗性愈伤组织。抗性愈伤组织继续长大后适量取样，提取基因组DNA，用转化载体特异的引物进行PCR鉴定，每一个PCR阳性愈伤组织为一个独立转化事件。必要时也可以用目标基因特异的引物PCR扩增被编辑DNA片段，直接或克隆后测序，分析基因编辑效果。
(5)愈伤组织分化成苗：将PCR鉴定阳性并长大的抗性愈伤组织转移到含有分化培养基的培养瓶中，保持每天16小时光照，28℃培养2-3周后可见分化出绿点，部分绿点约2周后可分化成苗并生长伸长。
(6)生根培养：将高约2-5厘米，形态正常的分化苗移栽到含生根培养基的培养瓶中，每天16小时光照，28℃培养1-2周壮苗，并直到分化出健康根系。
(7)抗性再生植株驯化移栽：当幼苗根系长约3-4厘米且较健壮时，打开培养瓶封口膜并加入少量蒸馏水，炼苗24小时后，小心用镊子将植株夹出，避免损伤茎和根，用清水冲洗根部附着的培养基，移栽至含蛭石营养土的苗盘中，加盖保持湿度，在16/8小时光照的28℃/24℃人工气候室或温室内培养，直到有新叶长出后，移苗到较大花盆中泡水培养，适量施肥，直到开花结实。期间可取样这些T0植株的叶片，提取DNA进行转基因鉴定和基因编辑分析。
所转化的粳稻品种容易产生愈伤组织，生长旺盛，分化再生能力强，转化效率较高，适宜农杆菌转化。基因编辑载体侵染后经约3-4周筛选获得了抗性愈伤组织，直接转移到分化培养基3-4周之后分化产生T0再生植株，移栽土壤成活后取样进行PCR分析，鉴定多数为真实转化事件，目标基因片段测序分析确认其中部分事件实现了基因编辑，遗传转化效率和基因编辑效率总结于表2。
表2粳稻品系R14的遗传转化和基因编辑效率
三、转化事件的基因编辑鉴定：
抗性再生植株必须用分子生物学方法检测，确认遗传转化是否成功。常用的简单又可靠的检测方法是PCR扩增。根据转化载体DNA序列设计载体特异的一对或多对DNA引物，采样再生植株叶片，提取少量基因组DNA进行PCR1扩增(图3)，能获得特异性扩增片段的植株则为转化阳性，可进一步检测目标基因编辑效果。本发明设计并实施了PCR扩增结合DNA片段直接测序的快速分析方法，效率高，费用低，简单可靠。根据目标基因DNA序列和预期的Cas9切断点位置，设计PCR2引物覆盖切断位点上、下游各约300bp长度(图3)，从再生植株叶片或其它组织来源的DNA扩增长约400-800bp的目标基因片段，纯化后直接用同样的上游或下游引物测序。如果再生植株的DNA片段序列与野生型序列没有差异，则没有基因编辑；如果测得的DNA序列在预期的Cas9切断位点附近出现套峰，则说明所测序的PCR片段为混合模板，再生植株应为杂合编辑；如果再生植株DNA片段与野生型有确定的序列差异，则为纯合基因编辑。上述杂合编辑植株目标基因的PCR片段可以进一步用PCR片段克隆试剂盒克隆后，挑选至少3个克隆用载体特异的引物测序，确认目标基因序列的具体编辑变化。
取样水稻抗性愈伤组织，或再生的T0植株叶片，用一个基于SDS(Sodium dodecylsulphate)的DNA快速提取方法提取基因组DNA，进行Cas9基因特异的PCR检测鉴定转化事件。PCR反应体系采用Quick Taq HSDyeMix(DTM-101)试剂盒(TOYOBO Life Science)，20微升的PCR反应体系包含:10μl 2x Quick Taq HSDyeMix,1.0μl 10pmol/μl引物Cas9-F1(SEQID NO：16)和1.0μl 10pmol/μl引物Cas9-R1(SEQ ID NO：17)，6.0μl无菌水,最后加2.0μl50ng/μl样品的基因组DNA。PCR反应条件为95℃变性5分钟，然后95℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟，并在4℃保持。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，成功扩增了Cas9基因特异的540bp长片段(SEQ ID NO：24)的样品判定为转基因阳性。也可以用载体抗潮霉素基因HygR特异的引物Hyg-F1和Hyg-R1(SEQ IDNO：18，19)进行类似PCR分析，成功扩增了HygR基因特异的402bp长片段(SEQ ID NO：25)的样品判定为转基因阳性。
通过类似的PCR扩增方法并使用甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2(LOC_Os08g32870.1)特异引物OsB2G3-F1和OsB2-R1(SEQ ID NO：20，21)，可以从Cas9阳性样品扩增获得OsB2-G3和OsB2-G6基因编辑位点附近824bp长的目标片段(SEQ ID NO：26)。使用OsB2G3-F1或OsB2-R1引物单向直接测序这些PCR片段，如果在预期的OsB2-G3和OsB2-G4编辑位点附近存在套峰，甚至导致了下游DNA不能准确测序，则判断该位点发生了DNA序列编辑。将发生编辑的样品的PCR片段TOPO克隆到pCR2.1载体(Thermo Fisher Scientific)，每个样品送3个克隆测序，就可以准确分析具体的DNA编辑序列变化。DNA序列的比对分析，DNA载体、PCR引物、及CRISPR gRNA设计等均使用DNA分析软件Geneious Prime完成(Biomatters Ltd.)。
通过类似的PCR扩增方法并使用淀粉合成酶基因Waxy(LOC_Os06g04200.3)特异引物OsWx-F5和OsWx-R1(SEQ ID NO：22，23)，可以从Cas9阳性样品扩增获得OsWx-G3和OsWx-G4基因编辑位点附近916bp长的目标片段(SEQ ID NO：27)。使用OsWx-F5和OsWx-R1引物单向直接测序这些PCR片段，如果在预期的OsWx-G3和OsWx-G4编辑位点附近存在套峰，甚至导致了下游DNA不能准确测序，则判断该位点发生了DNA序列编辑。将发生编辑的样品的PCR片段TOPO克隆到pCR2.1载体(Thermo Fisher Scientific)，每个样品送3个克隆测序，就可以准确分析具体的DNA编辑序列变化。
四、基因编辑事件后代植株的筛选：
实现基因编辑的T0植株移栽到温室中培养成熟，收获T1代种子后适时在温室内播种，幼苗长出约三片叶大小时，取少量叶片样品提取基因组DNA，进行详细的PCR检测和目标基因测序分析(图4)。因为水稻自交授粉遵循孟德尔遗传分离，转化的基因编辑载体Cas9基因等和被编辑Badh2基因因位于不同染色体而各自独立分离，部分T1植株将不再含有任何编辑载体DNA，为非转基因后代，其中部分植株的Badh2基因保持编辑状态，如果为纯合编辑，则在T1代即可获得纯合稳定的非转基因编辑植株，收获T2代种子后即可扩大分析鉴定实验。如果未获得非转基因纯合编辑植株，则需要在温室中种植杂合编辑植株的T2代种子再进行自然遗传分离，通过类似分析甄选非转基因纯合编辑的T2代植株。
分离的T1或T2后代植株首先用上述同样的Cas9及HygR基因特异引物进行PCR扩增，检查植株是否仍然携带基因编辑载体片段，挑选不能扩增的非转基因后代植株(图4a，b)，说明图4中分析的编辑家系T2后代均为非转基因植株。最后用前述同样的Badh2基因特异引物扩增基因编辑区域824bp长的目标片段(图4c)，使用OsB2G3-F1引物直接单向测序分析，结果与Badh2基因的824bp长的野生型序列比对(SEQ ID NO：26)，确认Badh2基因编辑状况。用前述同样的Waxy基因特异引物扩增基因编辑区域916bp长的目标片段(图4d)，使用OsWx-F5引物直接单向测序分析，结果与Waxy基因的916bp长的野生型序列比对(SEQ IDNO：27)，确认Waxy基因编辑状况。
综合上述PCR扩增和目标基因编辑区域DNA片段测序分析结果，共筛选获得了龙垦201品种Badh2和Waxy基因均编辑了的10个独特、非转基因、纯合编辑植株家系，分别命名为R14-1，R14-2，R14-3，R14-4，R14-5，R14-6，R14-7，R14-8，R14-9，和R14-10。用野生型Badh2基因的824bp片段(SEQ ID NO：26)与代表各个家系的编辑Badh2对应PCR片段进行了序列对比(SEQ ID NO：28-37)，差异序列只发生在预期的OsB2-G3和OsB2-G6编辑位点(图5)，即均为CRISPR-Cas9介导的特异基因编辑。用野生型Waxy基因的916bp片段(SEQ ID NO：27)与代表各个家系的编辑Waxy对应PCR片段进行了序列对比(SEQ ID NO：38-47)，差异序列只发生在预期的OsWx1-G3和OsWx1-G4编辑位点(图6)，即均为CRISPR-Cas9介导的特异基因编辑。各个家系在OsB2-G3和OsB2-G6位点及在OsWx1-G3和OsWx1-G4位点的编辑结果总结于表3，因为这些DNA序列编辑发生在外显子的蛋白质编码区域，造成了Badh2或Waxy基因的移码突变，有效的敲除了被编辑水稻品种的甜菜碱醛脱氢酶或淀粉合成酶功能。
表3粳稻品系R14基因编辑家系的目标基因序列变化
上述各个基因编辑家系尚未存在于自然界，是通过基因编辑方法创制的新颖种质资源材料，可以直接作为具香味和糯性淀粉的的改良品系进行进一步的综合性状评估，也可以作为具香味和糯性的特殊材料用于其它水稻品种食味的常规育种改良。根据各个家系独特的Badh2和Waxy基因片段编辑序列可以设计专用引物，开发特异性PCR标记，用以鉴别追踪各个编辑家系的后代植株。
实施例2
一、基因编辑转化载体的构建：
采用与实例1中基因编辑转化载体的构建部分描述的同一个KF50作为基因编辑转化载体，对垦丰种业自主水稻品种龙垦290进行基因编辑改良，增加香味和糯性品质性状。
二、粳稻的遗传转化：
采用与实例1中描述的籼稻遗传转化方法，用基因编辑转化载体KF50转化垦丰种业自主水稻品种龙垦290，所转化的粳稻品种容易产生愈伤组织，分化再生能力强，转化效率较高，适宜农杆菌转化。基因编辑载体侵染后经约3-4周筛选获得了抗性愈伤组织，直接转移到分化培养基3-4周之后分化产生T0再生植株，移栽土壤成活后取样进行PCR分析，鉴定转化和基因编辑事件。
三、转化事件的基因编辑鉴定：
采用与实例1中描述的转化事件的基因编辑鉴定方法，对上述转化事件的再生植株进行多个基因特异性PCR分析和编辑目标基因片段的测序分析，确认多数转化事件的再生植株为真实转化事件，其中的大多数在编辑目标基因的预期位点发生了特异性基因编辑，遗传转化和基因编辑效率总结于表4。
表4粳稻品系R31的遗传转化和基因编辑效率
四、基因编辑事件后代植株的筛选：
因为水稻自交授粉遵循孟德尔遗传分离，转化的基因编辑载体Cas9基因等和被编辑Badh2或Waxy基因因位于不同染色体而各自独立分离，部分T1植株将不再含有任何编辑载体DNA，为非转基因后代，其中部分植株的Badh2或Waxy基因保持编辑状态，如果为纯合编辑，则在T1代即可获得纯合稳定的非转基因编辑植株，收获T2代种子后即可扩大分析鉴定实验。采用与实例1中描述的基因编辑事件后代植株的筛选方法，对龙垦290基因编辑的后代植株进行分析筛选，通过自然遗传分离获得非转基因、纯合编辑后代植株(图7)。
分离的T1或T2后代植株首先用上述同样的Cas9及HygR基因特异引物进行PCR扩增，检查植株是否仍然携带基因编辑载体片段，挑选不能扩增的非转基因后代植株(图7a，b)，说明图7中分析的编辑家系T2后代均为非转基因植株。最后用前述同样的Badh2基因特异引物扩增基因编辑区域824bp长的目标片段(图7c)，使用OsB2G3-F1引物直接单向测序分析，结果与Badh2基因的824bp长的野生型序列比对(SEQ ID NO：26)，确认Badh2基因编辑状况。用前述同样的Waxy基因特异引物扩增基因编辑区域916bp长的目标片段(图7d)，使用OsWx-F5引物直接单向测序分析，结果与Waxy基因的916bp长的野生型序列比对(SEQ IDNO：27)，确认Waxy基因编辑状况。
综合PCR扩增和目标基因编辑区域DNA片段测序分析结果，共筛选获得了龙垦290品种8个独立的、Badh2和Waxy基因同时获得纯合编辑的、非转基因植株家系，分别命名为R31-1，R31-2，R31-3，R31-4，R31-5，R31-6，R31-7，和R31-8。用野生型Badh2基因的824bp片段(SEQ ID NO：26)与代表各个家系的编辑Badh2对应PCR片段进行了序列对比(SEQ ID NO：48-55)，差异序列只发生在预期的OsB2-G3和OsB2-G6编辑位点(图8)，即均为CRISPR-Cas9介导的特异基因编辑。用野生型Waxy基因的916bp片段(SEQ ID NO：27)与代表各个家系的编辑Waxy对应PCR片段进行了序列对比(SEQ ID NO：56-63)，差异序列只发生在预期的OsWx1-G3和OsWx1-G4编辑位点(图9)，即均为CRISPR-Cas9介导的特异基因编辑。各个家系在香味控制基因OsB2-G3和OsB2-G6位点、及糯性淀粉控制基因OsWx1-G3和OsWx1-G4位点的编辑结果总结于表5，因为这些DNA序列编辑均发生在各自相应基因的外显子蛋白质编码区域，造成了Badh2和Waxy基因的移码突变，有效的同步敲除了被编辑水稻品种的甜菜碱醛脱氢酶和淀粉合成酶基因功能。
表5粳稻品系R31基因编辑家系的目标基因序列变化
上述各个基因编辑家系尚未存在于自然界，是通过基因编辑方法创制的新颖种质资源材料，可以直接作为具香味和糯性淀粉的的改良品系进行进一步的综合性状评估，也可以作为具香味和糯性的特殊材料用于其它水稻品种食味的常规育种改良。根据各个家系独特的Badh2和Waxy基因片段编辑序列可以设计专用引物，开发特异性PCR标记，用以鉴别追踪各个编辑家系的后代植株。
实施例3
一、基因编辑转化载体的构建：
采用与实例1中基因编辑转化载体的构建部分描述的同一个KF50作为基因编辑转化载体，对垦丰种业自主水稻品种垦稻32进行基因编辑改良，增加香味和糯性品质性状。
二、粳稻的遗传转化：
采用与实例1中描述的籼稻遗传转化方法，用基因编辑转化载体KF50转化垦丰种业自主水稻品种垦稻32，所转化的粳稻品种容易产生愈伤组织，分化再生能力强，转化效率较高，适宜农杆菌转化。基因编辑载体侵染后经约3-4周筛选获得了抗性愈伤组织，直接转移到分化培养基3-4周之后分化产生T0再生植株，移栽土壤成活后取样进行PCR分析，鉴定转化和基因编辑事件。
三、转化事件的基因编辑鉴定：
采用与实例1中描述的转化事件的基因编辑鉴定方法，对上述转化事件的再生植株进行多个基因特异性PCR分析和编辑目标基因片段的测序分析，确认多数转化事件的再生植株为真实转化事件，其中的大多数在编辑目标基因的预期位点发生了特异性基因编辑，遗传转化和基因编辑效率总结于表6。
表6粳稻品系R52的遗传转化和基因编辑效率
四、基因编辑事件后代植株的筛选：
因为水稻自交授粉遵循孟德尔遗传分离，转化的基因编辑载体Cas9基因等和被编辑Badh2或Waxy基因因位于不同染色体而各自独立分离，部分T1植株将不再含有任何编辑载体DNA，为非转基因后代，其中部分植株的Badh2或Waxy基因保持编辑状态，如果为纯合编辑，则在T1代即可获得纯合稳定的非转基因编辑植株，收获T2代种子后即可扩大分析鉴定实验。采用与实例1中描述的基因编辑事件后代植株的筛选，对垦稻32基因编辑的后代植株进行分析筛选，通过自然遗传分离获得非转基因、纯合编辑后代植株(图10)。
分离的T1或T2后代植株首先用上述同样的Cas9及HygR基因特异引物进行PCR扩增，检查植株是否仍然携带基因编辑载体片段，挑选不能扩增的非转基因后代植株(图10a，b)，说明图10中分析的编辑家系T2后代均为非转基因植株。最后用前述同样的Badh2基因特异引物扩增基因编辑区域824bp长的目标片段(图10c)，使用OsB2G3-F1引物直接单向测序分析，结果与Badh2基因的824bp长的野生型序列比对(SEQ ID NO：26)，确认Badh2基因编辑状况。用前述同样的Waxy基因特异引物扩增基因编辑区域916bp长的目标片段(图10d)，使用OsWx-F5引物直接单向测序分析，结果与Waxy基因的916bp长的野生型序列比对(SEQ IDNO：27)，确认Waxy基因编辑状况。
综合PCR扩增和目标基因编辑区域DNA片段测序分析结果，共筛选获得了垦稻32品种5个独立的、Badh2和Waxy基因同时获得纯合编辑的、非转基因植株家系，分别重新命名为R52-1，R52-2，R52-3，R52-4，和R52-5。用野生型Badh2基因的824bp片段(SEQ ID NO：26)与代表各个家系的编辑Badh2对应PCR片段进行了序列对比(SEQ ID NO：64-68)，差异序列只发生在预期的OsB2-G3和OsB2-G6编辑位点(图11)，即均为CRISPR-Cas9介导的特异基因编辑。用野生型Waxy基因的916bp片段(SEQ ID NO：27)与代表各个家系的编辑Waxy对应PCR片段进行了序列对比(SEQ ID NO：65-73)，差异序列只发生在预期的OsWx1-G3和OsWx1-G4编辑位点(图12)，即均为CRISPR-Cas9介导的特异基因编辑。各个家系在香味控制基因OsB2-G3和OsB2-G6位点、及糯性淀粉控制基因OsWx1-G3和OsWx1-G4位点的编辑结果总结于表7，因为这些DNA序列编辑均发生在各自相应基因的外显子蛋白质编码区域，造成了Badh2和Waxy基因的移码突变，有效的同步敲除了被编辑水稻品种的甜菜碱醛脱氢酶和淀粉合成酶基因功能。
表7粳稻品系R52基因编辑家系的目标基因序列变化
上述各个基因编辑家系尚未存在于自然界，是通过基因编辑方法创制的新颖种质资源材料，可以直接作为具香味和糯性淀粉的的改良品系进行进一步的综合性状评估，也可以作为具香味和糯性的特殊材料用于其它水稻品种食味的常规育种改良。根据各个家系独特的Badh2和Waxy基因片段编辑序列可以设计专用引物，开发特异性PCR标记，用以鉴别追踪各个编辑家系的后代植株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
本发明中DNA序列说明：
SEQ ID NO 1:Oryza sativa Japonica OsBadh2 gene LOC_Os08g32870.16268bp；
SEQ ID NO 2:Oryza sativa Japonica OsBadh2 gene LOC_Os08g32870.1 CDS1509bp；
SEQ ID NO 3:Oryza sativa Japonica OsBadh2 gene LOC_Os08g32870.1protein 502aa；
SEQ ID NO 4:Oryza sativa Japonica Waxy gene LOC_Os06g04200 5035bp；
SEQ ID NO 5:Oryza sativa Japonica Waxy gene LOC_Os06g04200 CDS1830bp；
SEQ ID NO 6:Oryza sativa Japonica Waxy gene LOC_Os06g04200 protein609aa；
SEQ ID NO 7:KF50 18530bp；
