CN113913555A - 一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒，涉及芸薹黄化病毒检测技术领域。本发明提供的检测引物组可以实现特异性的芸薹黄化病毒的检出，该引物组具有灵敏度高的技术优势。本发明提供的检测卡具有检测快捷的优势，可以初步确定目标样本是否感染芸薹黄化病毒。将二者结合后的GICA‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法，具有操作方便、准确性高、适用性好的技术优势。

Description

一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及芸薹黄化病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒。

背景技术

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi为唇形科多年生草本植物，是我国常用的大宗药材之一,其性寒、味苦，归肺、胆、脾、大肠、小肠经；具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效。黄芩具有显著的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、心血管保护等药理作用,常用于治疗湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽等症。野生黄芩主要分布于我国长江以北大部分地区，河北承德为其道地产区，素有“热河黄芩”之称。

随着人工种植规模和地域的不断扩大及连年种植，黄芩种源退化，种子质量下降，严重影响了农民收入，已成为制约我国中药材产业发展及乡村振兴的关键瓶颈。目前，关于黄芩病害的研究，主要集中在5种真菌病害上，分别为白粉病Erysiphe cichorocearum DC、根腐病Fusarium spp、茎枯病Phoma asparage Sacc、灰霉病Botrytis cinerea Pers和灰斑病Phyllosticta menthae Bres，而对于病毒病害的研究报道则相对较少。

病毒病也是一种极为严重的植物病害，防治困难，素有“植物癌症”之称。植物感染病毒后，种性退化，抗性减弱，更易受到真菌、细菌等其他病原物的侵害，田间往往多种病害复合发生，造成更为严重的损失。发明人2020年对甘肃省陇西县种植的黄芩病毒病害做了初步的调查和检测，在部分样品中利用小RNA测序技术(small RNA sequencing，sRNA-seq)鉴定到了芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus,BrYV)，系黄芩中首次发现有BrYV感染。黄芩感染BrYV等病毒后，植株矮化，叶片出现严重的黄化和坏死斑等症状，产量减少，品质降低，严重影响了药材质量。

目前，针对BrYV病毒的检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，但该方法程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足黄芩种植现场及田间快速检测的需求。对于以种子繁殖的黄芩作物，种子质量是产业发展的关键，而种子的病毒含量低，RNA提取难度大，因此依赖于核酸提取的RT-PCR技术检测的准确性受到影响，常出现假阴性结果，急需开发出适用于种子病毒病害快速、灵敏检测的新技术或新方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒以解决上述技术问题。

BrYV是黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(poleroviruses)的重要成员，本属病毒不能单独通过机械接种的方式进行传播，只能通过蚜虫以持久巡回非增殖的方式进行传播。BrYV能够侵染油菜、花椰菜、卷心菜、本生烟和拟南芥等多种植物，引起严重的病害并导致作物减产。

BrYV是正义单链RNA病毒，病毒基因组的3’末端没有poly(A)结构，5’末端有VPg(Virus genome-linked protein,VPg)。病毒粒子成球形，大小在25-30nm之间。BrYV基因组包含7个开放式阅读框(Open reading frame,ORF)，ORF0编码的P0蛋白是一种基因沉默抑制子。外壳蛋白(Coat protein,CP)由ORF3编码。ORF1编码蛋白酶，解旋酶和VPg基序，ORF1和ORF2编码P1-P2融合蛋白与病毒的复制相关。ORF3a编码的3a蛋白和ORF4编码的MP蛋白与病毒的运动相关。RTP蛋白是ORF5由ORF3通过通读策略产生的，与蚜虫的持久巡回非增殖的传播方式，病毒积累和韧皮部局限相关。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种用于芸薹黄化病毒检测的引物组合物，其包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB。

上述引物可以用于DNA环介导等温扩增反应，发明人通过设计特异性内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，靶向芸薹黄化病毒目的序列六个特异性区域，借助聚合酶可以完成扩增反应，从而能在较短的时间内获得10⁹-10¹⁰个拷贝。无需基因扩增仪等分子生物学仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势。

本发明还提供了一种芸薹黄化病毒的检测卡，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，胶体金结合垫上含有胶体金-芸薹黄化病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，检测T线包被有BrYV的抗体IgG，质控C线包被有抗BrYV抗体的二抗；检测T线上BrYV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；抗BrYV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；

胶体金结合垫上的芸薹黄化病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含16-18μg的芸薹黄化病毒抗体。

