CN113917045B - 气相色谱-氢焰检测器定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法 - Google Patents

气相色谱-氢焰检测器定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及气相色谱‑氢焰检测器定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法，通过氢氧化钠溶液浸泡使酰胺生物碱从烟末样品基质中游离出来，通过甲基叔丁基醚的萃取将目标化合物转入醚层，取甲基叔丁基醚萃取液浓缩后进行气相色谱‑氢火焰离子检测器分析，将仪器获得的色谱峰面积输入对应的酰胺生物碱的标准校准曲线拟合方程，得到对应的目标化合物浓度，通过换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量。该方法可同时定量分析11种酰胺生物碱，具有简单、快速、稳定等优势。填补了目前不存在定量分析烟叶中11种酰胺生物碱的方法的空白，在此基础上可发展多种应用。

Description

气相色谱-氢焰检测器定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及基于气相色谱-氢火焰离子检测器的烟叶中11种酰胺生物碱的同时定量分析方法及烟叶分析方法。
背景技术
由于烟叶中的安全和品质与人类的健康息息相关，因此烟草中各类成分的研究一直深受人们的重视，但由于烟草的生产加工和储存中化学反应比较复杂，其中的化学物质的变化复杂多样，因此很多成分并没有清楚的认识。目前已有研究发现烟草中与去甲基尼古丁相关的化合物酰胺生物碱，但其定量分析方法和应用尚没有开发。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种气相色谱-氢火焰离子检测器定量分析烟叶中11种酰胺生物碱方法，通过氢氧化钠溶液浸泡使去甲基尼古丁及其酰基代谢物从样品基质中游离出来，通过加入甲基叔丁基醚的萃取将目标化合物转入醚层，取甲基叔丁基醚层后进行气相色谱-氢火焰离子检测器分析，可同时测定烟叶中11种酰胺生物碱的含量，进而通过酰胺生物碱的含量对烟叶进行分析。
本发明的技术方案：
一种气相色谱-氢焰检测器定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法，其特征在于通过氢氧化钠溶液浸泡使酰胺生物碱从烟末样品基质中游离出来，通过甲基叔丁基醚的萃取将目标化合物转入醚层，取甲基叔丁基醚萃取液浓缩后进行气相色谱-氢火焰离子检测器分析，将仪器获得的色谱峰面积输入对应的酰胺生物碱的校准曲线方程，得到对应的目标化合物浓度，通过换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量。
优选的，包括以下步骤：
步骤一、样品前处理：通过氢氧化钠溶液浸泡释放所述烟末样品基质中的酰胺生物碱，采用甲基叔丁基醚萃取释放的酰胺生物碱，通过对所述甲基叔丁基醚萃取液进行浓缩使目标酰胺生物碱能被仪器检测到；
步骤二、确定仪器分析条件，包括色谱条件和检测器条件；
步骤三、标准曲线绘制，得到11种酰胺生物碱的的标准曲线拟合方程和线性相关系数；将步骤一中的所述甲基叔丁基醚萃取液的浓缩液按照步骤二的条件进行气相色谱-氢火焰离子分析，得到实际烟叶样品中酰胺生物碱的色谱峰面积，输入对应的所述标准曲线拟合方程，得到对应的目标化合物浓度，通过换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量。
进一步优选的，所述步骤三包括以下步骤：
S31、标准溶液配制：分别称取去甲基尼古丁的11种酰基代谢物100mg置于不同的10mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容，配成10mg/mL的单标储备液，分别取1mL 10mg/mL的单标储备液至同一个100mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容，配制成100ug/mL的混标溶液；以此混标为标准曲线浓度上限，逐级稀释混标溶液10次，每次稀释为原来的1/2浓度，配制成11个不同浓度的标准混合溶液；
S32、按照步骤二所设定的条件采用气相色谱-氢火焰离子检测器进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，并将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线拟合方程和线性相关系数；