SEQ ID NO 8:ZmU6 promoter 859bp；
SEQ ID NO 9:ZmUBI1 promoter 1976bp；
SEQ ID NO 10:synthesized OsB2-G3-OsB2-G6-OsWx1-G3-OsWx1-G4 gRNAfragment 670bp；
SEQ ID NO 11:OsB2-G3 gRNA 20bp；
SEQ ID NO 12:OsB2-G6 gRNA 20bp；
SEQ ID NO 13:OsWx-G3 gRNA 20bp；
SEQ ID NO 14:OsWx-G4 gRNA20bp；
SEQ ID NO 15:ZmU6-F2 oligo 22bp；
SEQ ID NO 16:Cas9-F1 oligo 24bp；
SEQ ID NO 17:Cas9-R1 oligo 20bp；
SEQ ID NO 18:Hyg-F1 oligo 22bp；
SEQ ID NO 19:Hyg-R1 oligo 22bp；
SEQ ID NO 20:OsB2G3-F1 oligo 25bp；
SEQ ID NO 21:OsB2-R1 oligo 22bp；
SEQ ID NO 22:OsWx-F5 oligo 22bp；
SEQ ID NO 23:OsWx-R1 oligo 22bp；
SEQ ID NO 24:Cas9 PCR fragment 540 bp；
SEQ ID NO 25:HygR PCR fragment 402 bp；
SEQ ID NO 26:Oryza sativa Japonica Badh2 gene LOC_Os08g32870.1PCRfragment 824 bp；
SEQ ID NO 27:Oryza sativa Japonica Waxy gene LOC_Os06g04200PCRfragment 916 bp；
SEQ ID NO 28:R14-1 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 817 bp；
SEQ ID NO 29:R14-2 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 784 bp；
SEQ ID NO 30:R14-3 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 821 bp；
SEQ ID NO 31:R14-4 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 823 bp；
SEQ ID NO 32:R14-5 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 820 bp；
SEQ ID NO 33:R14-6 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 818 bp；
SEQ ID NO 34:R14-7 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 669 bp；
SEQ ID NO 35:R14-8 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 822 bp；
SEQ ID NO 36:R14-9 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 819 bp；
SEQ ID NO 37:R14-10 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 818 bp；
SEQ ID NO 38:R14-1 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment915 bp；
SEQ ID NO 39:R14-2 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment879 bp；
SEQ ID NO 40:R14-3 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment910 bp；
SEQ ID NO 41:R14-4 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment938 bp；
SEQ ID NO 42:R14-5 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment919 bp；
SEQ ID NO 43:R14-6 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment899 bp；
SEQ ID NO 44:R14-7 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment889 bp；
SEQ ID NO 45:R14-8 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment911 bp；
SEQ ID NO 46:R14-9 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment915 bp；
SEQ ID NO 47:R14-10 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment915 bp；
SEQ ID NO 48:R31-1 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 820 bp；
SEQ ID NO 49:R31-2 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 798 bp；
SEQ ID NO 50:R31-3 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 821 bp；
SEQ ID NO 51:R31-4 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 824 bp；
SEQ ID NO 52:R31-5 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 793 bp；
SEQ ID NO 53:R31-6 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 819 bp；
SEQ ID NO 54:R31-7 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 790 bp；
SEQ ID NO 55:R31-8 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 genePCRfragment 825 bp；
SEQ ID NO 56:R31-1 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment912 bp；
SEQ ID NO 57:R31-2 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment912 bp；
SEQ ID NO 58:R31-3 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment911 bp；
SEQ ID NO 59:R31-4 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCRfragment903 bp；
SEQ ID NO 60:R31-5 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment916bp；
SEQ ID NO 61:R31-6 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment604bp；
SEQ ID NO 62:R31-7 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment915bp；
SEQ ID NO 63:R31-8 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment912bp；
SEQ ID NO 64:R52-1 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 gene PCRfragment 821bp；
SEQ ID NO 65:R52-2 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 gene PCRfragment 784bp；
SEQ ID NO 66:R52-3 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 gene PCRfragment 822bp；
SEQ ID NO 67:R52-4 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 gene PCRfragment 819bp；
SEQ ID NO 68:R52-5 edited event Badh2 gene LOC_Os08g32870.1 gene PCRfragment 823bp；
SEQ ID NO 69:R52-1 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment914bp；
SEQ ID NO 70:R52-2 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment908bp；
SEQ ID NO 71:R52-3 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment879bp；
SEQ ID NO 72:R52-4 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment845bp；
SEQ ID NO 73:R52-5 edited event Waxy gene LOC_Os06g04200 PCR fragment903bp。
参考文献：
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序列表
<110> 北大荒垦丰种业股份有限公司
<120> 水稻品质性状基因的基因编辑及应用
<160> 73
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6268
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accaccgcgc ccgcgccgca aggcagcaca gaacagagca ctccctctcc caccaccact 60
ccacacctga caccacgcgg gctgcctcca tcgtcatcga tccatctccg tatctctcac 120
cgaccccaaa tcgcacagct ccagctcctc ctcgatcccc gtcgcgatcg gcgagatggc 180
cacggcgatc ccgcagcggc agctcttcgt cgccggcgag tggcgcgccc ccgcgctcgg 240
ccgccgcctc cccgtcgtca accccgccac cgagtccccc atcggtaccc tcctcttcac 300
cctctccacc ctctgcttct gcctctgatt agcctttttg ttgttgttgt tgttgctgct 360
gttttttgcg tgtcggtgcg caggcgagat cccggcgggc acggcggagg acgtggacgc 420
ggcggtggcg gcggcgcggg aggcgctgaa gaggaaccgg ggccgcgact gggcgcgcgc 480
gccgggcgcc gtccgggcca agtacctccg cgcaatcgcg gccaaggtag ggtggtgact 540
acccccaccc cccccccccc ccccaacgcg acccgcgtgc gtgtgttccg tacaggggga 600
ggagctccgc gtggctctcc agtaggtttt tgagccccaa atcgatcgat atgctctagt 660
tttaagtttg ctgcttaaat tcctcaaggg tttagtttgc aaccaaatcc ttattttagc 720
ttcggtataa gccccccata tgatgtgcgt gcgtcggcat cggaagtgcg tatcctctgt 780
tctggactag gaattggcca taggttgatc gacagttcga gtattctgct tctgtttgga 840
ataagttgga agcatggctg attgtgtatc tggatgctgt ttttgtggtg attcgtttca 900
agctcttgtt aattgatggg ttcaagcgga gagggtgcgc aacaacaagt gtatatggct 960
cacggccatg ggtgtgcaca tttgattggt gcgcaacaac aagtgtatat tgtttgtgtg 1020
cttcgttagt tggcaggtcc tagtcactaa atcactattg gattggtact agttactttt 1080
gtgccttgac gatgggactg gattactagc cttttggttg cctttgtggt attccgttgt 1140
tatgggcctg ttgatggatg gatcccttta atttctagtg ccaaatgcat gctagatttc 1200
tcacagtttt tctcttcagg ttatatttct cgtatttcct tttcctaaag gattgctttt 1260
tcatgtattt tctggcatat ataggttatt attattatta ttctccagaa caagattacc 1320
catattatgg atcactagtg tacacttttt tggatgaaaa acctacttac tgaaagtaaa 1380
acagtgacca gtgcacactt tacttgaact gtcaaaccat caattttcta gcaaagcagg 1440
ggatgctagc cttccagtct aaatgacagt aaactactat acttttgtcc gtaggtttgg 1500
aaatatgcta atttctatca taaaaatttt catggcatat gcgagcattt tatgatcacc 1560
ttttcccttt ttcttcagat aatcgagagg aaatctgagc tggctagact agagacgctt 1620
gattgtggga agcctcttga tgaagcagca tgggacatgg tatgtggcca gttatccact 1680
gtatgaatat gtagttgcct acacagcaat ctttcctgaa catgaatcct gatgtatgat 1740
attccatttg tcaggacgat gttgctggat gctttgagta ctttgcagat cttgcagaat 1800
ccttggacaa aaggcaaaat gcacctgtct ctcttccaat ggaaaacttt aaatgctatc 1860
ttcggaaaga gcctatcggt gtagttgggt tgatcacacc ttggtatttc acatttttct 1920
ctcatcctgc gcttatattt atttatgacc caagcatggt actaaatagt actagtaaca 1980
tgcatatact gaatgagttt acaactttac atgatttttt tgaactatga aagttgaaga 2040
catttgagat tttattcctc ttctcttgtg caaacatatt attgtctcac aaattgtacc 2100
tagcagctac tctctccgtt tcatattata agtcgtttga cttttttcct agtcaaaatg 2160
tgttaagttt gaccaagttt atagaaaaat ttagcaacat ctaaaatatc aaagtcatgt 2220
tttagtgttt tttcaggctc tcatgtaagc aattttgatg tgccctctcc tttcttctta 2280
atataatgat acacagctct tgtgtattca aaggaaaata tatatatata taatgataca 2340
cacctctcct ccgtgttaat gcagctcatt tgttctgtcc cggttcaaat atctattttt 2400
ctcatatgtt gtcagcatga ttcacttaat ttagtatata gaagatgcca ttatttatgt 2460
ctggaatctt actgcagaag ggaaaacaat tgataacgga attgattgca ttctaatttg 2520
ttgtttcttt gttatgttct tatcgacaat tacaaatttg attctgagaa tcatgttcgg 2580
gatgtgtatt tctactgcag gaactatcct ctcctgatgg caacatggaa ggtagctcct 2640
gccctggctg ctggctgtac agctgtacta aaaccatctg aattggcttc cgtgtaagtt 2700
taacatgtta acttgttaat gtcataccca tgctagttgc aatgacattt gattttaaaa 2760
tgttgtggca tgtccatgct gcaagcaatg taatttgaaa tctctctcta tcattaatta 2820