检测卡上包被的抗体可以自制或选自市售的抗体。

检测卡可以实现芸薹黄化病毒的快速检测，可用于芸薹黄化病毒的初筛。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，卡槽具有放置衬板的安装腔，衬板与下壳体的内壁固定连接，上壳体与下壳体固定连接。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，加样窗空间上位于样品垫的上方，反应观察窗空间上位于硝酸纤维素膜的上方。为了便于观察测试卡的显色情况，可以设置反应观察窗呈透明色。加样窗的形状可以设置为倒锥形以便于集液于样品垫上。

在本发明应用较佳的实施方式中，上壳体与下壳体通过卡扣结构卡接。

本发明还提供了一种用于检测芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其包括上述的芸薹黄化病毒的检测卡和用于芸薹黄化病毒检测的引物组合物。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO₄、DNA聚合酶和水；在本发明应用较佳的实施方式中，反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

在本发明应用较佳的实施方式中，阴性对照品为水，阳性对照品为芸薹黄化病毒外壳蛋白CP基因片段标准品。

黄芩BrYV CP基因片段标准品的序列如下：

AGTCGTGGGGTAGAGAACAATCAATGGAAGAAGACGACCACGCAGGCAAACAAGGCGCATTCAGCGAAATCAGCCAGTGGTTGTGGTCCAAACCTCTCGGACAACACAACGCCGACCTAGACGACGACGAAGAGGTAACAACCGGACAGGAAGAACTGTTCCTACCAGAGGAGCAGGTTCGAGCGAGACATTTGTTTTCTCAAAAGACAATCTCGCGGGAAGTTCCAGCGGAGCAATCACGTTCGGGCCGAGTCTATCAGACTGCCCGGCATTCTCTAATGGAATGCTCAAGGCCTACCATGAATATAAGATCTCAATGGTCATTCTGGAGTTCGTCTCCGAGGCCTCTTCCCAAAATTCCGGTTCCATCGCTTACGAGCTGGACCCACACTGTAAACTCAATTCACTCTCTTCCCACGATTAA。

DNA聚合酶为适合等温扩增的聚合酶，在本发明应用较佳的实施方式中，DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶。

本发明还提供了一种采用芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒检测芸薹黄化病毒的检测方法，其包括：

(1)取待测溶液上样至芸薹黄化病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有芸薹黄化病毒BrYV；

(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有芸薹黄化病毒BrYV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有芸薹黄化病毒。RT-LAMP扩增的反应条件为：58-66℃恒温水浴中扩增60-100min，随后80℃变性10min，终止反应。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有BrYV的具体方法为肉眼观察法；肉眼观察法为：

若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有芸薹黄化病毒BrYV，无需进行反转录RT-LAMP扩增；

若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染芸薹黄化病毒BrYV，或感染芸薹黄化病毒BrYV的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有芸薹黄化病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；荧光染料肉眼观察法为：

取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色。

由于SYBR Green I会抑制LAMP反应，因此不适合反应前加SYBR Green I，而反应结束后通过甩管盖或离心的方式使得荧光染料检测液与LAMP反应液混合，使得反应液显色。

在本发明应用较佳的实施方式中，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有芸薹黄化病毒；

若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含芸薹黄化病毒。

上述试剂盒检测的对象是BrYV病毒粒子，通过胶体金免疫层析GICA技术快速富集病毒粒子，可以初步判定待测样品的病毒感染情况；再利用病毒基因组序列的特异性引物进行RT-LAMP扩增，通过对扩增产物的分析达到精确检测病原物的目的。

GICA-RT-LAMP检测方法将血清学方法和核酸检测方法有机地结合起来，具有特异性强，灵敏度高的优势。经检测验证，其灵敏度达到了0.25pg/mL，比普通GICA-RT-PCR灵敏100倍，检测过程中免核酸RNA提取，无需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

本发明还提供了一种芸薹黄化病毒的检测卡、用于芸薹黄化病毒检测的引物组合物或用于检测芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒在检测芸薹黄化病毒中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的检测引物组可以实现特异性的芸薹黄化病毒的检出，该引物组具有灵敏度高的技术优势。本发明提供的检测卡具有检测快捷的优势，可以初步确定目标样本是否感染芸薹黄化病毒。将二者联合后的GICA-RT-LAMP试剂盒及其检测方法，具有操作方便、准确性高、适用性好的技术优势。

