CN113913370A - N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用 - Google Patents
N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113913370A CN113913370A CN202111472671.4A CN202111472671A CN113913370A CN 113913370 A CN113913370 A CN 113913370A CN 202111472671 A CN202111472671 A CN 202111472671A CN 113913370 A CN113913370 A CN 113913370A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acetylcysteine
- vitro
- medium
- cells
- sheep
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 35
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 10
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N metformin hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)C(=N)N=C(N)N OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 abstract description 19
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 abstract description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010009306 Forkhead Box Protein O1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009561 Forkhead Box Protein O1 Human genes 0.000 description 1
- 108010009307 Forkhead Box Protein O3 Proteins 0.000 description 1
- 102000009562 Forkhead Box Protein O3 Human genes 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000877683 Homo sapiens Forkhead box protein O4 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010027439 Metal poisoning Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010501 heavy metal poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本发明提供了N‑乙酰半胱氨酸的一种新用途，具体地是N‑乙酰半胱氨酸用于在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的培养基配方中的应用，实验结果显示：含有N‑乙酰半胱氨酸的细胞体外培养基可用于促进绵羊颗粒细胞原代培养初期时的体外增殖与贴壁，并有效降低细胞内活性氧（ROS）水平，有利于细胞活力的提升。
Description
技术领域
本发明涉及家畜养殖技术领域，具体涉及N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用。
背景技术
卵泡是卵巢的基本功能单位，每一个卵泡都由一层或者多层卵巢颗粒细胞细胞包裹的卵母细胞组成。卵巢上表现出来的各级卵泡发育，其卵泡内体现着卵子成熟的过程。卵子成熟是由卵巢内外的多种因素的综合调节结果。在卵泡发育过程中，卵母细胞减数分裂和成熟的能力是逐步获得的，并且取决于发育卵母细胞和其附近卵巢颗粒细胞的相互作用关系的结果。卵母细胞与其周围的颗粒细胞之间的信号交流，对于卵母细胞发育和颗粒细胞分化、增殖都是至关重要的。卵巢颗粒细胞可为卵母细胞核和细胞质成熟提供必需的营养和调节信号，从而促使卵母细胞获得发育能力。
N-乙酰半胱氨酸是合成半胱氨酸和还原型谷胱甘肽的前体，是一种含巯基的化合物，能干扰自由基生成，清除活性氧自由基。NAC还能通过激活细胞信号通路调节激酶阻止细胞凋亡、促进细胞存活，常用来治疗某些退化性疾病。与半管氨酸相比，N-乙酰半胱氨酸分子量较小，更容易进入细胞，通过脱乙酰基形成半胱氨酸为细胞内还原型谷胱甘肽的合成提供原料。NAC分子中的乙酰基使其抗氧化性更稳定，临床上可通过口服、肌肉注射、静脉注射等多种方式给药。N-乙酰半胱氨酸因其还原性可直接调节多种蛋白，修饰DNA和多种分子模式；而被广泛用于治疗呼吸道疾病、癌症、心脏病、HIV感染、以及重金属中毒等疾病。
N-乙酰半胱氨酸可作为巯基供给体直接清除ROS，如超氧自由基（O2-）和过氧化氢等，减轻其对脂质和膜蛋白的损害，而维持其正常功能。同时，N-乙酰半胱氨酸可通过PI3K/Akt信号途径上调FOXO1、FOXO3、FOXO4基因的表达降低ROS生成、上调细胞内Bcl-2的相对表达来实现抗细胞凋亡。迄今为止，N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中作用和影响报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供N-乙酰半胱氨酸的一种新用途，用于在制备绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