ccaggacttg tttggagctt gctgatgtgt gtaaagaggt tggtcttcct tcaggtgtgc 2880
taaacatagt gactggatta ggttctgaag ccggtgctcc tttgtcatca caccctggtg 2940
tagacaaggt acagctattc ctcctgtaat catgtatacc ccatcaatgg aaatgatatt 3000
cctctcaata catggtttat gttttctgtt aggttgcatt tactgggagt tatgaaactg 3060
gtaaaaagat tatggcttca gctgctccta tggttaaggt ttgtttccaa atttctgtgg 3120
atattttttg ttctctttct actaactctc tattatcaat tctcaatgtt gtccttttct 3180
tttaactcct ttacttttta gaattgtgat caagacactt tgagcatcat tctagtagcc 3240
agttctatcc tgtttcttac ctttttatgg ttcgtctttt cttgacagcc tgtttcactg 3300
gaacttggtg gaaaaagtcc tatagtggtg tttgatgatg ttgatgttga aaaaggtaca 3360
tgccacttgc tatgattaac taattctgaa gtgcgggact ttgtaaagca cttaactgag 3420
ctggatgcta gacccccaaa agcccttttt ggtgtcttgg gcttgttgca gaaatactgg 3480
tcccagacga gcaggatgca agaaaattaa ctacttttgc cactgattag tatttcttag 3540
aagttacacc tcaaggatta gcaatacttt cttaaaatgt gctattgatt aaaaagatgt 3600
cctgtattat tttgagcaga tcttgtactg gttgatcggc ttgcatgaaa atattgttga 3660
ggattataat gccatgccaa ctgagtaaag aaaagagttg taaaatatgt tatgcaacat 3720
gaatatatat gtgatttcat ttttcctttt tcttttcgtg gcaaggaagg cagttaggaa 3780
ggactgatgt gaaaagcaca agtactattc ttagttctgg aaaactgtgt tctttatttt 3840
cctaactaca attcaccttg attagtcagt aacttgatat tggcaattct agctgattat 3900
gaattctgtt tatatttcac taattttgaa tctttaatta cattttatgg ttgaaattta 3960
acgttttgtc tggttatgga ctctgtttgt attcactcaa tttggatctt ccattagatt 4020
tcattgttgg tccttcttct tgtacagctg ttgagtggac tctctttggt tgcttttgga 4080
ccaatggcca gatttgcagt gcaacatcgc gtcttattct tcatgtaagc attgaatata 4140
tccgtcaatc ataatctatt gttgtacttg attttttttc tgatcaactc ctgagttcag 4200
attattatat gatgccatta ctattgcaca gagcgaataa aattgtattt atgcacagca 4260
tgtattttga gtaatatatg cattgcctat tatttaatat atagattgta gcacttaatt 4320
ttgtgtccat gtctctatga tgtttattac tttattattg ccggcatgaa gcaactttga 4380
actctatgtt gatcttgaac taaaattgaa attaattggc ttattgctat taatgatata 4440
gctttcagct tcttgctcct gaccatgaaa gttttgcaga aaaaaatcgc taaagaattt 4500
caagaaagga tggttgcatg ggccaaaaat attaaggtgt cagatccact tgaagagggt 4560
tgcaggcttg ggcccgttgt tagtgaagga caggtaccac atgtaaactt tttctaaatt 4620
caaaaaagaa atgccactga tcaatggtag gtccttccaa gccttattgc tggattgttg 4680
cactgttttg tcaattttgt gtaatatagt tctgaatgaa ttagtcggtg tatgctcttg 4740
ctagttgcta gtatgtggta cagggtcttc ctactttgag caaattcgtg ttaaaatgca 4800
ttgatgaaaa ggccaccttt ccgtaggttt atcttgtcat aatttaaacc ccaataaaat 4860
tttaattttt tgttttgacc ccatggcact ttaatgaaat cacttagcca tgagcttttg 4920
tatatatttt caaagcacca gaatgtttag atggtttgtt ggaaatctta cacatcctat 4980
tgccttgtgt cagtatgaga agattaagca atttgtatct accgccaaaa gccaaggtgc 5040
taccattctg actggtgggg ttagacccaa ggtaataatc tactacacgg ttgtatatat 5100
aggtacccac atatcattat gaagtagaaa taatcttgta tgtttttgtc agcatctgga 5160
gaaaggtttc tatattgaac ccacaatcat tactgatgtc gatacatcaa tgcaaatttg 5220
gagggaagaa gtttttggtc cagtgctctg tgtgaaagaa tttagcactg aagaagaagc 5280
cattgaattg gccaacgata ctcagtgagt ttttttttta atacagttca ttgtcctgtt 5340
caatcttgca gcatatgtat atactctgtg gcatatgaac ttattctgct actactactt 5400
ttgatagtta tggtctggct ggtgctgtgc tttccggtga ccgcgagcga tgccagagat 5460
taactgaggt atatccaagt gaagggggtt ggcattgttt gattcatatg acatggttgc 5520
atcaagctga tattcaagaa tctcatttat tacttgcatt ctatgcatct ccagttcttc 5580
cctggactcc ggtcaatgtt aatatagttt gtttgctagt agtatgctac tccaattaag 5640
ttgctcttca cttccacatc atctgatcca tgactttata tttgacccct tttttttgca 5700
aaagaaaggg aaatacttaa cgaaaatttc ctactgcagg agatcgatgc cggaattatc 5760
tgggtgaact gctcgcaacc ctgcttctgc caagctccat ggggcgggaa caagcgcagc 5820
ggctttggac gcgagctcgg agaagggtgg gtagcacaca acaatctcac tttaaaacac 5880
catttcgatc gtctgatgat ctcgacctga catcatgcct ttggtatttt cattcacttt 5940
tcaggggcat tgacaactac ctaagcgtca agcaagtgac ggagtacgcc tccgatgagc 6000
cgtggggatg gtacaaatcc ccttccaagc tgtaatgtaa tatgcgcata cgcatgacac 6060
gcccatctgt tctgatcgtt tggaataaga ggccatagta tgacgggatg gactttgtgc 6120
atatcgatgt ttgatttgcc atgtgctgag cctggaaata aaaaaggtta tagttggaga 6180
cttgtgagag ttgtacgact tgtactgatg gttacgcgac aatttgtgca tggatagttt 6240
gtgtgcttgt accggggttc tctccgta 6268
<210> 2
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccacgg cgatcccgca gcggcagctc ttcgtcgccg gcgagtggcg cgcccccgcg 60
ctcggccgcc gcctccccgt cgtcaacccc gccaccgagt cccccatcgg cgagatcccg 120
gcgggcacgg cggaggacgt ggacgcggcg gtggcggcgg cgcgggaggc gctgaagagg 180
aaccggggcc gcgactgggc gcgcgcgccg ggcgccgtcc gggccaagta cctccgcgca 240
atcgcggcca agataatcga gaggaaatct gagctggcta gactagagac gcttgattgt 300
gggaagcctc ttgatgaagc agcatgggac atggacgatg ttgctggatg ctttgagtac 360
tttgcagatc ttgcagaatc cttggacaaa aggcaaaatg cacctgtctc tcttccaatg 420
gaaaacttta aatgctatct tcggaaagag cctatcggtg ttgggttgat cacaccttgg 480
aactatcctc tcctgatggc aacatggaag gtagctcctg ccctggctgc tggctgtaca 540
gctgtactaa aaccatctga attggcttcc gtgacttgtt tggagcttgc tgatgtgtgt 600
aaagaggttg gtcttccttc aggtgtgcta aacatagtga ctggattagg ttctgaagcc 660
ggtgctcctt tgtcatcaca ccctggtgta gacaaggttg catttactgg gagttatgaa 720
actggtaaaa agattatggc ttcagctgct cctatggtta agcctgtttc actggaactt 780
ggtggaaaaa gtcctatagt ggtgtttgat gatgttgatg ttgaaaaagc tgttgagtgg 840
actctctttg gttgcttttg gaccaatggc cagatttgca gtgcaacatc gcgtcttatt 900
cttcataaaa aaatcgctaa agaatttcaa gaaaggatgg ttgcatgggc caaaaatatt 960
aaggtgtcag atccacttga agagggttgc aggcttgggc ccgttgttag tgaaggacag 1020
tatgagaaga ttaagcaatt tgtatctacc gccaaaagcc aaggtgctac cattctgact 1080
ggtggggtta gacccaagca tctggagaaa ggtttctata ttgaacccac aatcattact 1140
gatgtcgata catcaatgca aatttggagg gaagaagttt ttggtccagt gctctgtgtg 1200
aaagaattta gcactgaaga agaagccatt gaattggcca acgatactca ttatggtctg 1260
gctggtgctg tgctttccgg tgaccgcgag cgatgccaga gattaactga ggagatcgat 1320
gccggaatta tctgggtgaa ctgctcgcaa ccctgcttct gccaagctcc atggggcggg 1380
aacaagcgca gcggctttgg acgcgagctc ggagaagggg gcattgacaa ctacctaagc 1440
gtcaagcaag tgacggagta cgcctccgat gagccgtggg gatggtacaa atccccttcc 1500
aagctgtaa 1509
<210> 3
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Thr Ala Ile Pro Gln Arg Gln Leu Phe Val Ala Gly Glu Trp
1 5 10 15
Arg Ala Pro Ala Leu Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro Ala Thr
20 25 30
Glu Ser Pro Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp Val Asp
35 40 45
Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Leu Lys Arg Asn Arg Gly Arg
50 55 60
Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Ala
65 70 75 80
Ile Ala Ala Lys Ile Ile Glu Arg Lys Ser Glu Leu Ala Arg Leu Glu
85 90 95
Thr Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp
100 105 110
Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Leu Ala Glu Ser Leu
115 120 125
Asp Lys Arg Gln Asn Ala Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Asn Phe Lys
130 135 140
Cys Tyr Leu Arg Lys Glu Pro Ile Gly Val Gly Leu Ile Thr Pro Trp
145 150 155 160
Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu Ala
165 170 175
Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val Thr
180 185 190
Cys Leu Glu Leu Ala Asp Val Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Ser Gly
195 200 205
Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Ser Glu Ala Gly Ala Pro Leu
210 215 220
Ser Ser His Pro Gly Val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Gly Lys Lys Ile Met Ala Ser Ala Ala Pro Met Val Lys Pro Val
245 250 255
Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe Asp Asp Val
260 265 270
Asp Val Glu Lys Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe Trp Thr
275 280 285
Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Leu His Lys Lys
290 295 300
Ile Ala Lys Glu Phe Gln Glu Arg Met Val Ala Trp Ala Lys Asn Ile
305 310 315 320
Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val Val
325 330 335
Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Lys Gln Phe Val Ser Thr Ala Lys
340 345 350
Ser Gln Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Val Arg Pro Lys His Leu
355 360 365
Glu Lys Gly Phe Tyr Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Asp Thr
370 375 380
Ser Met Gln Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys Val
385 390 395 400
Lys Glu Phe Ser Thr Glu Glu Glu Ala Ile Glu Leu Ala Asn Asp Thr
405 410 415
His Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Val Leu Ser Gly Asp Arg Glu Arg Cys
420 425 430
Gln Arg Leu Thr Glu Glu Ile Asp Ala Gly Ile Ile Trp Val Asn Cys
435 440 445
Ser Gln Pro Cys Phe Cys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Asn Lys Arg Ser
450 455 460
Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Gly Gly Ile Asp Asn Tyr Leu Ser
465 470 475 480
Val Lys Gln Val Thr Glu Tyr Ala Ser Asp Glu Pro Trp Gly Trp Tyr
485 490 495
Lys Ser Pro Ser Lys Leu
500
<210> 4
<211> 5035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accattcctt cagttctttg tctatctcaa gacacaaata actgcagtct ctctctctct 60
ctctctctct ctctctctct ctctgcttca cttctctgct tgtgttgttc tgttgttcat 120
caggaagaac atctgcaagt tatacatata tgtttataat tctttgtttc ccctcttatt 180
cagatcgatc acatgcatct ttcattgctc gtttttcctt acaagtagtc tcatacatgc 240
taatttctgt aaggtgttgg gctggaaatt aattaattaa ttaattgact tgccaagatc 300
catatatatg tcctgatatt aaatcttcgt tcgttatgtt tggttaggct gatcaatgtt 360
attctagagt ctagagaaac acacccaggg gttttccaac tagctccaca agatggtggg 420
ctagctgacc tagatttgaa gtctcactcc ttataattat tttatattag atcattttct 480
aatattcgtg tcttttttta ttctagagtc tagatcttgt gttcaactct cgttaaatca 540
tgtctctcgc cactggagaa acagatcagg agggtttatt ttgggtatag gtcaaagcta 600
agattgaaat tcacaaatag taaaatcaga atccaaccaa ttttagtagc cgagttggtc 660
aaaggaaaat gtatatagct agatttattg ttttggcaaa aaaaaatctg aatatgcaaa 720
atacttgtat atctttgtat taagaagatg aaaataagta gcagaaaatt aaaaaatgga 780
ttatatttcc tgggctaaaa gaattgttga tttggcacaa ttaaattcag tgtcaaggtt 840
ttgtgcaaga attcagtgtg aaggaataga ttctcttcaa aacaatttaa tcattcatct 900
gatctgctca aagctctgtg catctccggg tgcaacggcc aggatattta ttgtgcagta 960
aaaaaatgtc atatccccta gccacccaag aaactgctcc ttaagtcctt ataagcacat 1020
atggcattgt aatatatatg tttgagtttt agcgacaatt tttttaaaaa cttttggtcc 1080
tttttatgaa cgttttaagt ttcactgtct ttttttttcg aattttaaat gtagcttcaa 1140
attctaatcc ccaatccaaa ttgtaataaa cttcaattct cctaattaac atcttaattc 1200
atttatttga aaaccagttc aaattctttt aggctcacca aaccttaaac aattcaattc 1260
agtgcagaga tcttccacag caacagctag acaaccacca tgtcggctct caccacgtcc 1320
cagctcgcca cctcggccac cggcttcggc atcgccgaca ggtcggcgcc gtcgtcgctg 1380
ctccgccacg ggttccaggg cctcaagccc cgcagccccg ccggcggcga cgcgacgtcg 1440
ctcagcgtga cgaccagcgc gcgcgcgacg cccaagcagc agcggtcggt gcagcgtggc 1500
agccggaggt tcccctccgt cgtcgtgtac gccaccggcg ccggcatgaa cgtcgtgttc 1560
gtcggcgccg agatggcccc ctggagcaag accggcggcc tcggtgacgt cctcggtggc 1620
ctcccccctg ccatggctgt aagcacacac aaacttcgat cgctcgtcgt cgctgaccgt 1680
cgtcgtcttc aactgttctt gatcatcgca ttggatggat gtgtaatgtt gtgttcttgt 1740
gttctttgca ggcgaatggc cacagggtca tggtgatctc tcctcggtac gaccagtaca 1800
aggacgcttg ggataccagc gttgtggctg aggtaggagc atatgcgtga tcagatcatc 1860
acaagatcga ttagctttag atgatttgtt acatttcgca agattttaac ccaagttttt 1920
gtggtgcaat tcattgcaga tcaaggttgc agacaggtac gagagggtga ggtttttcca 1980
ttgctacaag cgtggagtcg accgtgtgtt catcgaccat ccgtcattcc tggagaaggt 2040
ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg catttagcag 2100
ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg gtgagaagat 2160
ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca gccttctttg 2220
ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt taccatagta 2280
tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac tcgaggctcc 2340
taggatccta aacctcaaca acaacccata cttcaaagga acttatggtg agttacaatt 2400
gatctcaaga tcttataact ttcttcgaag gaatccatga tgatcagact aattccttcc 2460
ggtttgttac tgacaacagg tgaggatgtt gtgttcgtct gcaacgactg gcacactggc 2520
ccactggcga gctacctgaa gaacaactac cagcccaatg gcatctacag gaatgcaaag 2580
gtctatgctt gttcttgcca taccaactca aatctgcatg cacactgcat tctgttcaga 2640
aactgactgt ctgaatcttt ttcactgcag gttgctttct gcatccacaa catctcctac 2700
cagggccgtt tcgctttcga ggattaccct gagctgaacc tctccgagag gttcaggtca 2760
tccttcgatt tcatcgacgg gtatgagtaa gattctaaga gtaacttact gtcaattcgc 2820
catatatcga ttcaatccaa gatccttttg agctgacaac cctgcactac tgtccatcgt 2880
tcaaatccgg ttaaatttca ggtatgacac gccggtggag ggcaggaaga tcaactggat 2940
gaaggccgga atcctggaag ccgacagggt gctcaccgtg agcccgtact acgccgagga 3000
gctcatctcc ggcatcgcca ggggatgcga gctcgacaac atcatgcggc tcaccggcat 3060
caccggcatc gtcaacggca tggacgtcag cgagtgggat cctagcaagg acaagtacat 3120
caccgccaag tacgacgcaa ccacggtaag aacgaatgca ttcttcacaa gatatgcaat 3180
ctgaattttc tttgaaaaag aaattatcat ctgtcacttc ttgattgatt ctgacaaggc 3240
aagaatgagt gacaaatttc aggcaatcga ggcgaaggcg ctgaacaagg aggcgttgca 3300
ggcggaggcg ggtcttccgg tcgacaggaa aatcccactg atcgcgttca tcggcaggct 3360
ggaggaacag aagggccctg acgtcatggc cgccgccatc ccggagctca tgcaggagga 3420
cgtccagatc gttcttctgg tataatataa tacactacaa gacacacttg cacgatatgc 3480
caaaaattca gaacaaattc agtggcaaaa aaaaaactcg aatattaggg aaggacctaa 3540
taatatcaaa taattagaag gggtgaggct ttgaacccag atcgtctagt ccaccacctt 3600
gtggagttag ccggaagacc tctgagcatt tctcaattca gtggcaaatg atgtgtataa 3660
ttttgatccg tgtgtgtttc agggtactgg aaagaagaag ttcgagaagc tgctcaagag 3720
catggaggag aagtatccgg gcaaggtgag ggccgtggtg aagttcaacg cgccgcttgc 3780
tcatctcatc atggccggag ccgacgtgct cgccgtcccc agccgcttcg agccctgtgg 3840
actcatccag ctgcagggga tgagatacgg aacggtatac aatttccatc tatcaattcg 3900
attgttcgat ttcatctttg tgcaatgcaa tgcaattgca aatgcaaatg catgatgatt 3960
ttccttgttg atttctccag ccctgtgctt gcgcgtccac cggtgggctc gtggacacgg 4020
tcatcgaagg caagactggt ttccacatgg gccgtctcag cgtcgacgta agcctataca 4080
tttacataac aatcagatat gacacatcct aataccgata agtcggtaca ctactacaca 4140
tttacatggt tgctggttat atggtttttt tggcagtgca aggtggtgga gccaagcgac 4200
gtgaagaagg tggcggccac cctgaagcgc gccatcaagg tcgtcggcac gccggcgtac 4260
gaggagatgg tcaggaactg catgaaccag gacctctcct ggaaggtata aattacgaaa 4320
caaatttaac ccaaacatat actatatact ccctccgctt ctaaatattc aacgccgttg 4380
tcttttttaa atatgtttga ccattcgtct tattaaaaaa attaaataat tataaattct 4440
tttcctatca tttgattcat tgttaaatat acttatatgt atacatatag ttttacatat 4500
ttcataaaat tttttgaaca agacgaacgg tcaaacatgt gctaaaaagt taacggtgtc 4560
gaatattcag aaacggaggg agtataaacg tcttgttcag aagttcagag attcacctgt 4620
ctgatgctga tgatgattaa ttgtttgcaa catggatttc aggggcctgc gaagaactgg 4680
gagaatgtgc tcctgggcct gggcgtcgcc ggcagcgcgc cggggatcga aggcgacgag 4740
atcgcgccgc tcgccaagga gaacgtggct gctccttgaa gagcctgaga tctacatatg 4800
gagtgattaa ttaatatagc agtatatgga tgagagacga atgaaccagt ggtttgtttg 4860
ttgtagtgaa tttgtagcta tagccaatta tataggctaa taagtttgat gttgtactct 4920
tctgggtgtg cttaagtatc ttatcggacc ctgaatttat gtgtgtggct tattgccaat 4980
aatattaagt aataaagggt ttattatatt attatatatg ttatattata cttcc 5035
<210> 5
<211> 1830
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60
aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120
gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180
cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240
gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300
ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360
gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420
atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480
gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540
aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600
ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660
aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720
gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780
ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840
aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900
gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960
gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020
aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080
gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140
aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200
ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260
gccatcccgg agctcatgca ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320
aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380
gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440
cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500
tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560
cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620
gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680
aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740
ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800
ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830
<210> 6
<211> 609
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe
1 5 10 15
Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe
20 25 30
Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu
35 40 45
Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val
50 55 60
Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly
65 70 75 80
Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser
85 90 95
Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met
100 105 110
Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln
115 120 125
Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala
130 135 140
Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val
145 150 155 160
Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly
165 170 175
Lys Thr Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys
180 185 190
Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala
195 200 205
Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr
210 215 220
Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu
225 230 235 240
Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn
245 250 255
Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe
260 265 270
Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser
275 280 285
Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys
290 295 300
Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly
325 330 335
Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val
340 345 350
Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile
355 360 365
Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn
370 375 380
Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile
385 390 395 400
Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp
405 410 415
Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile
420 425 430
Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser
435 440 445
Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn
450 455 460
Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val
465 470 475 480
Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg
485 490 495
Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr
500 505 510
Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp
515 520 525
Cys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu
530 535 540
Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val
545 550 555 560
Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn
565 570 575
Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly
580 585 590
Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala
595 600 605
Pro
<210> 7
<211> 18530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta acatgcaccc tcagtctatg 60
atccacaaaa tcaagattgc ttgaaggata ccagtaatcg ctgagctaaa ttggcatgct 120
gtcagagtgg agagtcagta ttgcagcaag gtgcctgctt gagataaccg gcatcatggt 180
gccagtttga tggcaccgtt agggttaggg atggtggcca tgggcgcatg tcctggccaa 240
ctttgtatga tatatggcag ggtgaatagg aaagtaaatt tgtattgtaa aaagggattt 300
cttctgtttg ttaaagggat ttcttctgtt tgttagctca tgtacaagga atgcaagttt 360
tgagcgaggg gggcatcaaa gatctggctg tgcttccagc tgtttttgtt agccccatca 420
aatccttgac ataatgatcc cgcttcaata agcaacctcg cttgtatagt tccttgtgct 480
aacacacgat gaataataag ttataaaata gtggtgtcca aagagtttcc aggcccagtt 540
gtgaaaagct aaaatgctat tcgaatttct actagcagta agtcgtgttt agaaatacac 600
ttatttctta ttttcttcgt attttatttc tgtacctttt ttccttctat gtacagtagg 660
acacagtgtc agcgccgcgt tgacggagta tatttgcaaa aaagtaaaag agaaagtcat 720
agcggcgtat gtgccaaaaa cttcctcaca gagagggcca tgagaaacat ggcccacggc 780
ccaatacgaa gcaccgcgac ggagcaaagc gctgggtaat acgcaaacgt tttgtcccgc 840
ctcgactaac cacaagagta gagcgtacct tataaaccga gccgcaagca ccgaattaac 900
aaagcaccag tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat 960
tcccggctgg tgcagcttgc tgatgtgtgt aaaggtttta gagctagaaa tagcaagtta 1020
aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc aacaaagcac 1080
cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc gattcccggc 1140
tggtgcatga aactggtaaa aagattagtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 1200
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaacaaag caccagtggt 1260
ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc ggctggtgca 1320
atgggttgtt gttgaggttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 1380
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg 1440
tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt gcaggtaatc 1500
ctcgaaagcg aaagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 1560
aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttttgca aaattttcca gatcgatttc 1620
ttcttcctct gttcttcggc gttcaatttc tggggttttc tcttcgtttt ctgtaactga 1680
aacctaaaat ttgacctaaa aaaaatctca aataatatga ttcagtggtt ttgtactttt 1740
cagttagttg agttttgcag ttccgatgag ataaaccaat aagcttagag ataatgagca 1800
ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg 1860
cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag 1920
tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa 1980
aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg 2040
ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac 2100
atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt 2160
tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa 2220
taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa 2280
gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta 2340
aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca 2400
agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctcttg agagttccgc 2460
tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg 2520
tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc acggcagcta cgggggattc 2580
ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc 2640
cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccacctgcag 2700
cgatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc 2760
ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt 2820
tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgccagcgt 2880
tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc 2940
tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcaat ttcatgattt 3000
tttttgtttc gttacatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg 3060
cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc 3120
tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta 3180
ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg 3240
gatggaaata tcaatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata 3300
cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt 3360
cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa 3420
ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcaat 3480
ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc 3540
agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt 3600
tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat 3660
ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc 3720
tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag tctagatgga ttacaaggac cacgacgggg 3780
attacaagga ccacgacatt gattacaagg atgatgatga caagatggct ccgaagaaga 3840
agaggaaggt tggcatccac ggggtgccag ctgctgacaa gaagtactcg atcggcctcg 3900
atattgggac taactctgtt ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgccctcaa 3960
agaagttcaa ggtcctgggc aacaccgatc ggcattccat caagaagaat ctcattggcg 4020
ctctcctgtt cgacagcggc gagacggctg aggctacgcg gctcaagcgc accgcccgca 4080
ggcggtacac gcgcaggaag aatcgcatct gctacctgca ggagattttc tccaacgaga 4140
tggcgaaggt tgacgattct ttcttccaca ggctggagga gtcattcctc gtggaggagg 4200
ataagaagca cgagcggcat ccaatcttcg gcaacattgt cgacgaggtt gcctaccacg 4260
agaagtaccc tacgatctac catctgcgga agaagctcgt ggactccaca gataaggcgg 4320
acctccgcct gatctacctc gctctggccc acatgattaa gttcaggggc catttcctga 4380
tcgaggggga tctcaacccg gacaatagcg atgttgacaa gctgttcatc cagctcgtgc 4440
agacgtacaa ccagctcttc gaggagaacc ccattaatgc gtcaggcgtc gacgcgaagg 4500
ctatcctgtc cgctaggctc tcgaagtctc ggcgcctcga gaacctgatc gcccagctgc 4560
cgggcgagaa gaagaacggc ctgttcggga atctcattgc gctcagcctg gggctcacgc 4620
ccaacttcaa gtcgaatttc gatctcgctg aggacgccaa gctgcagctc tccaaggaca 4680
catacgacga tgacctggat aacctcctgg cccagatcgg cgatcagtac gcggacctgt 4740
tcctcgctgc caagaatctg tcggacgcca tcctcctgtc tgatattctc agggtgaaca 4800
ccgagattac gaaggctccg ctctcagcct ccatgatcaa gcgctacgac gagcaccatc 4860
aggatctgac cctcctgaag gcgctggtca ggcagcagct ccccgagaag tacaaggaga 4920
tcttcttcga tcagtcgaag aacggctacg ctgggtacat tgacggcggg gcctctcagg 4980
aggagttcta caagttcatc aagccgattc tggagaagat ggacggcacg gaggagctgc 5040
tggtgaagct caatcgcgag gacctcctga ggaagcagcg gacattcgat aacggcagca 5100
tcccacacca gattcatctc ggggagctgc acgctatcct gaggaggcag gaggacttct 5160
accctttcct caaggataac cgcgagaaga tcgagaagat tctgactttc aggatcccgt 5220
actacgtcgg cccactcgct aggggcaact cccgcttcgc ttggatgacc cgcaagtcag 5280
aggagacgat cacgccgtgg aacttcgagg aggtggtcga caagggcgct agcgctcagt 5340
cgttcatcga gaggatgacg aatttcgaca agaacctgcc aaatgagaag gtgctcccta 5400
agcactcgct cctgtacgag tacttcacag tctacaacga gctgactaag gtgaagtatg 5460
tgaccgaggg catgaggaag ccggctttcc tgtctgggga gcagaagaag gccatcgtgg 5520
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agaagattga gtgcttcgat tcggtcgaga tctctggcgt tgaggaccgc ttcaacgcct 5640
ccctggggac ctaccacgat ctcctgaaga tcattaagga taaggacttc ctggacaacg 5700
aggagaatga ggatatcctc gaggacattg tgctgacact cactctgttc gaggaccggg 5760
agatgatcga ggagcgcctg aagacttacg cccatctctt cgatgacaag gtcatgaagc 5820
agctcaagag gaggaggtac accggctggg ggaggctgag caggaagctc atcaacggca 5880
ttcgggacaa gcagtccggg aagacgatcc tcgacttcct gaagagcgat ggcttcgcga 5940
accgcaattt catgcagctg attcacgatg acagcctcac attcaaggag gatatccaga 6000
aggctcaggt gagcggccag ggggactcgc tgcacgagca tatcgcgaac ctcgctggct 6060
cgccagctat caagaagggg attctgcaga ccgtgaaggt tgtggacgag ctggtgaagg 6120
tcatgggcag gcacaagcct gagaacatcg tcattgagat ggcccgggag aatcagacca 6180
cgcagaaggg ccagaagaac tcacgcgaga ggatgaagag gatcgaggag ggcattaagg 6240
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attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 540
tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 660
acccctcttg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720
gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 780
acggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg 840
taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac 900
acacacacaa ccacctgcag cgatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa 960
ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc 1020
catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 1080
tagatccgtg ctgccagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat 1140
tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 1200
cgggatcaat ttcatgattt tttttgtttc gttacatagg gtttggtttg cccttttcct 1260
ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc 1320
ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt 1380
caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata 1440
gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcaatctagg ataggtatac atgttgatgc 1500
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg 1560
tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg 1620
tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta 1680
agatggatgg aaatatcaat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc 1740
atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat 1800
tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata 1860
tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt 1920
actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag tctaga 1976
<210> 10
<211> 670
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaattccgag ccgcaagcac cgaattaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta 60
ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt gcagcttgct gatgtgtgta 120
aaggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 180
agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc 240
acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcatgaa actggtaaaa agattagttt 300
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 360
ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac 420
agacccgggt tcgattcccg gctggtgcaa tgggttgttg ttgaggtttg ttttagagct 480
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 540
ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg 600
ggttcgattc ccggctggtg caggtaatcc tcgaaagcga aagttttaga gctagaaata 660
gcaagaattc 670
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcttgctgat gtgtgtaaag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaaactggt aaaaagatta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgggttgtt gttgaggttt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtaatcctc gaaagcgaaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagaaagtca tagcggcgta tg 22
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aggagttcta caagttcatc aagc 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccacgatggc cttcttctgc 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacagtttgc cagtgataca ca 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaagaatctc gtgctttcag ct 22
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgataacgg aattgattgc attct 25
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttccaccaag ttccagtgaa ac 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggagaaggt ggagtcatca tt 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccttcatcc agttgatctt cc 22
<210> 24
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aggagttcta caagttcatc aagccgattc tggagaagat ggacggcacg gaggagctgc 60
tggtgaagct caatcgcgag gacctcctga ggaagcagcg gacattcgat aacggcagca 120
tcccacacca gattcatctc ggggagctgc acgctatcct gaggaggcag gaggacttct 180
accctttcct caaggataac cgcgagaaga tcgagaagat tctgactttc aggatcccgt 240
actacgtcgg cccactcgct aggggcaact cccgcttcgc ttggatgacc cgcaagtcag 300
aggagacgat cacgccgtgg aacttcgagg aggtggtcga caagggcgct agcgctcagt 360
cgttcatcga gaggatgacg aatttcgaca agaacctgcc aaatgagaag gtgctcccta 420
agcactcgct cctgtacgag tacttcacag tctacaacga gctgactaag gtgaagtatg 480
tgaccgaggg catgaggaag ccggctttcc tgtctgggga gcagaagaag gccatcgtgg 540
<210> 25
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat 60
agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg 120
ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc 180
tcccgccgtt cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt 240
ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc 300
gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata 360
tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tg 402
<210> 26
<211> 824
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
tgtaaagagg ttggtcttcc ttcaggtgtg ctaaacatag tgactggatt aggttctgaa 420
gccggtgctc ctttgtcatc acaccctggt gtagacaagg tacagctatt cctcctgtaa 480
tcatgtatac cccatcaatg gaaatgatat tcctctcaat acatggttta tgttttctgt 540
taggttgcat ttactgggag ttatgaaact ggtaaaaaga ttatggcttc agctgctcct 600
atggttaagg tttgtttcca aatttctgtg gatatttttt gttctctttc tactaactct 660
ctattatcaa ttctcaatgt tgtccttttc ttttaactcc tttacttttt agaattgtga 720
tcaagacact ttgagcatca ttctagtagc cagttctatc ctgtttctta cctttttatg 780
gttcgtcttt tcttgacagc ctgtttcact ggaacttggt ggaa 824
<210> 27
<211> 916
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
catttagcag ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg 120
gtgagaagat ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca 180
gccttctttg ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt 240
taccatagta tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac 300
tcgaggctcc taggatccta aacctcaaca acaacccata cttcaaagga acttatggtg 360
agttacaatt gatctcaaga tcttataact ttcttcgaag gaatccatga tgatcagact 420
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gcacactggc ccactggcga gctacctgaa gaacaactac cagcccaatg gcatctacag 540
gaatgcaaag gtctatgctt gttcttgcca taccaactca aatctgcatg cacactgcat 600
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catctcctac cagggccgtt tcgctttcga ggattaccct gagctgaacc tctccgagag 720
gttcaggtca tccttcgatt tcatcgacgg gtatgagtaa gattctaaga gtaacttact 780
gtcaattcgc catatatcga ttcaatccaa gatccttttg agctgacaac cctgcactac 840
tgtccatcgt tcaaatccgg ttaaatttca ggtatgacac gccggtggag ggcaggaaga 900
tcaactggat gaaggc 916
<210> 28
<211> 817
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
aggttggtct tccttcaggt gtgctaaaca tagtgactgg attaggttct gaagccggtg 420
ctcctttgtc atcacaccct ggtgtagaca aggtacagct attcctcctg taatcatgta 480
taccccatca atggaaatga tattcctctc aatacatggt ttatgttttc tgttaggttg 540
catttactgg gagttatgaa actggtaaaa agattatggc ttcagctgct cctatggtta 600
aggtttgttt ccaaatttct gtggatattt tttgttctct ttctactaac tctctattat 660
caattctcaa tgttgtcctt ttcttttaac tcctttactt tttagaattg tgatcaagac 720
actttgagca tcattctagt agccagttct atcctgtttc ttaccttttt atggttcgtc 780
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<210> 29
<211> 784
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgag 360
aggttggtct tccttcaggt gtgctaaaca tagtgactgg attaggttct gaagccggtg 420
ctcctttgtc atcacaccct ggtgtagaca aggtacagct attcctcctg taatcatgta 480
taccccatca atggaaatga tattcctctc aatacatggt ttatgttttc tgttaggttg 540
catttactgg gagttatgaa actggtaagg tttgtttcca aatttctgtg gatatttttt 600
gttctctttc tactaactct ctattatcaa ttctcaatgt tgtccttttc ttttaactcc 660
tttacttttt agaattgtga tcaagacact ttgagcatca ttctagtagc cagttctatc 720
ctgtttctta cctttttatg gttcgtcttt tcttgacagc ctgtttcact ggaacttggt 780
ggaa 784
<210> 30
<211> 821
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
aagaggttgg tcttccttca ggtgtgctaa acatagtgac tggattaggt tctgaagccg 420
gtgctccttt gtcatcacac cctggtgtag acaaggtaca gctattcctc ctgtaatcat 480
gtatacccca tcaatggaaa tgatattcct ctcaatacat ggtttatgtt ttctgttagg 540
ttgcatttac tgggagttat gaaactggta aaaagaatta tggcttcagc tgctcctatg 600
gttaaggttt gtttccaaat ttctgtggat attttttgtt ctctttctac taactctcta 660
ttatcaattc tcaatgttgt ccttttcttt taactccttt actttttaga attgtgatca 720
agacactttg agcatcattc tagtagccag ttctatcctg tttcttacct ttttatggtt 780
cgtcttttct tgacagcctg tttcactgga acttggtgga a 821
<210> 31
<211> 823
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
taaagaggtt ggtcttcctt caggtgtgct aaacatagtg actggattag gttctgaagc 420
cggtgctcct ttgtcatcac accctggtgt agacaaggta cagctattcc tcctgtaatc 480
atgtataccc catcaatgga aatgatattc ctctcaatac atggtttatg ttttctgtta 540
ggttgcattt actgggagtt atgaaactgg taaaaagatt tatggcttca gctgctccta 600
tggttaaggt ttgtttccaa atttctgtgg atattttttg ttctctttct actaactctc 660
tattatcaat tctcaatgtt gtccttttct tttaactcct ttacttttta gaattgtgat 720
caagacactt tgagcatcat tctagtagcc agttctatcc tgtttcttac ctttttatgg 780
ttcgtctttt cttgacagcc tgtttcactg gaacttggtg gaa 823
<210> 32
<211> 820
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
tgaaagaggt tggtcttcct tcaggtgtgc taaacatagt gactggatta ggttctgaag 420
ccggtgctcc tttgtcatca caccctggtg tagacaaggt acagctattc ctcctgtaat 480
catgtatacc ccatcaatgg aaatgatatt cctctcaata catggtttat gttttctgtt 540
aggttgcatt tactgggagt tatgaaactg gtaaaaatat ggcttcagct gctcctatgg 600
ttaaggtttg tttccaaatt tctgtggata ttttttgttc tctttctact aactctctat 660
tatcaattct caatgttgtc cttttctttt aactccttta ctttttagaa ttgtgatcaa 720
gacactttga gcatcattct agtagccagt tctatcctgt ttcttacctt tttatggttc 780
gtcttttctt gacagcctgt ttcactggaa cttggtggaa 820
<210> 33
<211> 818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
agaggttggt cttccttcag gtgtgctaaa catagtgact ggattaggtt ctgaagccgg 420
tgctcctttg tcatcacacc ctggtgtaga caaggtacag ctattcctcc tgtaatcatg 480
tataccccat caatggaaat gatattcctc tcaatacatg gtttatgttt tctgttaggt 540
tgcatttact gggagttatg aaactggtaa aaagttatgg cttcagctgc tcctatggtt 600
aaggtttgtt tccaaatttc tgtggatatt ttttgttctc tttctactaa ctctctatta 660
tcaattctca atgttgtcct tttcttttaa ctcctttact ttttagaatt gtgatcaaga 720
cactttgagc atcattctag tagccagttc tatcctgttt cttacctttt tatggttcgt 780
cttttcttga cagcctgttt cactggaact tggtggaa 818
<210> 34
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtt 360
ttcctctcaa tacatggttt atgttttctg ttaggttgca tttactggga gttatgaaac 420
tggtaatatg gcttcagctg ctcctatggt taaggtttgt ttccaaattt ctgtggatat 480
tttttgttct ctttctacta actctctatt atcaattctc aatgttgtcc ttttctttta 540
actcctttac tttttagaat tgtgatcaag acactttgag catcattcta gtagccagtt 600
ctatcctgtt tcttaccttt ttatggttcg tcttttcttg acagcctgtt tcactggaac 660
ttggtggaa 669
<210> 35
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
aaagaggttg gtcttccttc aggtgtgcta aacatagtga ctggattagg ttctgaagcc 420
ggtgctcctt tgtcatcaca ccctggtgta gacaaggtac agctattcct cctgtaatca 480
tgtatacccc atcaatggaa atgatattcc tctcaataca tggtttatgt tttctgttag 540
gttgcattta ctgggagtta tgaaactggt aaaaagagtt atggcttcag ctgctcctat 600
ggttaaggtt tgtttccaaa tttctgtgga tattttttgt tctctttcta ctaactctct 660
attatcaatt ctcaatgttg tccttttctt ttaactcctt tactttttag aattgtgatc 720
aagacacttt gagcatcatt ctagtagcca gttctatcct gtttcttacc tttttatggt 780
tcgtcttttc ttgacagcct gtttcactgg aacttggtgg aa 822
<210> 36
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
tgaagaggtt ggtcttcctt caggtgtgct aaacatagtg actggattag gttctgaagc 420
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atggttaagg tttgtttcca aatttctgtg gatatttttt gttctctttc tactaactct 660
ctattatcaa ttctcaatgt tgtccttttc ttttaactcc tttacttttt agaattgtga 720
tcaagacact ttgagcatca ttctagtagc cagttctatc ctgtttctta cctttttatg 780
gttcgtcttt tcttgacagc ctgtttcact ggaacttggt ggaa 824
<210> 52
<211> 793
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
tgtaagaggt tggtcttcct tcaggtgtgc taaacatagt gactggatta ggttctgaag 420
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catgtatacc ccatcaatgg aaatgatatt cctctcaata catggtttat gttttctgtt 540
aggttgcatt tatggcttca gctgctccta tggttaaggt ttgtttccaa atttctgtgg 600
atattttttg ttctctttct actaactctc tattatcaat tctcaatgtt gtccttttct 660
tttaactcct ttacttttta gaattgtgat caagacactt tgagcatcat tctagtagcc 720
agttctatcc tgtttcttac ctttttatgg ttcgtctttt cttgacagcc tgtttcactg 780
gaacttggtg gaa 793
<210> 53
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgta 360
agaggttggt cttccttcag gtgtgctaaa catagtgact ggattaggtt ctgaagccgg 420
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<210> 54
<211> 790
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
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gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 56
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ggc 903
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
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<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
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<210> 62
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
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<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
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<210> 65
<211> 784
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
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ttgcattttc agctgctcct atggttaagg tttgtttcca aatttctgtg gatatttttt 600
gttctctttc tactaactct ctattatcaa ttctcaatgt tgtccttttc ttttaactcc 660
tttacttttt agaattgtga tcaagacact ttgagcatca ttctagtagc cagttctatc 720
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ggaa 784
<210> 66
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
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ccggtgctcc tttgtcatca caccctggtg tagacaaggt acagctattc ctcctgtaat 480
catgtatacc ccatcaatgg aaatgatatt cctctcaata catggtttat gttttctgtt 540
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<400> 67
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tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
tgtaagaggt tggtcttcct tcaggtgtgc taaacatagt gactggatta ggttctgaag 420
ccggtgctcc tttgtcatca caccctggtg tagacaaggt acagctattc ctcctgtaat 480
catgtatacc ccatcaatgg aaatgatatt cctctcaata catggtttat gttttctgtt 540
aggttgcatt tactgggagt tatgaaactg gtaaaaagat atggcttcag ctgctcctat 600
ggttaaggtt tgtttccaaa tttctgtgga tattttttgt tctctttcta ctaactctct 660
attatcaatt ctcaatgttg tccttttctt ttaactcctt tactttttag aattgtgatc 720
aagacacttt gagcatcatt ctagtagcca gttctatcct gtttcttacc tttttatggt 780
tcgtcttttc ttgacagcct gtttcactgg aacttggtgg aa 822
<210> 68
<211> 823
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttgataacgg aattgattgc attctaattt gttgtttctt tgttatgttc ttatcgacaa 60
ttacaaattt gattctgaga atcatgttcg ggatgtgtat ttctactgca ggaactatcc 120
tctcctgatg gcaacatgga aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact 180
aaaaccatct gaattggctt ccgtgtaagt ttaacatgtt aacttgttaa tgtcataccc 240
atgctagttg caatgacatt tgattttaaa atgttgtggc atgtccatgc tgcaagcaat 300
gtaatttgaa atctctctct atcattaatt accaggactt gtttggagct tgctgatgtg 360
tgtagaggtt ggtcttcctt caggtgtgct aaacatagtg actggattag gttctgaagc 420
cggtgctcct ttgtcatcac accctggtgt agacaaggta cagctattcc tcctgtaatc 480
atgtataccc catcaatgga aatgatattc ctctcaatac atggtttatg ttttctgtta 540
ggttgcattt actgggagtt atgaaactgg taaaaagaat tatggcttca gctgctccta 600
tggttaaggt ttgtttccaa atttctgtgg atattttttg ttctctttct actaactctc 660
tattatcaat tctcaatgtt gtccttttct tttaactcct ttacttttta gaattgtgat 720
caagacactt tgagcatcat tctagtagcc agttctatcc tgtttcttac ctttttatgg 780
ttcgtctttt cttgacagcc tgtttcactg gaacttggtg gaa 823
<210> 69
<211> 1828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
catttagcag ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg 120
gtgagaagat ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca 180
gccttctttg ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt 240
taccatagta tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac 300
tcgaggctcc taggatccta aactcaacaa caacccatac ttcaaaggaa cttatggtga 360
gttacaattg atctcaagat cttataactt tcttcgaagg aatccatgat gatcagacta 420
attccttccg gtttgttact gacaacaggt gaggatgttg tgttcgtctg caacgactgg 480
cacactggcc cactggcgag ctacctgaag aacaactacc agcccaatgg catctacagg 540
aatgcaaagg tctatgcttg ttcttgccat accaactcaa atctgcatgc acactgcatt 600
ctgttcagaa actgactgtc tgaatctttt tcactgcagg ttgctttctg catccacaac 660
atctcctacc agggccgttt gctttcgagg attaccctga gctgaacctc tccgagaggt 720
tcaggtcatc cttcgatttc atcgacgggt atgagtaaga ttctaagagt aacttactgt 780
caattcgcca tatatcgatt caatccaaga tccttttgag ctgacaaccc tgcactactg 840
tccatcgttc aaatccggtt aaatttcagg tatgacacgc cggtggaggg caggaagatc 900
aactggatga aggctggaga aggtggagtc atcattagtt tacctttttt gtttttactg 960
aattattaac agtgcattta gcagttggac tgagcttagc ttccactggt gatttcaggt 1020
ttggggaaag accggtgaga agatctacgg acctgacact ggagttgatt acaaagacaa 1080
ccagatgcgt ttcagccttc tttgccaggt cagtgattac ttctatctga tgatggttgg 1140
aagcatcacg agtttaccat agtatgtatg gattcataac taattcgtgt attgatgcta 1200
cctgcaggca gcactcgagg ctcctaggat cctaaactca acaacaaccc atacttcaaa 1260
ggaacttatg gtgagttaca attgatctca agatcttata actttcttcg aaggaatcca 1320
tgatgatcag actaattcct tccggtttgt tactgacaac aggtgaggat gttgtgttcg 1380
tctgcaacga ctggcacact ggcccactgg cgagctacct gaagaacaac taccagccca 1440
atggcatcta caggaatgca aaggtctatg cttgttcttg ccataccaac tcaaatctgc 1500
atgcacactg cattctgttc agaaactgac tgtctgaatc tttttcactg caggttgctt 1560
tctgcatcca caacatctcc taccagggcc gtttgctttc gaggattacc ctgagctgaa 1620
cctctccgag aggttcaggt catccttcga tttcatcgac gggtatgagt aagattctaa 1680
gagtaactta ctgtcaattc gccatatatc gattcaatcc aagatccttt tgagctgaca 1740
accctgcact actgtccatc gttcaaatcc ggttaaattt caggtatgac acgccggtgg 1800
agggcaggaa gatcaactgg atgaaggc 1828
<210> 70
<211> 908
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
catttagcag ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg 120
gtgagaagat ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca 180
gccttctttg ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt 240
taccatagta tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac 300
tcgaggctcc taggatccta aaaaacaacc catacttcaa aggaacttat ggtgagttac 360
aattgatctc aagatcttat aactttcttc gaaggaatcc atgatgatca gactaattcc 420
ttccggtttg ttactgacaa caggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac 480
tggcccactg gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc 540
aaaggtctat gcttgttctt gccataccaa ctcaaatctg catgcacact gcattctgtt 600
cagaaactga ctgtctgaat ctttttcact gcaggttgct ttctgcatcc acaacatctc 660
ctaccagggc cgtttctttc gaggattacc ctgagctgaa cctctccgag aggttcaggt 720
catccttcga tttcatcgac gggtatgagt aagattctaa gagtaactta ctgtcaattc 780
gccatatatc gattcaatcc aagatccttt tgagctgaca accctgcact actgtccatc 840
gttcaaatcc ggttaaattt caggtatgac acgccggtgg agggcaggaa gatcaactgg 900
atgaaggc 908
<210> 71
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
catttagcag ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg 120
gtgagaagat ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca 180
gccttctttg ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt 240
taccatagta tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac 300
tcgaggctcc taggatccta tggtgagtta caattgatct caagatctta taactttctt 360
cgaaggaatc catgatgatc agactaattc cttccggttt gttactgaca acaggtgagg 420
atgttgtgtt cgtctgcaac gactggcaca ctggcccact ggcgagctac ctgaagaaca 480
actaccagcc caatggcatc tacaggaatg caaaggtcta tgcttgttct tgccatacca 540
actcaaatct gcatgcacac tgcattctgt tcagaaactg actgtctgaa tctttttcac 600
tgcaggttgc tttctgcatc cacaacatct cctaccaggg ccgtttcttt cgaggattac 660
cctgagctga acctctccga gaggttcagg tcatccttcg atttcatcga cgggtatgag 720
taagattcta agagtaactt actgtcaatt cgccatatat cgattcaatc caagatcctt 780
ttgagctgac aaccctgcac tactgtccat cgttcaaatc cggttaaatt tcaggtatga 840
cacgccggtg gagggcagga agatcaactg gatgaaggc 879
<210> 72
<211> 845
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
catttagcag ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg 120
gtgagaagat ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca 180
gccttctttg ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt 240
taccatagta tgtatggatt cataacccat acttcaaagg aacttatggt gagttacaat 300
tgatctcaag atcttataac tttcttcgaa ggaatccatg atgatcagac taattccttc 360
cggtttgtta ctgacaacag gtgaggatgt tgtgttcgtc tgcaacgact ggcacactgg 420
cccactggcg agctacctga agaacaacta ccagcccaat ggcatctaca ggaatgcaaa 480
ggtctatgct tgttcttgcc ataccaactc aaatctgcat gcacactgca ttctgttcag 540
aaactgactg tctgaatctt tttcactgca ggttgctttc tgcatccaca acatctccta 600
ccagggccgt ttctttcgag gattaccctg agctgaacct ctccgagagg ttcaggtcat 660
ccttcgattt catcgacggg tatgagtaag attctaagag taacttactg tcaattcgcc 720
atatatcgat tcaatccaag atccttttga gctgacaacc ctgcactact gtccatcgtt 780
caaatccggt taaatttcag gtatgacacg ccggtggagg gcaggaagat caactggatg 840
aaggc 845
<210> 73
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tggagaaggt ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg 60
catttagcag ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg 120
gtgagaagat ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca 180
gccttctttg ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt 240
taccatagta tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac 300
tcgaggctcc taggatccta aacaacaacc catacttcaa aggaacttat ggtgagttac 360
aattgatctc aagatcttat aactttcttc gaaggaatcc atgatgatca gactaattcc 420
ttccggtttg ttactgacaa caggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac 480
tggcccactg gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc 540
aaaggtctat gcttgttctt gccataccaa ctcaaatctg catgcacact gcattctgtt 600
cagaaactga ctgtctgaat ctttttcact gcaggttgct ttctgcatcc acaacatctc 660
ctaccagggc cgttttagga ttaccctgag ctgaacctct ccgagaggtt caggtcatcc 720
ttcgatttca tcgacgggta tgagtaagat tctaagagta acttactgtc aattcgccat 780
atatcgattc aatccaagat ccttttgagc tgacaaccct gcactactgt ccatcgttca 840
aatccggtta aatttcaggt atgacacgcc ggtggagggc aggaagatca actggatgaa 900
ggc 903

Claims (8)

1.一种基因编辑转化载体，其特征在于，所述基因编辑转化载体以pCambia3301为载体骨架，其包括ZmU6启动子、ZmUBI1启动子；还包括针对被编辑目标基因的不同区域可识别位点设计的多个gRNA片段；所述gRNA片段位于所述ZmU6启动子、ZmUBI1启动子之间，且通过ZmU6启动子进行同步表达；所述gRNA片段通过tRNA技术交互连接；所述基因编辑转化载体核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述被编辑目标基因为粳稻基因Badh2和Waxy。
2.根据权利要求1所述的基因编辑转化载体的构建方法，其特征在于，包括：针对被编辑目标基因的不同区域可识别位点设计gRNA，多个所述gRNA通过tRNA技术交互连接后用克隆方法插入到转化载体的ZmU6启动子和gRNA骨架之间，由同一个ZmU6启动子同步表达，即得到所述基因编辑转化载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11-14所示的四个gRNA，与tRNA和gRNA骨架交互排列为tRNA-OsB2-G3-gRNA-tRNA-OsB2-G6-gRNA-tRNA-OsWx1-G3-gRNA-tRNA-OsWx1-G4片段。
4.一种粳稻品种的遗传转化方法，其特征在于，通过农杆菌介导，将权利要求1所述的基因编辑转化载体导入粳稻细胞，再筛选得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑粳稻品系。
5.根据权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)受体粳稻进行遗传转化得到再生粳稻；
(2)检测再生粳稻的基因编辑是否成功；
(3)筛选得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合编辑粳稻品系。
6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)包括：
S21：采样再生植株叶片，提取基因组DNA后进行PCR扩增，能获得特异性扩增片段的植株即为转化阳性；
S22：设计PCR引物，获得目的基因片段，将再生植株的DNA片段与野生型序列进行对比，若再生植株DNA片段与野生型有确定的序列差异，则为基因编辑粳稻。
7.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中，将再生植株T0的种子种植萌发后得到后代植株T1，进行检测筛选得到具有香味、非转基因、稳定遗传的纯合基因编辑后代植株。
8.如下应用：
(a)根据权利要求1所述的基因编辑转化载体或权利要求2-3所述的构建方法在粳稻育种领域中的应用；
(b)根据权利要求4-7所述的遗传转化方法在粳稻育种领域中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh2;邵高能等;《中国水稻科学》;第31卷(第2期);全文 *

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