GICA-RT-LAMP的检测方法免核酸RNA提取，从而解决了种子等检测对象提取RNA困难的问题。同时，该方法克服了现有技术中芸薹黄化病毒BrYV的检测方法繁琐，费时费力，必须依赖基因扩增仪等昂贵的分子生物学仪器设备，无法快速检测目标病毒等缺陷，将血清学和LAMP扩增技术有机地结合，充分发挥两种检测方法的优势，直接以胶体金免疫层析GICA富集到的BrYV病毒粒子作为检测对象进行RT-LAMP扩增，降低了检测门槛和难度，反应操作在同一反应体系中连续进行，中途不需添加任何试剂，降低了污染风险。

利用F3、B3、FIP、BIP、LF和LB共6条特异性引物识别BrYV CP靶基因的8个序列，具有特异性强和准确性高的优势。

该方法的实现无需基因扩增仪的协助即可完成检测，通过肉眼观察免疫层析反应的结果，结合RT-LAMP反应在恒温水浴中就能完成。降低了检测难度，扩展了技术的应用范围，反应结束后通过颜色变化也用肉眼判断结果，不依赖于仪器或设备，增加了应用价值，非常适合在基层推广应用，前景十分广泛。

此外，本发明的提出也为黄芩及植物病害检测提供了新的技术平台。既能应用于芸薹黄化病毒BrYV的快速筛查，也能应用于BrYV病毒的精准监测。为监控BrYV病毒的发生、扩散、流行以及病毒病的防治提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例检测BrYV病毒的胶体金免疫层析检测卡的平面结构示意图；

图2为本发明实施例检测BrYV病毒的胶体金免疫层析检测卡内部结构示意图；

图3为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测BrYV病毒反应温度的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃；58℃；60℃；62℃；64℃；66℃；68℃，70℃；

图4为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测BrYV病毒反应时间的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-10分别对应：20min；30min；40min；50min；60min；70min；80min；90min；100min；

图5为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测BrYV病毒灵敏性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-11分别对应BrYV CP基因标准品浓度：10^-1(2.5×10⁴ng/mL)；10^-2(2.5×10³ng/mL)；10^-3(2.5×10²ng/mL)；10^-4(2.5×10¹ng/mL)；10^-5(2.5×10⁰ng/mL)；10^-6(2.5×10^-1ng/mL)；10^-7(2.5×10^-2ng/mL)；10^-8(2.5×10^-3ng/mL)；10^-9(2.5×10^-4ng/mL)；10^-10(2.5×10^-5ng/mL)；

图6为本发明实施例GICA-RT-PCR检测BrYV病毒灵敏性的电泳分析图；图中：M：600bp Marker；1：阴性对照；2-11分别对应BrYV CP基因标准品浓度：10^-1(2.5×10⁴ng/mL)；10^-2(2.5×10³ng/mL)；10^-3(2.5×10²ng/mL)；10^-4(2.5×10¹ng/mL)；10^-5(2.5×10⁰ng/mL)；10^-6(2.5×10^-1ng/mL)；10^-7(2.5×10^-2ng/mL)；10^-8(2.5×10^-3ng/mL)；10^-9(2.5×10^-4ng/mL)；10^-10(2.5×10^-5ng/mL)；

图7为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测BrYV病毒特异性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-13分别对应：健康黄芩组织；LSV百合感病组织；CMV-Li百合感病组织；LMoV百合感病组织；PlAMV百合感病组织；ArMV百合感病组织；JHMV当归感病组织；AMV当归感病组织；LNYV生菜感病组织；LMV生菜感病组织；CMV生菜感病组织；BrYV黄芩感病组织。

附图标记：1-卡槽；2-加样窗；3-反应观察窗；4-样品垫；5-胶体金结合垫；6-硝酸纤维素膜；7-吸收垫；8-衬板；9-检测T线；10-质控C线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

参照图1和图2所示，本实施例提供了一种芸薹黄化病毒的检测卡，其包括卡槽1。卡槽1由下壳体和上壳体(图中未示出标号)组成，本实施例中设置下壳体和上壳体卡扣相连。上壳体与下壳体留有放置衬板8的安装腔。衬板8与下壳体的一个端面固定连接。