N-乙酰半胱氨酸在用于绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基中的应用，所述的应用指的是提升细胞的活力；所述绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基指的是：N-乙酰半胱氨酸16.3μg/mL、胎牛血清体积比为15%，高糖培养基体积比为84%，双抗体积比为1%。其中所述双抗为青霉素和链霉素溶液，其中青霉素和链霉素浓度均为10000单位/mL。所述提升细胞的活力指的是：体外培养基为促进绵羊卵巢颗粒细胞原代培养初期的体外增殖和贴壁促进剂，以及作为细胞活性氧的清除剂。所述绵羊体外卵巢颗粒细胞培养基，用于原代细胞铺板后48小时内的培养，在此期间，有利于其体外增殖和贴壁；超过48小时后，后续换液时可使用不含N-乙酰半胱氨酸的培养基进行正常传代培养。实验结果显示，含有N-乙酰半胱氨酸的细胞体外培养基可在绵羊颗粒细胞原代培养初期时促进体外增殖与贴壁，并有效降低细胞内活性氧（ROS）水平，有利于细胞活力的提升。
本发明更加详细的描述如下：
N-乙酰半胱氨酸用于绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基中的应用。优选地，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备促进原代绵羊卵巢颗粒细胞体外培养初期的贴壁与增殖促进剂；所述N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞培养基中的用量为16.3μg/mL。其培养基中的胎牛血清所占体积比为15%，高糖培养基（HyClone，美国，货号SH30022.01）所占体积比为84%，双抗溶液所占体积比为1%。所述的双抗溶液，由青霉素和链霉素溶液组成，其中青霉素和链霉素浓度均为10000单位/mL。所述绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基，用于原代细胞铺板后48小时内的培养，在此期间，有利于其体外增殖和贴壁以及细胞内活性氧的降低和细胞活力的提升；超过48小时后，后续换液时可使用不含N-乙酰半胱氨酸的培养基进行正常传代培养。
本发明主要解决了绵羊卵巢颗粒细胞原代培养贴壁困难以及增殖速度慢的问题，重点考察了含有16.3μg/mL的N-乙酰半胱氨酸的培养基对绵羊颗粒细胞的贴壁、增殖和细胞活性氧和细胞活力的影响，主要的难点在于培养基中N-乙酰半胱氨酸适宜浓度的摸索研究。
本发明公开的N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用的有益效果在于：
本发明提高N-乙酰半胱氨酸用于在制备绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基中的应用，具体地说，N-乙酰半胱氨酸可用于绵羊卵巢颗粒细胞前期的原代培养过程，该培养基在48小时内的体外培养过程中，有利于绵羊卵巢颗粒细胞前期的快速增殖和细胞贴壁；还可用于制备临床研究相关的用于促进绵羊卵巢颗粒细胞增殖，细胞内活性氧（ROS）清除以及细胞活力的提升研究。
附图说明
图1为倒置显微镜下的贴壁颗粒细胞（10倍镜）；
图2为两组培养基培养48小的卵巢颗粒细胞贴壁情况（4倍镜）注：左图培养基A组，右图培养基B组；
图3为培养基A（NAC）和培养基B（对照组）培养颗粒细胞24小时和48小时的细胞活力比较。
图4为培养基A（NAC）和培养基B（对照组）培养颗粒细胞48小时的细胞内活性氧（ROS）水平比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。N-乙酰半胱氨酸、胎牛血清、高糖培养基、青霉素和链霉素等原料及试剂均有市售。
实施例1
卵巢颗粒细胞培养：
1. 在屠宰场收集空怀母羊的新鲜卵巢，用含有双抗体积比为1%的300mL的PBS保存，并低温运输至实验室。
2. 运输至实验室后，利用75%的乙醇溶液进行快速清洗卵巢，利用灭菌后的生理盐水进行卵巢多次清洗后，小心剪去卵巢外的结缔组织。
3. 处理好的卵巢换上含有1%双抗的生理盐水，置于超净台中等待颗粒细胞的抽取。
4. 配制两种颗粒细胞培养基：
培养基A：7.5mL胎牛血清+42mL高糖培养基+0.5mL双抗溶液+815μg N-乙酰半胱氨酸；
培养基B：5mL胎牛血清+44.5mL高糖培养基+0.5mL双抗溶液。
5. 使用10mL的一次性注射器先吸入12mL的培养基A，并对准绵羊卵巢卵泡抽取颗粒细胞，转移至装有8mL高糖培养基的15mL离心管中。
6. 抽完颗粒细胞后，15mL离心管至于离心机中2000rpm离心5分钟。
7. 弃掉上清液，利用6mL的高糖培养基重悬，之后在1500rpm离心5min，重复两次后，加入2mL培养基A，经过细胞计数后于10cm培养皿中铺板，置于CO2培养箱中37℃培养48小时。
8. 培养48小时后，吸走培养基A，加入6mL培养基B继续培养48小时，可择机收取贴壁颗粒细胞用于后续试验（图1）。
实施例2
培养基A和B对颗粒细胞培养增殖的影响：
1. 按照实施例1中的细胞培养步骤，以培养基A为试验组，以培养基B为对照组，调整细胞浓度为5×104个/mL（24孔板内），分别对绵羊颗粒细胞进行原代培养铺板。
2. 培养48h小时后，利用胰酶进行消化后，可通过全自动细胞计数仪进行计数。
3. 如图2所示，相比于对照组（培养基B），利用培养基A进行绵羊卵巢颗粒细胞体外培养时，其48小时后的细胞数量明显高于对照组。
实施例3
培养基A和B对颗粒细胞培养48小时后的细胞活力影响：
1. 按照实施例1中的细胞培养步骤，以培养基A为试验组，以培养基B为对照组，调整细胞浓度为5×104个/mL（96孔板），分别对绵羊颗粒细胞进行原代培养铺板。
2. 培养48h小时后（24h时，分别将旧培养基吸出，PBS清洗两遍），每孔加入100μL含10%（体积比）CCK8的对应培养基，且另加入一组（6个重复）没有细胞的孔做阴性对照。
3. 继续置于饱和湿度、37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养4个小时后，用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光值。
4. 根据细胞活力计算公式：细胞活力（%）=（试验组吸光值-阴性对照组吸光值）/（对照组吸光值-阴性对照组吸光值）；如图3所示，相比于对照组（培养基B），利用培养基A进行绵羊卵巢颗粒细胞体外培养时，其24和48小时的细胞活力均显著高于对照组。
实施例4
培养基A和B对颗粒细胞培养48小时后的细胞活性氧清除比较：
