CN113907041A - 一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法，使用优化控制系统内环境稳定的低压低氧动物实验舱，通过设置模拟高海拔的压力和氧含量参数，长时间稳定持续的运行，建立具有病理学特征的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，使用锝[99mTc]标记的聚合白蛋白行肺灌注扫描成像和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白行肺组织冰冻免疫荧光病理，证实该模型存在肺泡壁通透性的改变，明确基底膜和血管内皮渗漏情况，结合病理特殊染色指标丰富了建立该模型的验证技术参数。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法。
背景技术
我国的青藏、川藏、滇藏高原占国土面积的26%。生活在海拔3500m以上的人群中，约有25%的人会出现急性高山反应的症状，随着海拔高度的升高，高原缺氧可诱发急性高山病的缺氧性肺损伤，甚至患高原肺水肿危及生命，引起死亡。
高原缺氧是高原医学研究的重点领域，其中急性高山病的高原肺水肿、高原脑水肿的致病机制、病理生理改变和干预的靶点是研究的关键问题。由于高原医学的研究需要在高原低气压低氧环境下进行，这种特殊环境条件限制了其现场研究的广度和深度。在非高原条件下需要借助于低压低氧动物实验舱，实现模拟高原低压低氧环境和制备高原急性低压低氧动物模型。
我国在低压低氧动物实验舱制作、急性高原低压低氧肺损伤动物模型建模有较成熟的技术。目前，高原医学针对缺氧靶点治疗药物、动物实验舱的性能和动物模型的稳定性等方面的研究有待深入。现有实验舱存在如下问题：
1.实验舱模拟高海拔（8000-10000米）的升海拔速率为5-10米/秒，升至高海拔的总体时间多在半小时左右，可造成重度的实验动物模型肺减压伤，严重干扰实验结果；
2.模型建立过程需要实验舱模拟高海拔极度低氧环境并长时间的运行，而现有实验舱没有考虑在有限的低氧空间内，因长时间饲养成组动物的代谢性氧消耗，造成过度低氧和高二氧化碳的实验环境；
3.实验舱除执行企业制定的基本标准，应积极积累并优化各项技术参数，进行不断改进指标提升标准。
此外，动物模型的成模尚无统一标准，需要进一步的加以探索：
1.结合现有的模型验证方法，明确完善急性高原低压低氧肺损伤的造模条件，以制定模型的验证标准；
2.目前模型验证体系多集中在肺泡上皮的损伤炎症和免疫反应的验证，肺泡壁组织是由肺泡上皮、基底膜和血管内皮组成，对后两者的检测同样是关键；
3.缺乏相关肺泡影像学功能性损伤的检测指标，针对性亦不强，与结构性肺损伤验证结合不紧密；
4.现有肺损伤动物模型验证体系中缺乏无创、连续及动态的检测方法。
实验舱性能的稳定决定了动物模型建立的稳定和可重复性；建立动物模型标准的参数不断提升，以促进动物实验舱的进步。两者同时决定高原医学的发展。提高抗高原缺氧整体水平，需要一体化解决两者存在的所有问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法，使用优化控制系统内环境稳定的低压低氧动物实验舱，通过设置必要的技术参数，包括模拟高海拔，控制在低氧含量，控制较低的海拔变化速率，长时间持续运行建立具有病理学特征的急性高原低压低氧肺损伤小鼠模型。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法，将实验动物放入实验舱内饲养，其特征在于，所述建立方法包括以下步骤：
（1）升海拔阶段，真空泵组件的抽气速度大于补气组件的补气速度，使舱体内的气压及氧含量降低，达到模拟升海拔至8500米的低压低氧环境；
（2）维持高海拔阶段，模拟舱体内的气压及氧含量在海拔4500-8500米之间交替切换，维持高海拔阶段的时间为144小时及以上；
（3）降海拔阶段，真空泵组件的抽气速度小于补气组件的补气速度，使舱体内的氧气总量不变，气压升高，模拟自8500米海拔降至实验起始海拔；
步骤（1）-（3）中模拟海拔变化的速度为0.41~0.49m/s
所述实验舱包括舱体、控制器、分别与控制器电性连接的传感器组件、真空泵组件及补气组件；
所述传感器组件包括设于舱体内的压力传感器、氧气传感器、氮气传感器；
所述真空泵组件用于从舱体中抽气；
所述补气组件用于向舱体中补气，补气组件包括分别与舱体通过管道连通的多个气源，所述气源与舱体之间的管道上分别设有电磁阀，气源包括氧气源、氮气源及空气源。
进一步地，在升海拔阶段，中央控制器控制真空泵组件的抽气速度大于补气组件的补气速度，通过补气组件向舱内补充空气，使舱内气压降低，并在此阶段设置平台期，使实验动物在该阶段进行适应，然后再继续降低舱内气压，直到达到模拟海拔高度的低压低氧环境；
在维持高海拔阶段，中央控制器通过在每日固定时间控制实验舱内压力的升高和降低，达到舱内在中等海拔高度和模拟海拔高度之间进行切换，满足实验动物在中等海拔高度时间段内补充食物和水，避免因能量缺乏引起饥饿性死亡；
在降海拔阶段，中央控制器控制补气组件向舱体内补充氮气替代空气升高舱体内压力同时维持舱体内氧含量恒定，直至舱体内压力恢复至常压。
一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，包括使用以下方法中的一种或几种方法进行检测验证：
（1）对鼠模型进行99mTc-AA的肺灌注扫描成像；
（2）对鼠模型进行胸部CT扫描成像；
（3）对鼠模型进行胸部超声检查成像；
（4）对鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像；
（5）对鼠模型进行肺组织多重病理特殊染色验证；
（6）对鼠模型进行肺含水量检查；
进一步地，对鼠模型进行99mTc-AA的肺灌注扫描成像包括以下步骤：
（1）使用0.9%的氯化钠溶液淋洗钼锝发生器获得99mTcO4 -注射液，并将其按照6~10mCi放射性浓度，1~5ml体积注射于注射用亚锡聚合白蛋白瓶内，充分摇匀，使颗粒均匀分散成悬浮液，即得到标记率大于95%的99mTc-AA注射液；
（2）对99mTc-AA注射液进行过滤；