在衬板8上依次设置有样品垫4、胶体金结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，胶体金结合垫5上含有胶体金-芸薹黄化病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜6上沿层析方向依次设置有检测T线9和质控C线10，检测T线9包被有BrYV的抗体IgG，质控C线10包被有抗BrYV抗体的二抗；检测T线9上BrYV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；抗BrYV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白，本实施例中的抗BrYV抗体的二抗为羊抗兔IgG；胶体金结合垫5上的芸薹黄化病毒抗体的包被量为每5mL胶体金中含90μg的芸薹黄化病毒抗体。本实施例中，胶体金结合垫5上的芸薹黄化病毒抗体为兔抗BrYV多克隆抗体。

上壳体上间隔设置有加样窗2和反应观察窗3，加样窗2空间上位于样品垫4的上方，反应观察窗3空间上位于硝酸纤维素膜6的上方。

上述检测卡的制备方法如下：

1.芸薹黄化病毒BrYV多克隆抗体IgG的制备：

①BrYV CP外壳蛋白的表达和纯化：从感染了BrYV的黄芩叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)，扩增BrYV的CP基因片段；通过酶切克隆至pET-28a载体；重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小为22.6kDa的BrYV CP外壳蛋白；

②多克隆抗体的制备：用1mg/mL上述纯化的BrYV CP外壳蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔；初次免疫中，将BrYV蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；初次免疫21d后，将1.0mg/ml的BrYV纯化蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，经皮下多点注射作为第一次增强免疫；以后每间隔21d进行一次增强免疫，免疫方式为皮下多点注射。一共进行3次增强免疫，在第4次加强免疫后的5～7d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02％的叠氮钠，-20℃保存；所得抗血清通过饱和硫酸铵沉淀法，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后通过protein A亲和层析的方法对抗血清进行纯化获得兔抗BrYV多克隆抗体IgG。

2、胶体金标记兔抗BrYV多克隆抗体的方法如下：

分别取粒径为30nm的胶体金5mL及兔抗BrYV多克隆抗体90μg，在pH7.6的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加10％牛血清白蛋白(BSA)和5％PEG20000作为稳定剂，使得终浓度分别为0.5％和0.2％，采用低温高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金—抗体结合物。

3、胶体金结合垫的制备

用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮胶体金—抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成胶体金结合垫。

4、免疫层析膜的包被

检测T线包被的是纯化的兔抗BrYV多克隆抗体IgG，对照C线包被的是羊抗兔IgG抗体，每条线宽2mm，兔抗BrYV多克隆抗体合适包被量为1.6μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为1.6μg蛋白。

5、胶体金免疫层析GICA检测卡的组装

将作为支撑载体聚氯乙烯衬板体固定于检测卡槽的下壳体中，将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸(即吸收垫7)依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再通过卡扣将GICA检测卡槽上壳体与下壳体连接。

本实施例还提供了上述检测卡的检测方法：

参照图1所示，吸取少量样品的待检测溶液，滴在GICA检测卡槽上壳体加样窗2处，由于毛细效应上样后的液体往前移动，若待测液中含有BrYV，检测样品经过胶体金结合垫时，BrYV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测T线方向层析泳动，当接触到检测T线时，与检测T线上的BrYV多克隆抗体发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的复合物继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了芸薹黄化病毒BrYV。

若待测液中不含BrYV或BrYV含量较低时，检测样品经过胶体金结合垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合或者结合的复合物量非常少，当接触到所述检测T线时不发生反应，金标多克隆抗体继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染芸薹黄化病毒BrYV，或感染芸薹黄化病毒BrYV的含量低，需要后续进一步的试验分析。

上述检测卡可初步对芸薹黄化病毒BrYV进行快速筛查，满足田间等场景下的就地检测。3～5分钟可初步判断被检样品的病毒感染情况，达到快速、简便、高效检测BrYV的目的。

实施例2

本实施例提供了一种检测黄芩BrYV病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒。

试剂盒由三部分组成，包括：实施例1中的芸薹黄化病毒的检测卡；RT-LAMP特异性引物组合物和RT-LAMP扩增反应试剂；

除此之外，GICA-RT-LAMP试剂盒还包括磷酸缓冲液(PBS)、磷酸洗涤缓冲液(PBST)、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

RT-LAMP特异性引物组合物包括正SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ IDNO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB，上述引物组合物中各引物组的序列如下：