1. 按照实施例1中的细胞培养步骤，以培养基A为试验组，以培养基B为对照组，调整细胞浓度为5×104个/mL（96孔板），分别对绵羊颗粒细胞进行原代培养铺板。
2. 培养48h小时后（24h时，分别将旧培养基吸出，PBS清洗两遍），避光操作，用培养基稀释ROS探针，终浓度10μM。每孔加入100μl探针工作液，37℃培养箱孵育20min。弃掉探针孵育工作液，PBS温和地洗1次，然后各孔加入100μl培养基。在荧光酶标仪上检测荧光强度。
3. ROS探针标记后，移除多余培养基，经过多聚甲醛固定后，适当PBS清洗。加入100μL的10μg/ml的Hochest染细胞核，并同样在荧光酶标仪上检测荧光强度。
4. 针对每一个培养孔，利用ROS探针荧光强度值/对应孔Hochest荧光强度值，计算每个细胞培养孔的细胞内活性氧（ROS）相对定量值。如图4所示，相比于对照组（培养基B），利用培养基A进行绵羊卵巢颗粒细胞体外培养时，其48小时的细胞内活性氧（ROS）水平显著低于对照组。
结论：综合以上试验结果，含有N-乙酰半胱氨酸的细胞体外培养基可用于促进绵羊颗粒细胞原代培养初期时的体外增殖与贴壁，并有效降低细胞内活性氧（ROS）水平，有利于细胞活力的提升。
Claims (4)
1. N-乙酰半胱氨酸在用于绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基中的应用，所述的应用指的是提升细胞的活力；所述绵羊卵巢颗粒细胞体外培养基指的是：N-乙酰半胱氨酸16.3μg/mL、胎牛血清体积比为15%，高糖培养基体积比为84%，双抗体积比为1%。
2.权利要求1所述的应用，其中所述双抗为青霉素和链霉素溶液，其中青霉素和链霉素浓度均为10000单位/mL。
3.权利要求1所述的应用，其中所述提升细胞的活力指的是：体外培养基为促进绵羊卵巢颗粒细胞原代培养初期的体外增殖和贴壁促进剂，以及作为细胞活性氧的清除剂。
4.权利要求3所述的应用，其中所述绵羊体外卵巢颗粒细胞培养基，用于原代细胞铺板后48小时内的培养，在此期间，有利于其体外增殖和贴壁；超过48小时后，后续换液时可使用不含N-乙酰半胱氨酸的培养基进行正常传代培养。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111472671.4A CN113913370A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111472671.4A CN113913370A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113913370A true CN113913370A (zh) | 2022-01-11 |
Family
ID=79248693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111472671.4A Pending CN113913370A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113913370A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6635802B1 (en) * | 2000-01-10 | 2003-10-21 | The Texas A&M University System | Nuclear transfer using cells cultured in serum starvation media containing apoptosis inhibitors |
| CN108611317A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-10-02 | 北京市农林科学院 | N-乙酰半胱氨酸用于制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用 |
| JP2019083793A (ja) * | 2017-11-10 | 2019-06-06 | 学校法人 聖マリアンナ医科大学 | 卵巣由来幹細胞の減数分裂誘導法 |
| WO2020205464A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Wake Forest University Health Sciences | Ovarian follicle cells and constructs for fertility treatment and hormone replacement therapy |
| CN113462635A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-01 | 河北农业大学 | 一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法 |
-
2021
- 2021-12-06 CN CN202111472671.4A patent/CN113913370A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6635802B1 (en) * | 2000-01-10 | 2003-10-21 | The Texas A&M University System | Nuclear transfer using cells cultured in serum starvation media containing apoptosis inhibitors |
| JP2019083793A (ja) * | 2017-11-10 | 2019-06-06 | 学校法人 聖マリアンナ医科大学 | 卵巣由来幹細胞の減数分裂誘導法 |
| CN108611317A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-10-02 | 北京市农林科学院 | N-乙酰半胱氨酸用于制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用 |