（3）将过滤后的99mTc-AA注射液通过注射器注入小鼠静脉中，麻醉后立即于InLiview3000B 动物 PET/SPECT/CT机中采集即刻扫描成像；
（4）间隔2-4小时后麻醉小鼠进行延迟扫描成像；
（5）通过优化轮廓追踪程序的NMSoft-AIWS V1.6软件划定肺组织感兴趣区并计算肺组织内锝[99mTc]的放射性计数，根据Nt=N0e—λt计算锝[99mTc]在肺组织2-4h内的生物代谢指数；其中λ为衰变常数，Nt表示经过t时间变化后的放射量，N0表示打药后的初始放射量，e为自然常数，取值2.71，t表示时间；鼠模型肺组织中的锝[99mTc]的生物代谢指数较正常鼠明显降低可验证鼠模型肺泡壁通透性的改变。
进一步的，对鼠模型进行胸部CT扫描成像发现肺野透光度降低、成斑片状磨玻璃阴影可验证肺组织产生了肺泡壁通透性的改变。
进一步的，对鼠模型进行胸部超声检查成像发现B线阳性征可验证鼠模型肺泡壁通透性的改变。
进一步地，对鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像包括以下步骤：
（1）配制浓度为0.5-2ug/ul的FITC-BSA注射液；
（2）使用注射器经实验动物的静脉注射80-150ul；
（3）2-4小时后解剖留取实验动物肺组织行肺组织冰冻免疫荧光病理切片；
（4）在荧光显微镜下进行显像，观察到FITC-BSA从鼠模型肺毛细血管渗出至肺泡中可验证鼠模型肺泡壁通透性的改变。
进一步地，对鼠模型进行肺组织多重病理特殊染色包括马松染色发现胶原纤维表达增加；HE染色发现肺泡结构紊乱塌陷、肺泡间隔水肿增厚、炎细胞渗出浸润、红细胞渗出；免疫组织化学染色发现氧化抗氧化物中的超氧化物歧化酶的表达降低，具有影响血管通透性的血管内皮生长因子A的表达增加、血管内皮钙粘蛋白的表达降低可验证肺组织的损伤和肺泡壁通透性的改变。
进一步地，对鼠模型进行肺含水量检测发现鼠模型的肺含水量较正常鼠明显升高，可验证肺泡壁通透性的改变。
进一步地，使用99mTc-AA的肺灌注扫描成像发现生物代谢指数降低和FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像发现FITC-BSA从鼠模型肺毛细血管渗出，结合肺组织多重病理特殊染色中的血管内皮生长因子A的表达增加、血管内皮钙粘蛋白的表达下降对鼠模型进行肺泡壁通透性改变的多模态综合验证。
进一步地，使用99mTc-AA的肺灌注扫描成像发现生物代谢指数降低和胸部CT扫描成像发现肺野透光度降低、成斑片状磨玻璃阴影，结合HE染色发现肺泡结构紊乱塌陷、肺泡间隔水肿增厚、炎细胞渗出浸润、红细胞渗出对鼠模型进行肺组织炎性损伤和肺泡壁通透性改变的多模态综合验证。
进一步地，使用胸部超声检查成像发现B线阳性征结合99mTc-AA的肺灌注扫描成像发现锝[99mTc]的生物代谢指数降低对鼠模型程度的早期、无创、定量、可重复的多模态综合验证。
相对于现有技术，本发明所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法具有以下优势：
（1）本发明所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法提供了一种新型低压低氧动物实验舱，提出了低压低氧动物实验舱可供参考的技术数据，实现实验期间内环境的稳定，明确了急性高原低压低氧肺损伤鼠模型的造模条件，提高了急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立的成功率及稳定性；
（2）本发明所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法使用99mTc-AA对鼠模型行肺灌注扫描成像可用于验证肺泡壁（基底膜、血管内皮、肺泡）的通透性改变；使用FITC-BSA向鼠模型体内注射并制备肺组织冰冻切片，荧光显微镜明确FITC-BSA的渗出；及多重病理特殊染色验证，可综合证明肺泡壁的基底膜和毛细血管内皮通透性的改变；联合建立新的模型验证标准；
（3）本发明所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法使用99mTc-AA对鼠模型行肺灌注扫描成像可用于验证肺泡壁（基底膜、血管内皮、肺泡）的通透性改变，结合胸部CT扫描和多重病理特殊染色成像分析可综合验证鼠模型肺泡壁通透性的变化。
（4）本发明所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法联合使用模型鼠同位素锝[99mTc]的肺灌注扫描成像和胸部超声等无创验证手段建立早期、无创、定量、连续的鼠模型验证体系。
（5）本发明所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法联合使用FITC-BSA行肺组织行免疫荧光成像结合肺组织多重病理特殊染色检测可验证鼠模型肺组织的损伤和肺泡壁通透性的改变。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为低压低氧动物实验舱组成示意图，其中A为压力传感器，B为氧传感器，C为氮气传感器；
图2为低压低氧动物实验舱舱内模拟海拔变化的三阶段控制示意图；
图3为舱内压力变化速率模型示意图；
图4为低压低氧动物实验舱压力变化曲线图；
图5为低压低氧动物实验舱海拔高度变化曲线图；
图6为低压低氧动物实验舱氧含量变化曲线图；
图7为血氧分压统计分析图结果；
图8为鼠模型的胸部CT扫描成像结果，其中A为空白组，B为对照组，C为肺损伤组；
图9为鼠模型的肺含水量（湿重/干重）检测结果；
图10为鼠模型的肺组织HE染色分析结果，其中A为空白组，B为对照组，C为肺损伤组；
图11为鼠模型行99mTc-AA的肺灌注扫描成像结果；
图12为锝[99mTc]的生物代谢指数统计分析结果；
图13为鼠模型进行胸部超声检查成像结果，其中A为正常对照组，B为损伤组；
图14为鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像结果；
图15为鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像平均荧光强度统计分析结果；