F3：5’-AGGTAACAACCGGACAGGA-3’；

B3：5’-TCGGAGACGAACTCCAGAA-3’；

FIP：

5’-GGAACTTCCCGCGAGATTGTCTACTGTTCCTACCAGAGGAGC-3'；

BIP：

5’-AGCGGAGCAATCACGTTCGGATTCATGGTAGGCCTTGAGC-3’；

LF：5’-ACAAATGTCTCGCTCGAACCT-3’；

LB：5’-GCCGAGTCTATCAGACTGCC-3’。

RT-LAMP扩增反应试剂由10U/μL AMV反转录酶、40U/μL RNAse抑制剂、10mM dNTP混合物、10×ThermoPol反应缓冲液、100mM MgSO₄、8U/μL Bst DNA polymerase和RNA-freeH₂O组成；

磷酸缓冲液(PBS)和磷酸洗涤缓冲液(PBST)的浓度为0.02M，pH值为7.4。

荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；

阴性对照品为RNA-free H₂O；

阳性对照品为当归BrYV CP基因标准品。

本实施例还提供了BrYV CP基因标准品的制备方法。具体制备方法如下：

1、总RNA的提取

将50-100mg感染BrYV的黄芩叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒提取感病组织的总RNA；

2、引物设计与合成

根据小RNA测序得到的序列，设计并合成了1对BrYV CP基因的特异性正向(BrYV-F)和反向引物(BrYV-R)；其中上述引物序列如下：

BrYV-F：5’-AGTCGTGGGTAGGAGAACA-3’

BrYV-R：5’-AATCGTGGAGGAGAGTGAA-3’；

3、阳性对照品的制备

1)RT反应

利用上述BrYV反向引物BrYV-R和M-MLV反转录酶进行RT反应，合成cDNA第一链；10μL RT反应体系如下:总RNA2μL，10μM BrYV特异性反向引物BrYV-R 1μL，RNA-free H₂O 3μL，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min；再加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTPs 1μL，30U/μL RNase抑制剂0.34μL，200U/μL M-MLV反转录酶0.35μL和RNA-free 0.31μL；混合后42℃水浴1h，70℃保温15min，置冰上待用。

2)PCR反应

利用上述步骤(1)制备的cDNA第一链为模板，在Ex Taq DNA聚合酶作用下进行BrYV CP基因的PCR扩增；

PCR反应体系为12.5μL，包括：50ng cDNA0.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.1μL，10×PCR buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 1μL，10μM正向引物BrYV-F 0.25μL，10μM反向引物BrYV-R 0.25μL，ddH₂O补足至12.5μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，51℃退火45s，72℃延伸30s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃条件下摇菌12～16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取1μL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为阳性对照品，黄芩BrYVCP基因对应的片段长度分别为424bp；用NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定标准品的质粒浓度。

3、阳性对照品的序列

经测序，上述阳性对照品与预期完全相符，回收的对照品片段序列如下：

黄芩BrYV CP基因片段标准品序列：

AGTCGTGGGGTAGAGAACAATCAATGGAAGAAGACGACCACGCAGGCAAACAAGGCGCATTCAGCGAAATCAGCCAGTGGTTGTGGTCCAAACCTCTCGGACAACACAACGCCGACCTAGACGACGACGAAGAGGTAACAACCGGACAGGAAGAACTGTTCCTACCAGAGGAGCAGGTTCGAGCGAGACATTTGTTTTCTCAAAAGACAATCTCGCGGGAAGTTCCAGCGGAGCAATCACGTTCGGGCCGAGTCTATCAGACTGCCCGGCATTCTCTAATGGAATGCTCAAGGCCTACCATGAATATAAGATCTCAATGGTCATTCTGGAGTTCGTCTCCGAGGCCTCTTCCCAAAATTCCGGTTCCATCGCTTACGAGCTGGACCCACACTGTAAACTCAATTCACTCTCTTCCCACGATTAA。

实施例3

本实施例提供了采用实施例2中的GICA-RT-LAMP试剂盒检测黄芩BrYV病毒的方法。

1、胶体金免疫层析GICA富集病毒粒子

1)取100mg感染BrYV的黄芩样品或其他待检样品放入3mL装有磷酸缓冲液PBS的自封袋中，用研棒轻轻研磨，研磨后的组织液即为待检样品的检测液；

2)吸取少量上述待测样品的检测液，滴在实施例1中的BrYV胶体金免疫层析检测卡的加样窗2处，3-5分钟内在反应观察窗3内观察显色结果。

2、初次判断反应结果

当上述BrYV胶体金免疫层析检测卡反应观察窗3内的检测T线9和质控C线10上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了芸薹黄化病毒BrYV，无需进行后续检测；