S33、将步骤一中的所述甲基叔丁基醚萃取液的浓缩液按照步骤二的条件进行气相色谱-氢火焰离子检测器分析，得到实际烟叶样品中所含酰胺生物碱的色谱峰面积，输入对应的所述校准曲线拟合方程，得到对应的物质浓度，单位ug/mL；
S34、通过公式(1)换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量：
X＝c/5 (1)
式中：X代表样品中11种酰胺生物碱的含量，单位μg/g；c代表标准曲线得出的被测组分的浓度，单位μg/mL。
优选的，所述步骤一中，所述烟末样品的称样量为4-6g，所述氢氧化钠溶液的用量为18-22mL，所述氢氧化钠溶液的浓度为2-8％，所述甲基叔丁基醚用量为2×8-12mL，合并甲基叔丁基醚提取液并浓缩至1mL，将浓缩液转入2mL气相色谱进样小瓶，上气相色谱仪分析。
进一步优选的，烟叶样品首先经烘干、粉碎和过筛处理，得到所述烟末样品，烘干温度30-50℃，过筛尺寸为30-60目。
优选的，所述步骤二中确定的仪器分析条件为：
色谱条件：色谱柱，DB-1701，30m×0.25mm×0.25μm；进样量，1μL；分流比，20:1；进样口温度，250℃；升温程序条件：110℃开始，10℃/min升至185℃，然后6℃/min升至245℃，保持15min；
检测器条件：氢火焰离子检测器，氢气流量，35mL/min；空气流量，350mL/min；尾吹气氮气流量，40mL/min；数据采集频率，10Hz。
一种烟叶分析方法，其特征在于选取不同烟叶样品，定量分析烟叶酰胺生物碱含量，根据相同酰胺生物碱含量的样品与特定烟叶风味的对应性建立数据库，所述定量分析采用前述的定量分析方法。
本发明的有益技术效果如下：
本发明的一种气相色谱-氢火焰离子检测器定量分析烟叶中11种酰胺生物碱方法，通过对烟叶进行前处理的方法和气相色谱-氢火焰离子检测器条件的优化，建立了11种酰胺生物碱的同时定量分析方法。该方法具有简单、快速、稳定等优势。填补了目前不存在定量分析烟叶中11种酰胺生物碱的方法的空白。
进一步的，降烟碱去甲基尼古丁的仲胺氮原子具有一定的活性，易与有机酸结合，形成酰胺生物碱。由于具有致癌性的去甲基尼古丁亚硝胺(NNN)也来源于降烟碱，也即酰胺生物碱的生成消耗了烟叶中去甲基尼古丁的含量，因此本发明可实现通过酰胺生物碱的定量分析来进一步分析NNN的含量。另一方面，经研究发现，所形成的酰胺生物碱对烟叶的风格特征也会产生影响。因此，通过对相同酰胺生物碱含量的烟叶的风味分析，可以建立酰胺生物碱与风味的对应数据库，从而可以在原料选择、生产工艺设定中起到参考作用。因此，本发明准确定量烟叶中去甲基尼古丁的酰基化产物对于评价烟叶的安全和品质，开展尼古丁相关代谢研究具有重要的意义。
附图说明
图1为11种酰胺生物碱的化学结构；
图2为11种酰胺生物碱的气相色谱-氢火焰离子检测器分离色谱图。
附图标记：1-N’-甲酰去甲基尼古丁；2-N’-乙酰去甲基尼古丁；3-N’-丙酰去甲基尼古丁；4-N’-正丁酰去甲基尼古丁；5-N’-正戊酰去甲基尼古丁；6-N’-正己酰去甲基尼古丁；7-N’-正庚酰去甲基尼古丁；8-N’-正辛酰去甲基尼古丁；9-N’-正壬酰去甲基尼古丁；10-N’-正癸酰去甲基尼古丁；11-N’-正十一酰去甲基尼古丁。
具体实施方式
为了便于理解本申请的技术方案，下面将通过具体实施例结合附图1-2详细说明。
实施例1和2中使用的仪器与试剂为：
气相色谱-氢火焰离子检测器仪(美国Thermo公司)、Millipore超纯水机(美国Millipore公司)，Talboys数显型多管式旋涡混合器(美国Troemner公司)。
实验试剂：晾晒后的白肋烟和香料烟的烟叶；氢氧化钠(分析纯，广东汕头市西陇化工厂)；甲基叔丁基醚(色谱纯，北京百灵威生物有限公司)。
实施例1
本实施例为一种气相色谱-氢火焰离子检测器对硃砂烟烟叶中11种酰胺生物碱的同时定量分析方法，11种酰胺生物碱的化学结构如图1所示。
实验步骤：
步骤一、样品前处理：提取待分析烟叶样品中所含的酰胺生物碱。
白肋烟烟叶样品40℃烘干，粉碎过40目筛，待测。准确称取5.00g香料烟烟末样品于50mL离心管中，加入20mL 5％的NaOH溶液，涡旋振荡1min，静置10min，加入2×10mL甲基叔丁基醚进行液液萃取，合并甲基叔丁基醚提取液并浓缩至1mL，将浓缩液转入2mL气相色谱进样小瓶，上气相色谱仪分析。