图16为马松染色和免疫组织化学染色结果。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
低压低氧动物实验舱的建立
如图1所示，低压低氧动物实验舱包括气源（氧气源、氮气源、空气源）、电磁阀（氧气电磁阀、氮气电磁阀、空气电磁阀）、混合气体罐、电磁比例阀、实验舱体、压力传感器、氧传感器、氮气传感器、温度传感器、湿度传感器、真空泵、转换舱、中央控制器及按键电路等元件。
所述低压低氧动物实验舱可主要分为控制系统、气体循环系统、实验舱体三部分。
所述实验舱体呈圆桶形，采用高强度有机玻璃材料为舱体加两端的金属封头组成，其中一端金属封头为负压快开门；实验舱内部容量为400升，可承受-90KPa的低气压；舱内置有压力传感器、氧传感器、氮气传感器，可向控制系统实时反馈舱内检测的数值。
所述气体循环系统由氧气源、氮气源、空气源作为实验舱内气体循环的三路气体，经进气管路依次连接电磁阀（氧气电磁阀、氮气电磁阀、空气电磁阀）、混合气体罐、电磁比例阀、实验舱体，然后出气管路经转换舱连接真空泵，在真空泵的作用下实现舱内低气压低氧的气体循环。该系统与控制系统结合承担调节的路径作用。
所述控制系统中以中央控制器为核心，接收实验舱内压力传感器、氧传感器、氮气传感器等传入信号，通过接收舱内压力值、氧含量值、氮气含量值，按照预定的程序计算处理，输出信号控制电磁阀、真空泵的开闭，控制电磁比例阀开度大小来调节舱内模拟升海拔阶段、维持高海拔阶段及降海拔阶段舱内压力和氧含量的变化，如图2所示。
低压低氧动物实验舱最主要的性能特征在于实验全过程海拔变化速率控制在小于0.5米/秒。升海拔阶段、维持高海拔阶段和降海拔阶段的三个阶段控制特点为：在升海拔阶段，中央控制器可根据舱内压力变化速率模型控制舱内压力变化的速率，真空泵的抽气速度大于气源的补气速度，控制模拟升海拔的速率为0.45米/秒以避免舱内压力-海拔速率变化太快引起实验动物肺组织产生减压伤；在维持高海拔阶段，中央控制器通过向舱内实时补充实验动物消耗的氧气，维持舱内氧含量的恒定，杜绝并消除舱内维持高海拔阶段过度低氧和高二氧化碳的状态；在降海拔阶段，中央控制器控制向舱内补充氮气代替补充空气直至舱内压力恢复至常压，一直保持舱内氧含量与维持高海拔阶段的氧含量一致，能在开舱时获取高海拔低压低氧环境的动物血液标本，保证实验结果的准确性。
升海拔阶段，根据舱内压力变化速率模型，压力-海拔速率控制速度确定方法如下：
将实验动物放进低压低氧实验舱中，将肺组织看成是一个球体，则肺内外气压变化模型如图3所示。假设当前海拔高度为
时，此时实验动物肺部体积为
，肺内气压为
，肺外气压为
；当经过时间t后，升高到海拔高度
时，此时肺内体积为
，肺内气压为
，肺外气压为
t，则可根据肺组织所受应变
明确舱内压力变化速率
的范围。
经过时间t后，在海拔高度为
时，则有：
（1）肺外气压：
（2）肺内气压：
（3）肺内、外气压差：
（4）肺组织所受应力：
（5）肺组织所受应变：
其中，
：海拔高度为
时的肺外气压，单位pa；
：海拔高度为
时的肺内气压，单位pa；
：海拔高度为
时的肺外气压，单位pa；
：舱内压力在时间t内的平均变化速率，单位pa/s；
:时间,单位s；
：摩尔气体常数，单位J·mol-1·K-1；
：温度，K；
：肺内的气体的物质的量，单位mol；
：肺内气体分子数量在时间t内的平均变化速度，单位mol·s-1；
：海拔高度为
时的肺体积，单位m3；
：肺内体积在时间t内的平均变化速度，单位m3/s；
：肺内气压与肺外气压的差,单位pa；
：肺组织的半径,单位m；
：肺泡壁的厚度,单位m；
：肺组织所受应力,单位N·m-3；
：肺组织所受应变；
：肺组织的杨氏模量，单位Pa；
根据上述公式整理得出：
由此可得出
其中，
：摩尔气体常数，取值为8.31J·mol-1·K-1；
：开尔文温度，单位K；故设定舱内使用温度为22℃时，
=295.15K；
经过上述参数的取值可得出舱内压力变化速率
，计算得出舱内压力变化速率
取值范围为-4408.28~6.00Pa/s，考虑到
应该为一个正值，故舍去负值范围，舱内压力变化速率
最终取值范围为0~6.00Pa/s。
最后通过压力-海拔高度换算公式
，设定初始海拔高度
，肺内气压为P1，经单位时间t提升海拔高度至
，肺内气压为P2，则有：
①舱内压力变化速率
；②
；③
；④海拔变化速率
现设定初始海拔高度
为0米时，肺内压力P1=101325Pa，在时间t=1秒时升高至海拔高度
，由于
取值 6.00Pa/s时可计算出海拔高度
=0.5m，故海拔高度变化速率
的取值范围为0~0.5m/s。
降海拔阶段通过控制系统按照氮气补充量模型
控制舱内氮气补充使舱内压力缓慢上升，即缓慢降低舱内模拟海拔高度的同时保持舱内氧含量始终与维持模拟海拔高度8500米的氧含量一致。其中：
表示低压低氧动物实验舱的容积，单位m3；
为摩尔气体常数，单位J
mol-1 
K-1；
为温度，单位K；N=
,表示舱内气体物质的量的补充速率的微分计算；
表示补充气体降低模拟海拔至0米所需时间；
表示海拔为海平面的气压，单位Pa；
表示海拔为h米的气压。
低压低氧动物实验舱性能验证
验证低压低氧动物实验舱性能参数，包括以下步骤：
（1）设置海拔高度变化速率为0.45米/秒，模拟海拔0~10000米，每上升1000米并稳定半小时，观察海拔上升过程中速率的稳定性和实际模拟海拔高度的稳定性。结果如表1所示，各阶段模拟海拔上升速率控制在0.41~0.49m/s的范围内，各阶段模拟海拔高度控制在设置海拔高度±10米的误差范围内，故本发明的低压低氧动物实验舱能满足模拟0~10000米海拔各个阶段低压低氧环境的实验需求；
表1.低压低氧动物实验舱模拟海拔上升阶段性能验证
| 序号 | 舱内设置压力（KPa） | 设置海拔高度（m） | 实际海拔高度（m） | 设置上升速率（m/s） | 实际上升速率（m/s） |
| 1 | 89.87 | 1000 | 995~1008 | 0.45 | 0.42-0.49 |
| 2 | 79.49 | 2000 | 1996~2008 | 0.45 | 0.44-0.48 |
| 3 | 70.10 | 3000 | 2993~3005 | 0.45 | 0.43-0.47 |
| 4 | 61.64 | 4000 | 3992~4009 | 0.45 | 0.43-0.46 |
| 5 | 54.01 | 5000 | 4996~5007 | 0.45 | 0.44-0.48 |
| 6 | 47.18 | 6000 | 5998~6009 | 0.45 | 0.41-0.46 |
| 7 | 41.06 | 7000 | 6999~7008 | 0.45 | 0.42-0.47 |
| 8 | 35.59 | 8000 | 7994~8008 | 0.45 | 0.43-0.46 |
| 9 | 30.74 | 9000 | 8999~9006 | 0.45 | 0.44-0.47 |
| 10 | 26.44 | 10000 | 9094~10009 | 0.45 | 0.42-0.48 |
（2）设置舱内压力为26.4KPa，氧含量为5.44%，海拔高度变化速度为0.45米/秒，模拟海拔高度为10000米的低压低氧环境，连续运行30天。在维持高海拔阶段，每天于10：00和22：00固定时间点记录舱内压力值、氧含量值及海拔高度值，连续记录30天，绘制压力变化曲线图、海拔高度变化曲线图即氧含量变化曲线。可见本发明的低压低氧动物实验舱在30天的运行期间，可维持舱内压力稳定在（26.43±0.02）KPa范围，如图4所示；维持舱内模拟海拔高度稳定在9990m~10010m，其平均模拟海拔高度为（10001±6.52）米，如图5所示；维持氧含量在5.53%~5.55%范围，其平均氧含量为（5.538±0.07）%，如图6所示，以上实测参数满足设定要求，其内环境达到高度稳定。
低压低氧动物实验舱在控制系统的作用下能稳定模拟0~10000米海拔高度，压力在26.4~101.3KPa之间变化，氧含量在20.95%~5.44%之间变化的低压低氧环境，为避免实验动物肺减压伤的影响能控制舱内模拟海拔高度变化速率在0~0.5米/秒，能精确控制舱内压力稳定在设置范围，能在维持高海拔阶段通过补充氧气维持舱内氧含量在设置范围，能在降海拔阶段通过补充氮气维持舱内氧含量与维持高海拔阶段的氧含量保持一致。
实施例1.急性高原低压低氧肺损伤鼠模型制备方法
使用低压低氧动物实验舱用于制备急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，具体方案如下：
1.实验方案设计及具体实验过程
⑴选取6-8周大小的雄性Balb/c小鼠18只，随机分为空白组、对照组、肺损伤组，每组各6只；
⑵将肺损伤组小鼠放入本发明低压低氧动物实验舱中，通过按键电路设置舱内模拟海拔高度8500米的预设压力值为33.1KPa、氧含量值为6.91%及压力允许波动范围33.10±1.65KPa、氧含量允许波动范围为6.91±0.34%，设置舱内海拔变化速率为0.45米/秒，设置维持高海拔期间实时补充实验小鼠消耗的氧含量，降海拔阶段补充氮气代替空气升高舱内压力至常压，持续实验时间为144小时；
⑶对照组小鼠放入本发明的低压低氧动物实验舱中，设置模拟海拔高度8500米的预设压力值为33.1KPa、氧含量值为6.91%及压力允许波动范围33.10±1.65KPa、氧含量允许波动范围为6.91±0.34%，设置舱内模拟海拔速率为5米/秒，维持高海拔期间不补充实验小鼠消耗的氧含量，在降海拔期间补充空气升高舱内压力至常压，设置在该低压低氧环境下饲养144小时；
⑷空白组放在常压常氧环境下饲养144小时。
根据实验动物具有昼伏夜出的习性设置每日周期循环，即每日18：00~00：00时间段为实验动物活动和进食的时间，中央控制器在每日18：00控制实验舱进气速率大于出气速率，以0.45米/秒的速率将模拟海拔高度从8500米降低至4500米；随后持续稳定维持模拟4500米海拔，稳定压力在57.73±2.88KPa之间变化，稳定氧含量在12.09%±0.60%的低压低氧环境持续至00：00时，随后在中央控制器的控制下以0.45米/秒的速率缓慢提升舱内模拟海拔至8500米并稳定舱内压力33.10±1.65KPa，稳定氧含量在6.91±0.34%的低压低氧环境持续运行至次日03：45完成一个周期循环，以此循环直至实验结束。
急性高原低压低氧肺损伤鼠模型制备方法的具体实验过程为：
①实验前升高海拔预适应：在实验前一天的21：30之前将实验小鼠放入低压低氧动物实验舱内，关上舱门，接通电源，中央控制器控制空气电磁阀、电磁比例阀、真空泵开启，控制舱内以常压常氧环境使小鼠提前适应，至实验前一日的21：30时，中央控制器控制舱内开始以0.45米/秒的海拔升高速率缓慢升高海拔，至实验首日的00：17时将海拔升高至4500米；此时短暂休息1小时使实验小鼠缓慢适应；01：17再次以0.45米/秒的海拔升高速率缓慢升高海拔，于03：45时升高到海拔8500米；
②维持高海拔实验期间：从实验首日的03：45开始，中央控制器控制舱内模拟海拔高度维持在8500米直至18：00，然后以0.45米/秒的速度降低至4500米海拔，使小鼠进食进水直至00：00时，最后中央控制器控制舱内模拟海拔高度以0.45米/秒的海拔升高速率缓慢升高至8500米直至次日03：45完成一个每日周期循环，以此循环，直至实验第七日的03：45时，完成144小时的模拟海拔8500米的低压低氧实验。
③实验后降低海拔：从03：45时开始，中央控制器控制舱内补充氮气替代空气升高舱内压力并维持舱内氧含量6.91±0.34%，同时以0.45米/秒的速度缓慢降低模拟海拔高度，于06：13降至4500米海拔时休息1小时，随后于07：13继续以0.45米/秒的速度缓慢降低模拟海拔高度，至10：00时舱内压力降至实验起始海拔的常压状态。开舱后对实验小鼠进行抽取动脉血检测血氧分压，使用InLiview3000B 动物 PET/SPECT/CT机进行胸部CT扫描验证肺损伤，解剖肺组织进行肺含水量检测和肺组织病理HE染色检测。
验证结果
（1）血氧分压的统计分析
开舱后立即经心脏采血方式抽取实验小鼠动脉血0.2ml经罗氏血气分析仪进行血气分析检测血氧分压，如图7所示。对照组、肺损伤组小鼠的平均血氧分压（75.25±3.37mmHg和47.18±3.94mmHg）明显低于空白组小鼠血氧分压96.53±1.95 mmHg（P＜0.0001）；同时肺损伤组与对照组相比，组间差异显著（P＜0.0001），其更能体现实验中维持高海拔阶段低压低氧环境下的血氧分压值。