| WO2020205464A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Wake Forest University Health Sciences | Ovarian follicle cells and constructs for fertility treatment and hormone replacement therapy |
| CN113462635A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-01 | 河北农业大学 | 一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LAI, FANG-NONG等: "The influence of N-acetyl-L-cysteine on damage of porcine oocyte exposed to zearalenone in vitro", TOXICOLOGY AND APPLIED PHARMACOLOGY * |
| 何宝祥等: "抗坏血酸和NAC对水牛卵泡颗粒细胞存活的影响", 中国兽医科技 * |
| 郭晓飞等: "添加N-乙酰半胱氨酸对猪卵巢颗粒细胞体外培养的影响", 黑龙江畜牧兽医 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754668B (zh) | 一种干细胞培养液及注射液 | |
| Qin et al. | Losartan ameliorates calcium oxalate-induced elevation of stone-related proteins in renal tubular cells by inhibiting NADPH oxidase and oxidative stress | |
| CN110577931B (zh) | 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用 | |
| Franzen et al. | Local mitogenic effect of tissue mast cell secretion | |
| CN109929799B (zh) | 人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 | |
| US20120263685A1 (en) | Anti-tumor composition comprising human-derived adult stem cells | |
| CN104988110A (zh) | 脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法 | |
| CN111808815A (zh) | 一种胃癌实体瘤原代细胞的培养方法 | |
| CN102325537A (zh) | 免疫抑制相关疾病的治疗 | |
| CN112029717B (zh) | 无血清体外驯化培养人间充质干细胞 | |
| CN113846064A (zh) | 一种fgf18基因修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN116426469B (zh) | LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用 | |
| Choi et al. | Functionally enhanced cell spheroids for stem cell therapy: Role of TIMP1 in the survival and therapeutic effectiveness of stem cell spheroids | |
| CN112760283B (zh) | 一种用于培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养基 | |
| CN113913370A (zh) | N-乙酰半胱氨酸在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养中的应用 | |
| Li et al. | An improved two-step method for extraction and purification of primary cardiomyocytes from neonatal mice | |
| KR20170090549A (ko) | 성체줄기세포를 사용한 인체유래 배양액의 기능성 화장료 조성물 | |
| Wang et al. | Intracellular reactive oxygen species mediate the therapeutic effect of induced pluripotent stem cells for acute kidney injury | |
| EP3795677A1 (en) | Composition for promoting stem cell differentiation, comprising progenitor cell culture solution and multilayer graphene film, and use thereof | |
| CN112472695A (zh) | 他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用 | |
| CN105039239A (zh) | 细胞转化诱导液及其应用 | |
| CN112760287A (zh) | 一种用于培养泌尿肿瘤实体瘤原代细胞的培养基 | |
| CN112760280A (zh) | 一种胆囊胆管癌原代细胞的培养方法 | |
| CN110607279A (zh) | 一种原代肿瘤细胞的3d培养体系及其培养方法和应用 | |
| CN108785653A (zh) | Apelin-13在制备治疗脑外伤药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220111 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |