CN113925900A

CN113925900A - 一种治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113925900A
Application number: CN202111208065.1A
Authority: CN
Inventors: 周平; 杨宏杰; 滕宝松
Original assignee: Shanghai Furan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Furan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-18
Filing date: 2021-10-18
Publication date: 2022-01-14

Abstract

本发明涉及一种治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物及其制备方法和应用，以重量计，包括灵芝600～1200份、人参300～900份、山楂900～1200份、荷叶300～1000份。制备方法包括：灵芝子实体水提醇沉后取超滤分级3kDa～30kDa组分并浓缩成清膏；人参、山楂和荷叶乙醇提取后，醇提液浓缩至无醇味然后用大孔吸附树脂分离纯化，解吸液浓缩成清膏，合并两种清膏加入辅料制成药用制剂。本发明组合物经试验表明在改善非酒精性单纯性脂肪肝的血生化指标、恢复正常体重以及脂肪肝方面具有显著的效果。单次给药毒理实验发现本发明中药组合物安全性高。因此，本发明提供的中药组合物有望开发成为新一代预防治疗非酒精性脂肪肝的药物。

Description

一种治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种中药复方，特别涉及一种治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物及其制备方法，属于中药制药领域。

背景技术

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种临床病理综合征，其主要特征是肝组织内脂肪堆积超过肝脏重量的5％，且不能用过量饮酒来解释。NAFLD是导致终末期肝脏病变合并心血管和其他代谢疾病最常见的病理疾病之一。NAFLD的特点是肝脏脂肪过度堆积，并伴有胰岛素抵抗。指标为组织学分析肝脂肪变性大于5％，质子磁共振波谱(¹H-NMR)或定量脂肪/水选择性磁共振成像(MRI)评价质子密度脂肪率大于5.6％。

NAFLD包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、进行性纤维化、肝硬化和肝细胞癌，并导致肝移植和死亡的增加。据估计，由于生活方式的改变，在总人口中，全球NAFLD患病率在过去几十年里急剧上升至20％～30％。NAFLD的患病率因地区和种族而异。据报告，发病率最高的是南美和中东，其次是亚洲、美洲和欧洲，而非洲的NAFLD发病率较低。

由于NAFLD发病的隐匿性，大多数人对此没有很高的意识，这为NAFLD的预防工作带来极大的困难。同时，由于影响NAFLD因素的复杂性，NAFLD发病机制尚不完全清楚，早期在NAFLD发病机制的众多理论中被普遍接受的学说是“二次打击”学说。该学说认为高毒性游离脂肪酸的积累作为NAFLD发展的第一次打击，引发“平行、多重”损伤的发生，即第二次打击。第二次打击包括氧化应激诱导的线粒体功能障碍、内质网应激、内毒素诱导、TLR4-依赖的炎性细胞因子释放、铁超载等。这些有害因素触发一系列信号级联导致炎症、细胞死亡和纤维化，而这些正是非酒精性脂肪性肝炎的特征。

然而，这个理论不足以解释NAFLD的复杂性，近年来的研究结果逐渐补充和超越了经典的“二次打击”学说，出现的“多重打击”学说逐渐被接受。多重打击假说涉及更广泛的代谢功能紊乱，它考虑了环境因素共同作用于具有遗传易感性的受试者，从而诱发NAFLD，为NAFLD的发病机制提供了更准确的解释。例如母亲的围产期肥胖和环境营养过剩使其后代在成年期更容易发生NAFLD。该理论认为最初的冲击是胰岛素抵抗，以甘油三酯形式储存的游离脂肪酸的摄取和合成增加，导致简单的脂肪变性。此外，该理论提出，即使没有脂肪变性，非酒精性脂肪性肝炎也可能发生，支持脂肪变性不是非酒精性脂肪性肝炎发生和进展的一个因果因素。

NAFLD属中医“胁痛”、“肝着”、“积聚”、“痞满”、“浊”等范畴，最早记载见于《难经》：“肝之积，名曰肥气”；《临证指南医案》有“而但湿从内生者，必其人膏粱酒醴过度”等阐述，认识到本病与湿热有关；《古今医案》中“胁痛者，……若因暴怒伤触，悲哀气结，饮食过度，冷热失调……或痰积流注于血，与血相搏，皆能为痛”的论述，揭示本病与痰血淤结有关。中医学认为，本病之成因多为过食肥甘、过度肥胖、情志失调致肝失疏泄，脾失健运，湿热内生，痰浊郁结，瘀血阻滞，终致湿滞痰阻瘀结，痹阻肝脏脉络而形成非酒精性脂肪肝。气血失调，湿瘀互结、虚实夹杂是本病病机特点。因此，调理肝脾、祛湿化瘀是治疗脂肪肝的基本治法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物。本发明所述的中药组合物包括灵芝、人参、山楂和荷叶，其药材组成重量比为：灵芝600-1200份，人参300-900份，山楂900-1200份，荷叶300-1000份。

优选地，所述的中药组合物包括灵芝800-1000份，人参500-700份，山楂900-1200份，荷叶500-700份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝600份，人参300份，山楂900份，荷叶300份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝1200份，人参900份，山楂1200份，荷叶1000份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝800份，人参500份，山楂1200份，荷叶700份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝1000份，人参700份，山楂900份，荷叶500份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝800份，人参500份，山楂900份，荷叶500份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝1000份，人参700份，山楂1200份，荷叶700份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝900份，人参600份，山楂1000份，荷叶600份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝900份，人参700份，山楂1000份，荷叶700份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝900份，人参700份，山楂1100份，荷叶700份。

在一些实施例中，本发明中的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物，以重量计，包括灵芝950份，人参650份，山楂1100份，荷叶700份。

在一些实施例中，本发明的中药组合物可制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂和散剂等剂型。本发明的中药组合物可以含有药物赋形剂，药物赋形剂可以是溶剂、崩解剂、助悬剂、矫味剂、防腐剂、着色剂中的一种或几种。优选地，所述的药物赋形剂包括羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、糊精、纯化水、乙醇。

本发明的另外一个目的是提供所述中药组合物的制备方法。

本发明公开的治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物的制备方法为：

(1)药材粉碎工艺：

将灵芝、人参、山楂和荷叶四味药材粉碎；

(2)提取浓缩：

粉碎后的灵芝用水煎煮提取得水提液，水提液加乙醇醇沉、过滤、沉淀用水复溶、水溶液用超滤膜超滤分级纯化、超滤组分浓缩成清膏；

(3)提取浓缩：

粉碎后的人参、山楂和荷叶经乙醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附，乙醇解吸附，解吸液浓缩成清膏；

(4)制剂工艺：

取上述(2)和(3)得到的清膏与药学上可接受的载体制备药物制剂。

优选地，所述步骤(2)水提的加水量为灵芝质量的8-10倍，提取2-3次，每次提取1-2小时。

优选地，所述步骤(2)乙醇醇沉时，乙醇体积浓度为混合醇沉液的75-95％。

优选地，步骤(3)所述的乙醇提取所用乙醇体积浓度为50-80％，每次加入量为人参、山楂和荷叶总质量的8-12倍，提取2-3次，每次提取1-2小时。

优选地，步骤(3)所述的人参、山楂和荷叶醇提液经浓缩至无醇味后进行柱层析分离，选用HP-20型大孔吸附树脂，柱径高比为1：8，上样体积9BV，先用5-10BV的纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后采用3-5BV的75％乙醇水溶液解吸，流速为2BV/h，收集解吸液。

优选地，所述步骤(2)中超滤膜元件结构采用卷式、管式、中空式或平板式；超滤膜片材质采用聚丙烯腈、聚砜、醋酸纤维、聚醚砜、磺化聚砜、聚酰亚胺、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚砜、三氧化二铝或氧化锆；超滤膜片截留分子量范围为3kDa～30kDa。

优选地，所述步骤(2)和(3)中的清膏在50-60℃时的相对密度为1.05-1.15。

本发明还公开了所述的中药组合物在制备用于治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

本发明所述的中药组合物可以制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂和散剂中的任一种。

本发明所述的中药组合物还可以包括药物赋形剂，所述药物赋形剂选自溶剂、崩解剂、助悬剂、矫味剂、防腐剂和着色剂中的一种或几种；

优选地，所述的药物赋形剂包括羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、糊精、纯化水、乙醇。

与现有技术相比，该中药组合物的优势在于：

(1)来源于中药复方，经现代分离纯化技术将有效部位进行富集，经细胞水平和动物药效试验均证明有显著改善非酒精性脂肪肝功效，相较于传统中药复方药效更强，机理更清晰。

(2)GLP实验室进行的单次给药毒理试验证实该中药组方安全性高，最大耐受剂量(MTD)>5000mg/kg。

附图说明

图1为中药组合物与棕榈酸共同孵育下细胞油红O染色、细胞内甘油三酯、细胞内总胆固醇含量的变化：(A)中药组合物与棕榈酸共孵育HepG2细胞24h后细胞油红O染色情况；(B)细胞内油红O染料的定量分析；(C)730、1460、2190μg/mL中药组合物与棕榈酸共同处理HepG2细胞24h后细胞内甘油三酯含量变化；(D)730、1460、2190μg/mL中药组合物与棕榈酸共同处理HepG2细胞24h后细胞内总胆固醇含量变化。n＝3，结果以±SD表示。^##p<0.01vs正常组，^*p<0.05vs模型组，^**p<0.01vs模型组。

图2为中药组合物对脂肪变性相关蛋白表达的影响：(A)Western blot检测p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT-1、GAPDH蛋白；(B)Western blot检测SREBP1、FASN蛋白；(C)p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1/GAPDH的比值；(D)SREBP1/GAPDH、FASN/GAPDH的比值。n＝3，结果以±SD表示。^##p<0.01vs正常组，^*p<0.05vs模型组，^**p<0.01vs模型组，^***p<0.001vs模型组。

图3为中药组合物对脂肪堆积HepG2细胞内氧化应激水平的影响：(A)定量HepG2细胞内DCFH荧光强度；(B)激光共聚焦扫描显微镜分析脂肪堆积HepG2细胞内DCF荧光强度，标尺为100μm。n＝3，结果以±SD表示，^##p<0.01vs正常组，^**p<0.01vs模型组。

图4为HepG2细胞内MDA含量。n＝3，结果以±SD表示，^##p<0.01vs正常组，^*p<0.05vs模型组。

图5为中药组合物干预下细胞内SOD、T-AOC水平变化。(A)HepG2细胞中SOD含量；(B)HepG2细胞中T-AOC含量。n＝3，结果以±SD表示。^##p<0.01vs正常组，^###p<0.001vs正常组，^*p<0.05vs模型组，^**p<0.01vs模型组。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1散剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝600份、人参300份、山楂900份和荷叶300份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎，过80目筛。

B提取浓缩和干燥工艺

灵芝加水煎煮提取，加水量为灵芝质量的8-10倍，提取2-3次，每次提取1-2小时，水提液加乙醇醇沉，乙醇终浓度范围75-95％，静置过夜后过滤，沉淀用水复溶，水溶液用超滤膜超滤分级纯化，收集3kDa～30kDa组分，浓缩成50-60℃时相对密度1.05-1.15的清膏；

人参、山楂和荷叶用50-80％乙醇提取，每次加入量为人参、山楂和荷叶总质量的8-12倍，提取2-3次，每次提取1-2小时；醇提液经浓缩至无醇味再用HP-20型大孔吸附树脂吸附，柱径高比为1：8，上样体积9BV，先用5-10BV的纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后采用3-5BV的75％乙醇水溶液解吸附，流速为2BV/h，收集解吸液，解吸液浓缩成50-60℃时相对密度1.05-1.15的清膏。

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成散剂。

实施例2散剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝1200份、人参900份、山楂1200份和荷叶1000份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

参照实施例1

实施例3颗粒剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝800份、人参500份、山楂1200份和荷叶700份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成颗粒剂。

实施例4颗粒剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝1000份、人参700份、山楂900份和荷叶500份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成颗粒剂。

实施例5片剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝800份、人参500份、山楂900份和荷叶500份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成片剂。

实施例6片剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝1000份、人参700份、山楂1200份和荷叶700份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成片剂。

实施例7胶囊剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝900份、人参600份、山楂1000份和荷叶600份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成胶囊剂。

实施例8胶囊剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝900份、人参700份、山楂1000份和荷叶700份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成胶囊剂。

实施例9丸剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝900份、人参700份、山楂1100份和荷叶700份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成丸剂。

实施例10丸剂的制备

A药材粉碎工艺

以重量计，取灵芝950份、人参650份、山楂1100份和荷叶700份，经净选、水洗、灭菌、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。

B提取浓缩和干燥工艺

参照实施例1

C制剂工艺

合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成丸剂。

实施例11

本发明中药组合物对脂肪堆积HepG2细胞脂质代谢的影响

1.材料与方法

1.1材料

HepG2细胞(人肝癌细胞)购买自武汉Procell生命科技有限公司、DMEM高糖培养基购自美国、胎牛血清购自美国Gibco公司、胰酶购自美国sigma公司、棕榈酸购自美国sigma公司、油红O染料购自美国sigma公司、CCK-8试剂盒购自日本同仁化学有限公司、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒购自南京建成生物工程研究所、甘油三酯(TG)试剂盒购自南京建成生物工程研究所、总胆固醇(TC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

中药组合物采用实施例7制备的未加辅料前的提取物。

1.2方法

1.2.1甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量测定

检测细胞内TG、TC指标收集尽可能多数量的细胞。按实验设计处理细胞后，继续培养24h。严格按照TG、TC试剂盒说明书操作。具体步骤如下：

(1)弃掉旧的培养液，用PBS清洗细胞两次，0.25％胰酶消化细胞，用离心法收集细胞沉淀，离心速度为1000r/min，时间10min。收集的细胞沉淀用PBS清洗两次。

(2)细胞沉淀中加入适量RI棕榈酸裂解液，置于冰上30min。裂解好的液体无需其他操作可直接用酶标仪测定。510nm处的吸光度值可反映各孔中TG或TC的含量。同时用BCA法检测样品蛋白浓度，作为TG含量和TC含量的内参。

1.2.2乳酸脱氢酶含量测定

细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)含量可以表征细胞坏死的程度。6孔板中每孔接种5×10⁵～1×10⁶个细胞。按实验设计处理细胞后，继续培养24h。取适量培养上清液，离心处理后取上清。离心速度为1000r/min，时间10min。按照试剂盒说明书进行相应操作，检测仪器为酶标仪。450nm处的吸光度值可反映各孔上清液中LDH含量。因为上清液中LDH含量受细胞数量的影响，同时用BCA法检测样品蛋白浓度，作为LDH含量的内参。

1.2.3油红O染色

将HepG2细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，用棕榈酸与不同浓度中药组合物共处理细胞24h。弃去6孔板中的培养液，PBS洗两次后用37℃下预热的4％多聚甲醛固定细胞30min。用含甘氨酸的PBS洗去多聚甲醛后用0.2％PBS-TritonX-100穿孔细胞5min，PBS洗去穿孔液，进行染色操作。染色前取适量油红O储存液，按3:2的比例将储存液与超纯水混合，混合后用定性滤纸过滤并室温放置10min，以除去杂质，使染色结果更清晰。油红O染液现配现用，注意避光。油红O避光染色30min后，用60％异丙醇和超纯水洗去多余的油红O染料，然后用苏木精复染1min，用水冲洗掉多余苏木精染料后在100倍显微镜下拍片。细胞内油红O染料的定量操作：油红O避光染色30min后，用60％异丙醇和超纯水洗去多余的油红O染料，用异丙醇溶解细胞中的油红O染料，于490nm处测定吸光度。

2.结果

为观察中药组合物对棕榈酸诱导的脂肪堆积HepG2细胞中脂肪积累的影响，我们将不同浓度中药组合物和棕榈酸(200μM)共同处理HepG2细胞24h后进行相关指标检测。

附图1A是HepG2细胞经油红O染料和苏木精染料染色后的显微镜图片。红色代表被油红O染料着色的脂肪液滴，蓝紫色代表被苏木精着色的细胞质基质。由图1A可知，仅棕榈酸处理的细胞中出现显著的脂肪液滴积累，红色最多最深。通过中药组合物处理，HepG2细胞内出现脂肪液滴减少的现象，这一改变在中药组合物浓度为2190μg/mL时尤为突出。图1B是将油红O用异丙醇溶解后在490nm处测定吸光度，其结果与1A一致，中药组合物降低细胞内的脂肪液滴。

附图1C和1D表明棕榈酸显著诱导HepG2细胞中TG和TC积累，中药组合物则可有效降低脂肪堆积HepG2细胞中TG和TC水平，并呈剂量依赖性，与油红O染色结果相吻合。油红O染色实验、TG、TC含量测定均说明中药组合物可以缓解脂肪堆积肝HepG2细胞内脂质的积累。

实施例12

本发明中药组合物对脂肪堆积HepG2细胞脂质代谢调节作用机制的研究

1.材料与方法

1.1材料

HepG2细胞(人肝癌细胞)购买自武汉Procell生命科技有限公司、DMEM高糖培养基购自美国、SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所、T-AOC检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所、ATP试剂盒购自南京建成生物工程研究所、鬼笔环肽购自上海翊圣生物科技有限公司、MDA检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司、活性氧检测试剂盒购自上海翊圣生物有限公司、ECL发光试剂盒购自上海翊圣生物有限公司。

中药组合物采用实施例7制备的未加辅料的提取物。

1.2方法

1.2.1活性氧测定

使用DCFH-DA(2'，7'-二氯二氢荧光素双乙酸酯)活性氧检测试剂盒测定细胞内ROS水平。活性氧检测试剂盒不是利用DCFH-DA的荧光进行检测，检测的是DCF的荧光。不具有荧光的DCFH-DA有很好膜渗透性，进入细胞后形成DCFH，DCFH的形成是通过细胞内酯酶水解DCFH-DA来实现的。然后DCFH与细胞内ROS发生反应产生氧化荧光形式2,7-二氯荧光素(DCF)，通过检测DCF荧光间接探测ROS。

本实验使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别对DCF的荧光强度进行分析。使用流式细胞仪检测活性氧时，细胞处理如下：HepG2细胞接种于6孔板中生长至80％～90％，按上述分组处理HepG2细胞24h。弃去旧液，PBS洗两次，然后将DCFH-DA加入无血清培养基中，使其浓度为10μM。用该培养基孵育HepG2细胞20min，弃掉培养基，用新鲜无血清培养基和PBS各清洗三次后用胰酶消化细胞。离心收集细胞后，用PBS重新悬浮细胞，尽快用流式细胞仪检测。

采用激光共聚焦显微镜分析时，实验步骤如下。处理细胞爬片：细胞爬片是一种圆形载玻片，经过处理后可浸在细胞培养基内，让细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交分析等。处理方法如下：1mol/L盐酸浸泡载玻片24h后，用超纯水冲洗载玻片三次，再用乙醇冲洗载玻片三次。乙醇挥发后，将载玻片置于超净台紫外灭菌半小时。灭菌完毕后将载玻片放入12孔板，每孔加入1mL含多聚赖氨酸的PBS，放入细胞培养箱中24h。接种细胞时除去多聚赖氨酸并用PBS洗三次。

HepG2细胞接种在含载玻片的12孔板中生长至80％～90％，按上述分组处理细胞24h。弃去旧液，PBS洗两次。将DCFH-DA加入无血清培养基，孵育细胞及清洗细胞的操作与上述获取流式细胞仪检测样品的操作一致。清洗完毕后，用4％多聚甲醛固定30min，多余的多聚甲醛用含甘氨酸的PBS洗去。将3～5μL抗荧光淬灭剂滴加到洁净玻璃板上(抗荧光淬灭剂可延长荧光分子寿命，但不宜过多，过多不利于封片处理)，然后将细胞爬片倒扣在玻璃板上，此时抗荧光淬灭剂均匀的弥散开。封片处理完毕后可进行拍摄，使用激光共聚焦显微镜488nm通道。

1.2.2细胞内SOD、T-AOC、MDA含量的测定

按实验设计处理细胞后继续培养24h。严格按照SOD、T-AOC、MDA的说明书进行样品提取和测定，用酶标仪测定各孔吸光度值。其中SOD的测定波长为450nm，T-AOC的测定波长为405nm，MDA的测定波长为532nm。BCA法检测蛋白浓度，SOD含量、T-AOC含量、MDA含量均要以蛋白含量作为内参。

1.2.3线粒体膜电位分析

线粒体膜电位检测常用的荧光探针是JC-1染料。JC-1具有聚集态或单体形式，聚集态发出红色荧光，单体形式是绿色荧光。JC-1的工作原理是存在形式受电势调控，具有电势依赖性。正常线粒体膜电位高，能使JC-1聚集在线粒体基质中。线粒体受损时，线粒体膜电位不足以使JC-1聚集，以单体形式分布在细胞质基质中。JC-1的存在状态可以反映线粒体膜电位高低。罗丹明123(Rhodamine 123)荧光染料也是常用的检测线粒体膜电位探针，发出黄绿色荧光，且能迅速通过细胞膜被具有活性的线粒体捕获。

JC-1探针定量分析细胞线粒体膜电位：HepG2细胞按实验处理后胰酶消化离心收集，重悬于0.5mL培养基中，用0.5mL含JC-1的染色液混匀细胞后放置在细胞培养箱中等待20min。上述操作结束后，将细胞离心取细胞沉淀，注意尽量不要吸除细胞。用JC-1染色缓冲液洗涤细胞2次，洗涤时尽量减少细胞损失。再用适量JC-1染色缓冲液重悬细胞，进行流式细胞仪分析。

罗丹明123染料定性分析细胞线粒体膜电位：HepG2细胞接种在含载玻片的12孔板中生长至80％～90％，按上述分组处理细胞24h。弃去旧液，PBS洗两次，用含罗丹明123染料的无血清培养基孵化HepG2细胞，置于细胞培养箱中10min。然后弃掉含罗丹明123染料的无血清培养基，用新鲜无血清培养基和PBS各清洗三次。清洗完毕后，用4％多聚甲醛固定30min，多余的多聚甲醛用含甘氨酸的PBS洗去。0.2％PBS-TritonX-100穿孔5min后用含鬼笔环肽(Phalloidin)和DAPI的PBS染色细胞10min(染色细胞时注意避光)，封片。样品制备完毕后使用激光共聚焦显微镜拍摄，分别设置405nm(DAPI)，488nm(Rh 123)，561nm(Phalloidin)三个荧光通道。

1.2.4 ATP含量测定

6孔板中接种处于对数生长期的HepG2细胞，密度为5×10⁵～1×10⁶/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育培养。测定ATP含量实验中尽可能收集多的细胞。按实验要求处理细胞后继续培养24h。ATP的测定原理是：肌酸激酶催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸。严格按照ATP说明书进行样品提取和测定，用酶标仪测定各孔吸光度值，ATP测定波长为636nm。BCA法检测蛋白浓度，ATP含量要以蛋白含量作为内参。

2.结果

2.1中药组合物调控AMPK信号通路

AMP活化蛋白激酶(AMPK)因其在调节生物能量代谢中的核心作用而受到广泛关注和研究。固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和乙酰辅酶a羧化酶(ACC)都是AMPK的下游因子，在肝脏脂质合成中起调节作用。SREBP1通过作用于脂肪酸合成酶(FASN)调节甘油三酯和游离脂肪酸的代谢。磷酸化AMPK(p-AMPK)抑制SREBP1的表达，增加磷酸化ACC(p-ACC)的表达。ACC的负反馈增强肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)的活性，CPT-1是脂肪酸氧化过程中的一种限速酶，具体作用是催化脂肪酸转运至线粒体基质进行β氧化。

如说明书附图2用Western blot的方法揭示了中药组合物对HepG2细胞内AMPK及下游蛋白的调控。使用灰度分析软件Image J分析目标蛋白和内参蛋白，蛋白表达的多少用目标蛋白与内参蛋白(如GAPDH)的比值表示；对于磷酸化的蛋白，也采用磷酸化蛋白与非磷酸化的蛋白的比值表示。棕榈酸诱导的HepG2细胞中，p-AMPK、p-ACC和CPT-1蛋白的表达均下降，SREBP1和FASN的表达上升，这与脂代谢失衡肝细胞中AMPK活性降低是一致的。然而，在中药组合物干预的HepG2细胞中，AMPK和ACC磷酸化水平提高，ACC的磷酸化会使ACC失活，从而降低细胞内脂肪酸合成。此外，受ACC负反馈调节的CPT-1表达提高，CPT-1表达增加有利于脂肪酸氧化，从而缓解脂肪积累。与模型组相比，中药组合物处理还降低SREBP1和FASN的表达，有利于减少细胞内脂肪合成。这些结果均表明中药组合物可以通过调节AMPK信号通路缓解脂肪积累。

2.2中药组合物对脂肪堆积HepG2细胞氧化应激水平的影响

氧化应激的原因是活性氧(ROS)过度积累，包括超氧阴离子、羟基自由基及其衍生物，如过氧化物。本工作使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别对HepG2细胞中ROS水平进行分析。如说明书附图3A和3B所示，棕榈酸升高HepG2细胞内ROS水平，中药组合物则降低棕榈酸诱导下HepG2细胞内ROS水平。综上，中药组合物可以降低棕榈酸诱导下HepG2细胞内ROS水平，从而保护线粒体。

丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是脂质过氧化产物，是评价氧化损伤的主要指标。说明书附图4是不同处理条件下HepG2细胞内MDA含量。由图4可知，棕榈酸显著诱导细胞内脂质过氧化，MDA含量增加；中药组合物干预可降低丙二醛含量，结果与中药组合物降低HepG2细胞内ROS水平一致。ROS和MDA两项指标都表明中药组合物能降低HepG2细胞内氧化应激水平。

2.3中药组合物对脂肪堆积HepG2细胞抗氧化水平的影响

测定了HepG2细胞中SOD、T-AOC的含量，结果如说明书附图5所示，棕榈酸处理降低HepG2细胞中SOD、T-AOC水平，细胞抗氧化系统受损；中药组合物与棕榈酸共同孵育下，SOD、T-AOC水平提高，表明中药组合物可提高棕榈酸诱导下HepG2细胞的抗氧化水平。

实施例13

本发明中药组合物对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能异常的治疗作用

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：健康雄性SD大鼠60只，体重160±10g，SPF级，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，合格证号SCKX(苏)2018-0008。给予标准食物，自由饮水，保持光照和避光循环饲养；实验开始前保持室内饲养7天。

1.1.2高脂饲料：高脂饲料由35％普通饲料粉、25％猪油、20％蛋黄粉、5％奶粉、10％蔗糖、3％胆固醇和2％胆酸钠配制而成。

1.2方法

1.2.1采用实施例7制备的未加辅料的本发明中药组合物灌胃给药。

1.2.2动物模型的建立和分组：

将大鼠随机分为2组，空白组大鼠(15只)喂饲普通饲料，其余大鼠(45只)喂饲高脂饲料，自由摄食、饮水，饲养于复旦大学药学院药效评价动物实验中心。连续喂养5周后，从空白组和脂肪肝模型组分别处死5只大鼠，比较两组大鼠的血清和肝脏生化指标，判断非酒精性脂肪肝模型大鼠是否建立成功。

1.2.3药物干预：将造模成功大鼠40只随机分为4组，每组10只，分别为模型组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组和中药组合物低剂量组，组间大鼠体重无显著性差异(P>0.05)。高、中、低剂量组分别以1000mg/kg/d、500mg/kg/d和250mg/kg/d中药组合物灌胃给药，空白组、模型组予以生理盐水灌胃。给药期间，空白组以标准饲料喂养，其余组以高脂饲料喂养。喂养期间，实验动物自由饮水和进食，动物房保持安静，自然采光，温度25℃。喂养5周。

1.2.4标本采集：所有大鼠在末次给药后禁食不禁水12h，大鼠称重，然后用10％水合氯醛以0.35ml/100g浓度腹腔注射麻醉，腹主动脉取血8ml，4℃，3000rpm离心10min，分离血清。-20℃保存。

1.2.5指标检测：血脂、肝功能全自动生化分析仪分析。

1.2.6统计分析：采用SPSS10.0软件单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1一般观察

一般情况观察高脂饲料喂养大鼠前期食量大于空白组，体重增加较快，后期食量减小，活动量减少。各组高脂饮食喂养大鼠5周后反应较正常空白组迟钝，毛色发黄，失去光泽，喜扎堆，懒动且摄食量逐渐减少。灌胃给药本发明中药组合物治疗后毛色逐渐恢复正常，行为活动增加。

2.2各组大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)比较。

各组实验大鼠TG、TC、LDL-C和HDL-C的变化见表1。

表1.中药复方组合物对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影响(x±s，n＝10)

结果以平均值±SD表示，^#p<0.05vs.空白组，*p<0.05vs.模型组，**p<0.01vs.模型组。

由表1可知，模型组与空白组相比均有显著性差异(p<0.05)，说明造模成功。大鼠灌胃给予高脂饲料后血中TG数值均显著升高，给予本发明中药组合物治疗后，TG数值降低，统计学处理表明，与模型组相比，本发明中、高剂量组组TG数值均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。大鼠灌胃给予高脂饲料后血中TC数值均显著升高，给予本发明中药组合物治疗后，TC数值降低，统计学处理表明，与模型组相比，本发明高剂量组TC数值有显著性差异(P<0.05)。大鼠灌胃给予高脂饲料后血中HDL-C数值显著降低，给予本发明中药组合物治疗后，HDL-C数值升高，统计学处理表明，与模型组相比，本发明中药组合物中、高剂量组HDL-C数值均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。大鼠灌胃给予高脂饲料后血中LDL-C数值显著升高，给予本发明中药组合物治疗后，LDL-C数值降低，统计学处理表明，与模型组相比，本发明中药组合物中、高剂量组LDL-C数值均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。

实施例14

本发明中药组合物大鼠单次给药毒理研究(GLP)

1.材料与方法

去离子水从研究机构Millipore Elix35获取。质量由该仪器运行参数符合SOP规定的正常运行标准来保障。中药组合物采用实施例7制备的未加辅料的提取物。

称取需要量的供试品中药组合物(无需折算校正因子)至合适的容器中，加入适量的去离子水，搅拌超声至均一，定容至指定体积，搅拌至均一，得到棕褐色混悬液。给药制剂室温保存，密封备用。

48只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF级)，雌雄各半，购于浙江维通利华实验动物技术有限公司。转入美迪西普亚医药科技(上海)有限公司动物储备库999M-017中。实验动物质量合格证编号No.20210426Aazz0619000987，动物质量检测单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证编号为SCXK(浙)2019-0001，由浙江省科学技术厅签发。大鼠购入时动物年龄约为5-8周，接入当天进行一次详细临床观察，未见异常。体重在给药前一天随机分组时称量，雄性动物的体重范围为230.2～314.5g；雌性动物的体重范围为208.1～232.9g。