（2）鼠模型的胸部CT扫描成像
将实验小鼠放入麻醉诱导盒中，调节麻醉浓度为2%和流量为2L/min，麻醉诱导小鼠，当小鼠出现除呼吸外无自主活动时，立即将小鼠转移至InLiview3000B 动物 PET/SPECT/CT机（NOVEL MEDICAL，北京永新设备有限公司）的动物台上持续麻醉，设置胸部CT扫描程序，对实验小鼠进行胸部CT扫描，如图8所示。使用本发明的低压低氧动物实验舱制备的对照组模型小鼠和肺损伤组模型小鼠的胸部CT扫描结果分别为如图8中B、C所示均可见网状或斑片状的磨玻璃阴影（图中白色箭头），提示肺损伤；同时对照组小鼠背侧可见明显减压伤导致的融合扩大的肺大泡透亮区（图中黑色箭头），而肺损伤组模型小鼠肺中未发现有肺组织减压伤的表现；以上结果说明通过控制模拟海拔变化的速率为0.45m/s，模拟8500m海拔高度的低压低氧环境，持续144小时可建立出无肺减压伤的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型。
（3）鼠模型的肺含水量（湿重/干重）检测
麻醉后解剖实验小鼠留取右肺组织，使用精密天平秤对湿重肺组织进行称重；将肺组织放入60℃恒温箱中烘烤48小时；使用精密天平秤对肺组织干重进行称重；计算肺含水量=肺组织湿重/肺组织干重；统计分析肺含水量，如图9所示。肺损伤组实验小鼠的肺含水量（4.102±0.206）明显高于空白组（3.619±0.174），且组间差异显著（ P＜0.001），说明使用本发明的低压低氧动物实验舱模拟8500米海拔的低压低氧环境下饲养144小时，可制备急性高原低压低氧肺损伤鼠模型。
（4）鼠模型的肺组织HE染色分析
具体步骤如下：
（1）肺组织病理切片的制备：
a.解剖留取实验小鼠左肺肺叶用4%多聚甲醛固定24小时后，取出组织放入包埋盒，做好标记；
b.梯度乙醇脱水：70%酒精（30min）→80%酒精（30min）→90%酒精（30min）→90%酒精（30min）→100%酒精（30min）→100%酒精（30min）；
c.石蜡包埋：包埋盒浸入软蜡中60℃恒温箱中过夜，组织常规石蜡包埋；
d.蜡块连续切片，切片厚度为5um；
（2）HE染色：
a.烤片：将肺组织病理切片置于60℃恒温箱中烘烤2小时；
b.水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→90%酒精（3min）→80%酒精（3min）→70%酒精（3min）→60%酒精（3min）→蒸馏水（3min）；
c.染色：苏木素染色10min→蒸馏水冲洗1min→1%盐酸乙醇分化10秒→蒸馏水冲洗1min→0.2%的氨水30秒→水洗1min→伊红染色5min→水洗1min；
d. 脱水：60%酒精（3min）→70%酒精（3min）→80%酒精（3min）→90%酒精（3min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）；
e.封片观察，结果如图10所示，可见对照组和肺损伤组小鼠肺组织中肺泡塌陷，肺泡间隔水肿增厚，红细胞渗出，炎细胞浸润，而空白组小鼠肺组织中未见明显上述改变，提示对照组和肺损伤组小鼠肺组织发生了严重的肺损伤，肺泡壁的通透性明显增加，说明在模拟8500米海拔的低压低氧环境下饲养144小时，可模拟出急性高原低压低氧肺损伤小鼠模型；同时对照组中融合扩大的肺大泡提示舱内压力速率变化过快可导致肺减压伤的形成。
以上实验通过检测小鼠的血氧分压证实了在维持高海拔阶段和降海拔阶段通过补充氧气和氮气维持舱内氧含量稳定可在开舱后获取实验小鼠动脉血所测血液生化值更接近于维持高海拔阶段低压低氧下的血液生化值；通过小鼠胸部CT的检测证明了经本发明的低压低氧动物实验舱的控制系统控制升海拔舱内模拟海拔高度变化速率低于0.5米/秒可避免实验小鼠出现肺减压伤；通过肺含水量检测和肺组织HE染色证实了模拟8500米海拔高度，稳定舱内压力33.10±1.65KPa，稳定氧含量在6.91±0.34%的低压低氧环境下对实验小鼠进行144小时的低压低氧实验可制备急性高原低压低氧肺损伤鼠模型。
实施例2.对急性高原低压低氧肺损伤鼠模型行99mTc-AA的肺灌注扫描成像验证肺泡壁通透性的改变
使用99mTc-AA行肺灌注扫描成像验证鼠模型肺泡壁（基底膜、血管内皮、肺泡上皮）通透性的改变包括以下过程：
⑴选取6-8周大小的雄性Balb/c小鼠12只，随机分为正常对照组和肺损伤组，每组各6只，肺损伤组使用本发明的低压低氧动物实验舱按照实施例1中急性高原低压低氧肺损伤鼠模型制备方法建立急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，正常对照组在常压常氧环境中进行饲养。
⑵制备小颗粒的99mTc-AA注射液:
a、从天津医科大学总医院核医学科获取制备99mTc-AA：①使用0.9%的氯化钠溶液淋洗钼锝[99mTc]发生器获得99mTcO4 -注射液；②取注射用亚锡聚合白蛋白一瓶，将淋洗获得的99mTcO4 -注射液按照10mCi放射性浓度，体积为1ml，加入瓶中，充分摇匀，使颗粒均匀分散成悬浮液，即可得到标记率大于95%的99mTc-AA注射液。
b、使用1ml规格的注射器吸取放射量为2mci的99mTc-AA注射液，震荡混匀后经1000目滤网过滤99mTc-AA注射液，得到颗粒粒径为8~13um的小颗粒99mTc-AA注射液;
c、使用1ml规格的注射器吸取单只小鼠检查所需的0.8mci的小颗粒99mTc-AA注射液，使用生理盐水稀释至0.8mci/100ul备用；
⑶将准备的小颗粒99mTc-AA注射液使用1ml规格的注射器经小鼠的尾静脉注入；
⑷将实验动物放入麻醉诱导盒中，调节麻醉浓度为2%和流量为2L/min，麻醉诱导小鼠，当小鼠出现除呼吸外无自主活动时，立即将小鼠转移至InLiview3000B 动物 PET/SPECT/CT机的动物台上持续麻醉，设置SPECT/CT扫描程序，依次对实验小鼠进行胸部CT定位相扫描和对肺部进行即刻扫描成像并获取图像；
⑸即刻扫描成像结束后，将小鼠取出放入笼子中，任其缓慢苏醒，自由活动；