当上述BrYV胶体金免疫层析检测卡反应观察窗3内的检测T线9没有颜色变化，而质控C线10上出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染芸薹黄化病毒BrYV，或者感染BrYV的程度轻，则需进行后续的反转录RT-LAMP检测。

3、RT-LAMP反应

1)将上述反应结束的BrYV胶体金免疫层析GICA检测卡的检测T线切下，用PBST冲洗三次，用消毒刀片小心地刮下T线区域，放入PCR管中；

2)在上述含有T线的PCR管中加入40U/μL RNAse抑制剂0.15μL、10U/μL AMV反转录酶0.3μL、10×ThermoPol缓冲液1.25μL、100mM MgSO₄ 0.75μL、10mM dNTP混合物1.75μL、分别含2.5μM F3和B3，20.0μM FIP和BIP，以及10.0μM LF和LB的LAMP引物组1.0μL、8U/μL BstDNApolymerase 1.0μL、RNAse free H₂O补足至12.5μL；以RNA-free H₂O作为阴性对照，黄芩BrYV CP基因标准品作为阳性对照；反应体系配置完成后，在PCR管盖内壁加1μL 100×SYBRGreen I荧光染料工作液，盖紧PCR管盖，进行RT-LAMP反应；RT-LAMP的反应条件为:58-66℃扩增60-100min，随后80℃变性10min，终止反应。

4、二次判断反应结果

上述RT-LAMP反应结束后，在不开盖的情况下，离心或轻甩PCR管，使PCR管盖内壁上的SYBR Green I荧光染料与LAMP扩增产物混合，上下颠倒混匀，采用肉眼观察PCR管内混合液的颜色变化：

若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA结合，则为阳性反应，表示被检样品中含有芸薹黄化病毒BrYV；

若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含芸薹黄化病毒BrYV。

实验例1

本实验例提供了实施例2中的GICA-RT-LAMP试剂盒检测BrYV病毒在不同反应温度和反应时间下的荧光染料肉眼观察实验，检测方法参照实施例3所示。

分别测试56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃的RT-LAMP扩增温度下扩增80min的扩增结果。图3所示，图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在58-66℃条件下实现靶基因的高效扩增。

分别测试20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min的RT-LAMP扩增时间下扩增温度为64℃的扩增结果。图4所示，图中：1：阴性对照；2-10分别对应：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在60-100min条件下实现靶基因的高效扩增。

实验例2

胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测BrYV的灵敏度。

为了分析胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测BrYV的灵敏性，以上述实施例中黄芩BrYV CP基因标准品为样品，经NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定浓度(2.5×10⁵ng/mL)后，再用RNA-free H₂O对上述标准品进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各稀释液1.0μL作为模板，加入上述实施例中的RT-LAMP反应试剂进行RT-LAMP扩增，反应程序为64℃扩增80min；

作为对比检测，将上述10倍比稀释后的各稀释液进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，51℃退火45s，72℃延伸30s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；

RT-LAMP反应结束后，SYBR Green I荧光染料肉眼观察法观察显色情况，结果显示GICA-RT-LAMP对黄芩BrYV CP基因标准品的反应灵敏度为2.5×10^-4ng/mL，即0.25pg/mL(图5)；PCR反应结束后，取5μL扩增产物上样，琼脂糖凝胶电泳结果显示，GICA-RT-PCR对黄芩BrYV CP基因标准品的反应灵敏度为2.5×10^-2ng/mL，即25pg/mL(图6)，可见胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测BrYV的灵敏性是GICA-RT-PCR的100倍。

实验例3

胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测BrYV的特异性。

为了分析胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测黄芩BrYV的特异性，以感染百合、当归、生菜和黄芩的11个常见病毒:百合隐症病毒LSV、百合黄瓜花叶病毒CMV-Li、百合斑驳病毒LMoV、百合南芥菜花叶病毒ArMV、百合车前草花叶病毒PlAMV、当归日本金鱼藻花叶病毒JHMV-DG、当归苜蓿花叶病毒AMV、生菜坏死黄化病毒LNYV、生菜花叶病毒LMV、生菜黄瓜花叶病毒CMV-L和黄芩芸薹黄化病毒BrYV的感病叶片(大田采集)为样品，分别在装有PBS缓冲液的自封袋中用研棒轻轻研磨，研磨后制成检测液滴加至BrYV胶体金免疫层析GICA检测卡的加样窗3，3-5分钟后观察显色结果；随后，再用上述实施例中的GICA-RT-LAMP检测体系和检测方法进行RT-LAMP扩增，反应程序为64℃扩增80min，扩增结束后显色，以健康黄芩叶片为阴性对照，实验重复3次。

BrYV胶体金免疫层析GICA检测卡的显色结果显示，只有感染BrYV的黄芩叶片样品的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，而其他样品的检测T线没有颜色变化，质控C线上出现棕红色的条带。

SYBR Green I荧光染料肉眼观察法结果显示，只有感染BrYV的黄芩叶片的扩增产物出现绿色，其余感病叶片的扩增产物与健康黄芩叶片的扩增产物均为橙色(图7)；这表明本发明建立的GICA-RT-LAMP方法对BrYV病毒有很高的特异性，与其他常见病毒无交叉反应。

实验例4

胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测田间样品。

取田间黄芩叶片样品，用BrYV胶体金免疫层析GICA检测卡富集病毒粒子，再用上述实施例3中的GICA-RT-LAMP检测体系进行RT-LAMP扩增。

若GICA检测卡的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，则判定被检样品含有芸薹黄化病毒BrYV。

若GICA检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示绿色，说明样品中含有芸薹黄化病毒BrYV；

若GICA检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示橙色，说明样品中不含芸薹黄化病毒BrYV。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西北生态环境资源研究院

<120> 一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggtaacaac cggacagga 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcggagacga actccagaa 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaacttccc gcgagattgt ctactgttcc taccagagga gc 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcggagcaa tcacgttcgg attcatggta ggccttgagc 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acaaatgtct cgctcgaacc t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccgagtcta tcagactgcc 20

Claims (10)

1.一种用于芸薹黄化病毒检测的引物组合物，其特征在于，其包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB。

2.一种芸薹黄化病毒的检测卡，其特征在于，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金-芸薹黄化病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有BrYV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗BrYV抗体的二抗；所述检测T线上BrYV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；所述抗BrYV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；

所述胶体金结合垫上的芸薹黄化病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含16-18μg的芸薹黄化病毒抗体。

3.根据权利要求2所述的芸薹黄化病毒的检测卡，其特征在于，所述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，所述卡槽具有放置所述衬板的安装腔，所述衬板与所述下壳体的内壁固定连接，所述上壳体与所述下壳体固定连接。

4.根据权利要求3所述的芸薹黄化病毒的检测卡，其特征在于，所述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，所述加样窗空间上位于所述样品垫的上方，所述反应观察窗空间上位于所述硝酸纤维素膜的上方；

优选地，所述上壳体与所述下壳体通过卡扣结构卡接。

5.一种用于检测芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2-4任一项所述的芸薹黄化病毒的检测卡和权利要求1所述的用于芸薹黄化病毒检测的引物组合物。

6.根据权利要求5所述的检测芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，所述RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO₄、DNA聚合酶和水；优选地，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，所述反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液；

优选地，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；

优选地，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为芸薹黄化病毒外壳蛋白CP基因片段标准品；

优选地，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶。

7.一种采用如权利要求5-6任一项所述的用于检测芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒检测芸薹黄化病毒的检测方法，其特征在于，其包括：

(1)取待测溶液上样至芸薹黄化病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有芸薹黄化病毒BrYV；

(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有芸薹黄化病毒BrYV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有芸薹黄化病毒。

8.根据权利要求7所述的检测芸薹黄化病毒的检测方法，其特征在于，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有BrYV的具体方法为肉眼观察法；所述肉眼观察法为：

若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有芸薹黄化病毒BrYV，无需进行反转录RT-LAMP扩增；

若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染芸薹黄化病毒BrYV，或感染芸薹黄化病毒BrYV的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。

9.根据权利要求7所述的检测芸薹黄化病毒的检测方法，其特征在于，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有芸薹黄化病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：

取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色：

优选地，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有芸薹黄化病毒；

若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含芸薹黄化病毒。

10.一种如权利要求2-4任一项所述的芸薹黄化病毒的检测卡、权利要求1所述的用于芸薹黄化病毒检测的引物组合物或权利要求5-6任一项所述的用于检测芸薹黄化病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒在检测芸薹黄化病毒中的应用。

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