挑选40只Sprague-Dawely大鼠，SPF级，雌雄各半，各20只。随机分组动物体重范围分别为雄性230.2～314.5g，雌性208.1～232.9g。按性别和体重大小通过简单随机分配为4组。第1组为去离子水对照组(剂量为0mg/kg)，第2-4组为中药组合物低、中、高剂量组(剂量依次为1250、2500、5000mg/kg)。每组雌雄各5只动物，给药方式均为经口灌胃给药，给药体积10mL/kg，给药一次，观察期14天。给药当天计为实验Day 1。

接收进入当天对所有动物进行1次体检和1次详细临床观察。实验期间除解剖当天，每天进行两次笼边观察。实验期间每天进行一次详细临床观察。动物体重在分组当日(Day-1)、Day 1(给药前)、Day 3、Day 7、Day 14和Day 15(隔夜禁食约16h)测定并记录；于第2(Day 2～Day 3)、4(Day 4～Day 5)、6(Day 6～Day 7)、8(Day 8～Day 9)、10(Day 10～Day 11)、12(Day 12～Day 13)天测定每笼动物(24±1小时)的耗食量并记录。

第1-4组动物在实验终期(Day 15)使用二氧化碳吸入麻醉再颈椎脱臼或腹主动静脉放血的方法确保动物死亡，进行大体解剖检查，观察所有脏器并记录。

2.结果

2.1动物死亡情况

所有试验动物均存活到试验结束。

2.2详细临床观察

2500mg/kg组个别雌雄动物见鼻周红色分泌物，5000mg/kg组部分雄性动物见眼周或鼻周红色分泌物。其余各组动物未见异常。

2.3体重

供试品各剂量组动物实验过程中体重稳定增长，未见统计学差异。

2.4耗食量

供试品各剂量组耗食量与溶媒组相比，未见明显差异。

2.5大体解剖

实验期末(Day 15)供试品各剂量组动物的脏器肉眼观察均未见异常。

在本试验条件下，SD大鼠单次经口灌胃给予1250、2500和5000mg/kg的中药组合物，各给药组动物均存活到实验结束，各剂量组动物详细临床观察、体重和耗食量未见明显异常。大体解剖后脏器肉眼观察无异常。在本试验条件下，SD大鼠最大耐受剂量(Maximaltolerance dose，MTD)＞5000mg/kg，安全性高。

本发明已经通过上述实施例进行了说明。但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。本领域技术人员根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。

Claims

1.一种中药组合物，其特征在于，以重量计，包括灵芝600～1200份、人参300～900份、山楂900～1200份、荷叶300～1000份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，以重量计，包括灵芝800～1000份、人参500～700份、山楂900～1200份、荷叶500～700份。

3.根据权利要求1-2任一项所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将灵芝、人参、山楂、荷叶粉碎；

(2)粉碎后的灵芝用水煎煮提取得水提液，水提液加乙醇醇沉、过滤、沉淀用水复溶、水溶液超滤分级纯化、超滤组分浓缩成清膏；超滤膜片截留分子量范围为3kDa～30kDa。

(3)粉碎后的人参、山楂和荷叶经乙醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附，乙醇水溶液解吸附，解吸液浓缩成清膏；

(4)取上述(2)和(3)得到的清膏与药学上可接受的载体制备药物制剂。

4.根据权利要求3所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)水提的加水量为灵芝质量的8-10倍，提取2-3次，每次提取1-2小时。

5.根据权利要求3所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中乙醇醇沉时，乙醇体积浓度为混合醇沉液的75-95％。

6.根据权利要求3所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的乙醇提取所用乙醇体积浓度为50-80％，每次加入量为人参、山楂和荷叶总质量的8-12倍，提取2-3次，每次提取1-2小时。

7.根据权利要求3所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的人参、山楂和荷叶醇提液经浓缩至无醇味后进行柱层析分离，选用HP-20型大孔吸附树脂，柱径高比为1：8，上样体积9BV，先用5-10BV的纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后采用3-5BV的75％乙醇水溶液解吸，流速为2BV/h，收集解吸液。

8.根据权利要求3所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的清膏在50-60℃时的相对密度为1.05-1.15。

9.一种根据权利要求1或2所述的中药组合物在制备用于治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

所述中药组合物还包括药物赋形剂，所述药物赋形剂选自溶剂、崩解剂、助悬剂、矫味剂、防腐剂和着色剂中的一种或几种；

10.一种根据权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物可以制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂和散剂中的任一种。