⑹间隔一个生物半衰期4小时后，重新将小鼠放入麻醉诱导盒中，调节麻醉浓度为2%和流量为2L/min，麻醉诱导小鼠，当小鼠出现除呼吸外无自主活动时，立即将小鼠转移至InLiview3000B 动物 PET/SPECT/CT机的动物台上持续麻醉，设置SPECT/CT扫描程序，依次对实验小鼠进行胸部CT扫描定位相和对肺部进行锝[99mTc]的延迟扫描成像并获取图像；
⑺延迟扫描成像结束后，将小鼠取出放入鼠笼中，任其缓慢苏醒，自由活动；
⑻分析扫描采集的定位相图像及锝[99mTc]的即刻/延迟扫描成像，对即刻/延迟扫描成像采集的肺组织进行感兴趣区勾画，计算肺组织中的放射性计数，因放射性同位素的原子数随时间作负指数函数而衰减，可根据公式Nt=N0e—λt（其中 λ 为衰变常数，锝[99mTc] 衰变常数为 0.115；Nt表示经过t时间变化后的放射量；N0表示打药后的初始放射量；e为自然常数，取值2.71；t表示时间，单位为小时）计算出锝[99mTc]在肺组织4h内的生物代谢指数；
⑼将正常对照组和肺损伤组实验小鼠的肺组织感兴趣区中锝[99mTc]的生物代谢指数进行比较和统计分析，进而判断肺毛细血管通透性的变化。
⑽99mTc-AA行肺灌注扫描成像验证肺泡壁通透性改变原理及结果分析
优选的，当肺损伤组小鼠肺中的锝[99mTc]的生物代谢指数明显低于正常对照组小鼠肺中锝[99mTc]的生物代谢指数并具有统计学意义，则说明99mTc-AA在肺损伤组中渗出至肺泡中的多，其肺泡壁的通透性高于正常对照组动物。
锝[99mTc]在机体内的生物代谢指数分析。使用优化轮廓追踪程序的NMSoft-AIWSV1.6软件将整个肺组织作为感兴趣区，计算即刻扫描成像和延迟扫描成像肺组织中锝[99mTc]的放射性计数，并计算锝[99mTc]在肺组织中的生物代谢指数。肺损伤组小鼠在经过4小时的生物半衰期后残留在肺组织中同位素锝[99mTc]的放射性计数多于正常对照组小鼠，如图11所示，正常对照组小鼠即刻扫描成像锝[99mTc]的放射性计数为9824.37，经过4小时后的延迟扫描成像锝[99mTc]的放射性计数为5284.43；肺损伤组小鼠即刻扫描成像锝[99mTc]的放射性计数为9738.47，延迟扫描成像锝[99mTc]的放射性计数为5802.37，每组样本数n=6。统计分析肺损伤组小鼠和正常对照组小鼠肺组织中的锝[99mTc]的生物代谢指数，如图12所示，发现锝[99mTc]在肺损伤组小鼠肺组织内的生物代谢指数（9.897±2.409）明显低于正常对照组小鼠（18.94±2.632），差异具有显著性（P＜0.001）。说明99mTc-AA的肺灌注扫描可用于检测鼠模型的肺泡壁通透性的改变。该检测方法对于验证肺泡壁通透性的改变具有早期、无创、定量、连续的特点，可用于连续观察鼠模型的程度。
实施例3.对急性高原低压低氧肺损伤鼠模型进行胸部超声检查成像；
原理及步骤如下：
所述小动物胸部超声检测肺损伤原理如下：在肺的B型超声检查中，超声波在胸膜和探头之间反复来回反射，在正常充气的肺组织表现为明显高回声的平行于胸膜线的水平线，称为A线。当肺组织出现含水量增多或炎性水肿，超声波可在肺组织内反射产生起源于于胸膜线并垂直于胸膜线的长彗星尾伪影，称为B线。
⑴选取6-8周大小的雄性Balb/c小鼠12只，随机分为正常对照组和肺损伤组，每组各6只，肺损伤组使用本发明的低压低氧动物实验舱按照实施例1中急性高原低压低氧肺损伤鼠模型制备方法建立急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，正常对照组在常压常氧环境中进行饲养；⑵使用脱毛刀对实验小鼠进行胸部脱毛备皮；⑶使用小动物麻醉机持续麻醉小鼠；⑷将实验小鼠以仰卧位固定于操作台上；⑸使用超声设备及高频超声探头对小鼠胸部进行B型超声检测；
⑹获取影像学结果，如图13所示，肺损伤组小鼠可见垂直并起源于胸膜线的长彗星尾伪影的B线，如图13的B中箭头所示，而该征象未在正常对照组小鼠中发现，提示鼠模型的肺内产生了肺水肿，说明在模拟8500米海拔的低压低氧环境下饲养144小时，可制备急性高原低压低氧肺损伤鼠模型。
实施例4.对急性高原低压低氧肺损伤鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理验证
原理及步骤如下：
所述原理为：FITC-BSA是一种小分子物质，可以透过损伤的肺泡壁进入肺泡间隔甚至肺泡中。在实验动物存在肺泡壁中毛细血管内皮和基底膜的损害时，FITC-BSA被注入实验动物静脉内，FITC-BSA随血流流经肺毛细血管，可通过损害的毛细血管内皮和基底膜的间隙渗漏到肺泡间隔甚至透过肺泡上皮细胞进入肺泡内，通过解剖留取实验动物肺组织进行肺组织免疫荧光冰冻病理切片，在荧光显微镜495nm的激发光谱下，FITC可发射525nm波长的绿色荧光。根据绿色荧光是否在肺毛细血管内，可评估肺泡壁通透性，若FITC-BSA的荧光局限于血管内或血管壁内，则说明肺泡壁通透性未明显增加，若FITC-BSA的荧光出现在血管外并成放射状向外发散，则说明肺泡壁通透性明显增加。
⑴选取6-8周大小的雄性Balb/c小鼠12只，随机分为正常对照组和肺损伤组，每组各6只，肺损伤组使用本低压低氧动物实验舱按照实施例1中的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型制备方法建立急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，正常对照组在常压常氧环境中进行饲养；⑵使用无菌生理盐水将FITC-BSA溶液配置成2ug/ul的浓度；⑶使用1ml规格的注射器抽取单只小鼠用量的FITC-BSA溶液200ug/100ul，注射器经小鼠尾静脉注入FITC-BSA溶液；⑷使FITC-BSA溶液在小鼠内充分循环3小时；⑸脱颈法处死小鼠，解剖打开胸腔暴露心脏，剪开左心耳，使用注射器吸取生理盐水经右心室向肺动脉中进行灌注，直至无明显血色液体流出；⑹解剖留取实验小鼠肺组织并进行冰冻切片；⑺使用DAPI封片液进行封片；⑻荧光显微镜观察，结果如图14所示，发现FITC-BSA局限在正常对照组小鼠的肺毛细血管内，未见明显渗出于肺泡壁的FITC-BSA；而FITC-BSA从肺损伤组小鼠的肺毛细血管中向周围渗出至肺泡中，并呈放射状分布；对组织中非血管区域的肺间质进行FITC平均荧光强度统计分析，如图15所示，可见正常对照组小鼠肺组织中FITC荧光强度（1.813±0.149）明显低于肺损伤组小鼠（32.42±3.172），差异具有显著性（P＜0.01）。可说明肺损伤组小鼠的肺毛细血管通透性明显高于正常对照组小鼠。证明了使用FITC-BSA经尾静脉注射后行肺组织免疫荧光病理检测可用于验证肺泡壁的通透性改变。
实施例5.对急性高原低压低氧肺损伤鼠模型进行肺组织多重病理特殊染色验证
检测原理为：肺纤维化是正常的肺泡组织在炎症、组织结构破坏伤等原因造成损伤后经过异常修复导致的胶原纤维沉积，使用马松染色试剂盒检测肺组织中的胶原纤维组织染成蓝色或蓝绿色，其颜色深浅表示表达量的多少。超氧化物歧化酶（SOD）具有抗氧化损伤的作用，在组织中可因氧化应激损伤导致SOD的表达降低；血管内皮生长因子A（VEGFA）是一种血管内皮细胞特异性有丝分裂原，在受损伤时可表达增加，可促进血管通透性增加,同时可降低血管中维持内皮连接稳定的内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）在组织中的表达，而VE-cadherin的表达下降可加重毛细血管内皮细胞间通透性的增加；以上SOD、VEGFA、VE-cadherin进行的免疫组织化学染色，棕色表示阳性表达，其颜色深浅表示相对表达量的多少。
步骤如下：
1.急性高原低压低氧肺损伤鼠模型的制备
选取6-8周大小的雄性Balb/c小鼠12只，随机分为正常对照组和肺损伤组，每组各6只，肺损伤组使用本低压低氧动物实验舱按照实施例1中的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型制备方法建立急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，正常对照组在常压常氧环境中进行饲养；
2.肺组织病理切片的制备：
（1）解剖留取实验小鼠肺组织用4%多聚甲醛固定24小时后，取出组织放入包埋盒，做好标记；
（2）石蜡包埋：包埋盒浸入软蜡中60℃恒温箱中过夜，组织常规石蜡包埋；
（3）蜡块连续切片，切片厚度为5um；
3.多重病理特殊染色
（1）马松染色观察鼠模型肺组织中的纤维化；a.烤片：将肺组织病理切片置于60℃恒温箱中烘烤2小时；b.脱蜡至水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→90%酒精（3min）→80%酒精（3min）→70%酒精（3min）→60%酒精（3min）→蒸馏水（3min）；c.用Weigert铁苏木素染色液染色 5min;d.酸性乙醇分化液分化5s，水洗;e.Masson蓝化液返蓝3min，水洗。蒸馏水洗 1min;f.丽春红品红染色液染色5min;g.用弱酸工作液洗lmin;h.磷钼酸溶液洗1-2min，然后弱酸工作液洗1min;i.加入苯胺蓝染色液染色1min，然后加入弱酸工作液洗lmin;j.95%乙醇快速脱水2s，无水乙醇脱水3次，每次5s;k.二甲苯透明3次，每次1min，中性树胶封片；
（2）免疫组织化学染色（SOD 、VEGFA、VE-cadherin）观察肺组织损伤及肺毛细血管通透性的改变
a.烤片：将肺组织病理切片置于60℃恒温箱中烘烤半小时；b.脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×3次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟×3次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡3分钟×2次；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡3分钟×2次；蒸馏水冲洗1分钟，置于PBS缓冲液中;c.抗原修复：使用将病理切片置于沸腾的Tris-EDTA抗原修复液中于微波炉持续沸腾10min，取出后冷却至40℃以下;d.阻断内源性过氧化物酶：每张片子加入100μL的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次;e.滴加一抗：每张片子滴加100μL的一抗（SOD为1:800稀释；VEGFA为1:500稀释；VE-cadherin为1:5000稀释），37℃孵育60分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次;f.滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物：每张片子滴加100μL的酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次;g.显色：每张片子加入100μL新鲜配制的DAB显色液，室温孵育5分钟;h.复染：自来水冲洗10min，苏木素染色液孵育20秒；分化、冲洗返蓝;i.脱水、透明、封片。
镜下观察和结果分析：
染色结果如图16所示，其中，
①马松染色：肺损伤组肺组织马松染色图中蓝色区域显示胶原纤维沉积在支气管和血管周围，较正常对照组明显增加，提示低压低氧肺损伤小鼠鼠模型在低压低氧实验动物舱中进行模拟8500米海拔高度的低压低氧环境，持续144小时可造成小鼠肺组织损伤后间质纤维化的增加；
②SOD：超氧化物歧化酶（SOD）免疫组织化学染色（棕色为阳性表达）在正常对照组中呈强阳性高表达，经低压低氧144小时后明显降低了SOD在肺组织中的表达，证明了模拟8500米海拔高度的低压低氧环境，持续144小时可使肺组织受到氧化应激损伤；
③VEGFA：血管内皮生长因子（VEGFA）免疫组织化学染色（棕色为阳性表达）可见肺损伤组小鼠肺组织肺泡间隔增厚水肿，阳性区域弥漫，说明模拟8500米海拔高度的低压低氧环境，持续144小时可明显增加VEGFA在鼠模型肺组织中的表达，从而促进毛细血管通透性的增加；
④VE-cadherin：血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）免疫组织化学染色（棕色为阳性表达）可见肺损伤组小鼠肺组织中的VE-cadherin表达降明显低，说明模拟8500米海拔高度的低压低氧环境，持续144小时可促进毛细血管通透性的增加。