步骤二、确定仪器分析条件。
色谱条件：色谱柱，DB-1701(30m×0.25mm×0.25μm)；进样量，1μL；分流比，20:1；进样口温度，250℃。升温程序条件：110℃开始，10℃/min升至185℃，然后6℃/min升至245℃，保持15min。
检测器条件：氢火焰离子检测器，氢气流量，35mL/min；空气流量，350mL/min；尾吹气(氮气)流量，40mL/min；数据采集频率，10Hz。
检测限和定量限：由于去甲基尼古丁的酰基代谢物属于内源性代谢物，无法找到没有这些代谢物的空白样品基质，本实验以混标溶液逐级稀释上机分析，观察低浓度样品的仪器响应，以3倍信噪比和10倍信噪比为标准确定目标化合物的检测下限和定量下限。本实验中11种去甲基尼古丁酰基代谢物的检测限和定量限见表1。
步骤三、标准曲线定量：
分别准确称取去甲基尼古丁的11种酰基代谢物100mg置于不同的10mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容，配成10mg/mL的单标储备液，-20℃避光保存。分别取1mL 10mg/mL的单标储备液至同一个100mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容，配制成100ug/mL的混标溶液。以此混标为标准曲线浓度上限，逐级稀释(每次稀释为原来的1/2浓度)混标溶液10次，配制成11个不同浓度的标准混合溶液。
将配置好的不同浓度的标准混合溶液上机分析，获得目标化合物在不同浓度的响应强度。将化合物的响应强度和所对应的浓度进行线性拟合，得到化合物的定量标准曲线线。将配置好的不同浓度的标准混合溶液上机分析，获得目标化合物在不同浓度的响应强度。将化合物的响应强度和所对应的浓度进行线性拟合，得到化合物的定量标准曲线(表1)。
表1去甲基尼古丁的11种酰基代谢物的定量校正曲线及检出限和定量限
Figure BDA0003359689610000041
Figure BDA0003359689610000051
将制好的样本按照步骤一和步骤二的部分所述方法进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱峰面积。将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线拟合方程和线性相关系数。将得到的实际样品中去甲基尼古丁的11种酰基代谢物的色谱峰面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度(ug/mL)。按照公式(1)计算去甲基尼古丁的11种酰基代谢物在烟叶中的含量：
X＝c/5 (1)
式中：X代表样品中去甲基尼古丁的11种酰基代谢物的含量，单位为微克每克(μg/g)；c代表标准曲线得出的被测组分的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)。计算得到白肋烟去甲基尼古丁的11种酰基代谢物含量如下文表2。
实施例2
本实施例为一种气相色谱-氢火焰离子检测器对香料烟烟叶中11种酰胺生物碱的同时定量分析方法，实验步骤同实施例1。
计算得到香料烟烟叶的11种酰胺生物碱含量，如表2所示。
从表2中可以看出，香料烟中N’-甲酰去甲基尼古丁、N’-乙酰去甲基尼古丁、N’-己酰去甲基尼古丁、N’-庚酰去甲基尼古丁、N’-甲辛酰去甲基尼古丁、N’-壬酰去甲基尼古丁、N’-正十一酰去甲基尼古丁高于白肋烟，而其它酰基代谢物含量低于白肋烟。
表2白肋烟和香料烟中去甲基尼古丁的11种酰基代谢物的含量分布情况。
Figure BDA0003359689610000052
Figure BDA0003359689610000061
实施例3
对于同批次烟叶，在经历不同的加工方法或储存条件后，采用前述实施例的方法定量分析酰胺生物碱的含量，含量越高，说明该加工方法或储存条件促进了降烟碱向酰胺生物碱的转化，可以用来辅助选择合适的加工方法或储存条件。
实施例4
选取不同产地或农艺处理的烟叶样品，采用前述实施例的方法，定量分析烟叶酰胺生物碱含量。
根据相同酰胺生物碱含量的样品与特定烟叶风味的对应性建立数据库。
例如，当某烟叶测试如表2左栏数据时，其适合加工成白肋烟风味的烟。
后续只需测定生物碱含量即通过数据库确定风味，无需人工筛选。
以上详细描述了本发明的有代表性的实施例，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，对于本领域技术人员而言显而易见的改变和组合，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种气相色谱-氢焰检测器定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法，其特征在于通过氢氧化钠溶液浸泡使酰胺生物碱从烟末样品基质中游离出来，通过甲基叔丁基醚的萃取将目标化合物转入醚层，取甲基叔丁基醚萃取液浓缩后进行气相色谱-氢火焰离子检测器分析，将仪器获得的色谱峰面积输入对应的酰胺生物碱的校准曲线方程，得到对应的目标化合物浓度，通过换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量，
所述11种酰胺生物碱为
Figure FDA0004211088900000011
色谱条件：色谱柱，DB-1701，30m×0.25mm×0.25μm；进样量，1μL；分流比，20:1；进样口温度，250℃；升温程序条件：110℃开始，10℃/min升至185℃，然后6℃/min升至245℃，保持15min；
检测器条件：氢火焰离子检测器，氢气流量，35mL/min；空气流量，350mL/min；尾吹气氮气流量，40mL/min；数据采集频率，10Hz。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、样品前处理：通过氢氧化钠溶液浸泡释放所述烟末样品基质中的酰胺生物碱，采用甲基叔丁基醚萃取释放的酰胺生物碱，通过对所述甲基叔丁基醚萃取液进行浓缩使目标酰胺生物碱能被仪器检测到；
步骤二、确定仪器分析条件，包括色谱条件和检测器条件；
步骤三、标准曲线绘制，得到11种酰胺生物碱的标准曲线拟合方程和线性相关系数；将步骤一中的所述甲基叔丁基醚萃取液的浓缩液按照步骤二的条件进行气相色谱-氢火焰离子分析，得到实际烟叶样品中酰胺生物碱的色谱峰面积，输入对应的所述标准曲线拟合方程，得到对应的目标化合物浓度，通过换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤三包括以下步骤：
S31、标准溶液配制：分别称取11种酰胺生物碱100mg置于不同的10mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容，配成10mg/mL的单标储备液，分别取1mL 10mg/mL的单标储备液至同一个100mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容，配制成100ug/mL的混标溶液；以此混标为标准曲线浓度上限，逐级稀释混标溶液10次，每次稀释为原来的1/2浓度，配制成11个不同浓度的标准混合溶液；
S32、按照步骤二所设定的条件采用气相色谱-氢火焰离子检测器进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，并将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线拟合方程和线性相关系数；
S33、将步骤一中的所述甲基叔丁基醚萃取液的浓缩液按照步骤二的条件进行气相色谱-氢火焰离子检测器分析，得到实际烟叶样品中所含酰胺生物碱的色谱峰面积，输入对应的所述校准曲线拟合方程，得到对应的物质浓度，单位ug/mL；
S34、通过公式(1)换算得到对应的酰胺生物碱在烟叶中的含量：
X＝c/5(1)
式中：X代表样品中11种酰胺生物碱的含量，单位μg/g；c代表标准曲线得出的被测组分的浓度，单位μg/mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤一中，所述烟末样品的称样量为4-6g，所述氢氧化钠溶液的用量为18-22mL，所述氢氧化钠溶液的浓度为2-8％，合并甲基叔丁基醚提取液并浓缩至1mL，将浓缩液转入2mL气相色谱进样小瓶，上气相色谱仪分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于烟叶样品首先经烘干、粉碎和过筛处理，得到所述烟末样品，烘干温度30-50℃，过筛尺寸为30-60目。
6.一种烟叶分析方法，其特征在于选取不同烟叶样品，定量分析烟叶酰胺生物碱含量，根据相同酰胺生物碱含量的样品与特定烟叶风味的对应性建立数据库，所述定量分析采用1-5任一所述的权利要求的方法。
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