通过建立急性高原低压低氧肺损伤鼠模型验证了99mTc-AA的肺灌注扫描成像和FITC-BSA用于验证鼠模型在肺损伤后肺泡壁通透性的改变；可将以99mTc-AA的肺灌注扫描成像和FITC-BSA为核心，联合其它肺损伤的验证方法如小动物胸部超声、肺组织多重病理特殊染色等作为全面的该模型的验证技术参数；同时可将99mTc-AA的肺灌注扫描成像联合小动物胸部超声检查可作为一种早期、无创、定量、连续的鼠模型的验证体系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种急性高原低压低氧肺损伤鼠模型建立方法，将实验动物放入实验舱内饲养，其特征在于，所述建立方法包括以下步骤：
（1）升海拔阶段，真空泵组件的抽气速度大于补气组件的补气速度，使舱体内的气压及氧含量降低，达到模拟从起始海拔升海拔至8500米的低压低氧环境；
（2）维持高海拔阶段，模拟舱体内的气压及氧含量在海拔4500-8500米之间交替切换，维持高海拔阶段的时间为144小时以上；
（3）降海拔阶段，真空泵组件的抽气速度小于补气组件的补气速度，使舱体内的氧气总量不变，气压升高，模拟自8500米海拔降至起始海拔；
步骤（1）-（3）中模拟海拔变化的速度为0.41~0.49m/s；
所述实验舱包括舱体、控制器、分别与控制器电性连接的传感器组件、真空泵组件及补气组件；
所述传感器组件包括设于舱体内的压力传感器、氧气传感器、氮气传感器；
所述真空泵组件用于从舱体中抽气；
所述补气组件用于向舱体中补气，补气组件包括分别与舱体通过管道连通的多个气源，所述气源与舱体之间的管道上分别设有电磁阀，气源包括氧气源、氮气源及空气源。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：
在升海拔阶段，中央控制器控制真空泵组件的抽气速度大于补气组件的补气速度，通过补气组件向舱内补充空气，使舱内气压降低，并在此阶段设置平台期，使实验动物在该阶段进行适应，然后再继续降低舱内气压，直到达到模拟海拔高度的低压低氧环境；
在维持高海拔阶段，中央控制器通过在每日固定时间控制实验舱内压力的升高和降低，达到舱内在中等海拔高度和模拟海拔高度之间进行切换，满足实验动物在中等海拔高度时间段内补充食物和水，避免因能量缺乏引起饥饿性死亡；
在降海拔阶段，中央控制器控制补气组件向舱体内补充氮气替代空气升高舱体内压力同时维持舱体内氧含量恒定，直至舱体内压力恢复至常压。
3.一种如权利要求1或2所述的建立方法建立的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于，包括使用以下方法中的一种或几种方法进行检测验证：
（1）对鼠模型进行99mTc-AA的肺灌注扫描成像；
（2）对鼠模型进行胸部CT扫描成像；
（3）对鼠模型进行胸部超声检查成像；
（4）对鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像；
（5）对鼠模型进行肺组织多重病理特殊染色验证；
（6）对鼠模型进行肺含水量检查。
4.根据权利要求3所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于：对鼠模型进行99mTc-AA的肺灌注扫描成像包括以下步骤：
（1）使用0.9%的氯化钠溶液淋洗钼锝发生器获得99mTcO4 -注射液，并将其按照6~10mCi放射性浓度，1~5ml体积注射于注射用亚锡聚合白蛋白瓶内，充分摇匀，使颗粒均匀分散成悬浮液，即得到标记率大于95%的99mTc-AA注射液；
（2）对99mTc-AA注射液进行过滤；
（3）将过滤后的99mTc-AA注射液通过注射器注入小鼠静脉中，麻醉后立即于InLiview3000B 动物 PET/SPECT/CT机中采集即刻扫描成像；
（4）间隔2-4小时后麻醉小鼠进行延迟扫描成像；
（5）通过优化轮廓追踪程序的NMSoft-AIWS V1.6软件划定肺组织感兴趣区并计算肺组织内锝[99mTc]的放射性计数，根据Nt=N0e—λt计算锝[99mTc]在肺组织2-4h内的生物代谢指数；其中λ为衰变常数，Nt表示经过t时间变化后的放射量，N0表示打药后的初始放射量，e为自然常数，取值2.71，t表示时间；根据锝[99mTc]在肺组织中的生物代谢指数验证鼠模型肺泡壁通透性的改变。
5.根据权利要求3所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于：对鼠模型进行FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像，包括以下步骤：
（1）配制浓度为0.5-2ug/ul的FITC-BSA注射液；
（2）使用注射器经实验动物的静脉注射80-150ul；
（3）2-4小时后解剖留取实验动物肺组织行肺组织冰冻免疫荧光病理切片；
（4）在荧光显微镜下进行显像，观察肺泡壁通透性的改变。
6.根据权利要求3所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于：对鼠模型进行肺组织多重病理特殊染色，包括马松染色、HE染色和超氧化物歧化酶、血管内皮生长因子A、血管内皮钙粘蛋白的免疫组织化学染色。
7.根据权利要求3所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于：使用99mTc-AA的肺灌注扫描成像和FITC-BSA的肺组织冰冻免疫荧光病理显像，结合肺组织多重病理特殊染色对鼠模型验证肺泡壁通透性改变。
8.根据权利要求3所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于：
使用99mTc-AA的肺灌注扫描成像和胸部CT扫描成像，结合HE染色验证鼠模型肺组织炎性损伤和肺泡壁通透性改变。
9.根据权利要求3所述的急性高原低压低氧肺损伤鼠模型，其特征在于，使用胸部超声检查成像结合99mTc-AA的肺灌注扫描成像验证鼠模型程度。
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