CN113906012A - 异法戈明盐、使用方法和调配物 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及药物领域，并且具体地涉及异法戈明(IFG)、其新型盐和所述异法戈明、其新型盐的制备方法以及所述异法戈明、其新型盐例如在调配用于治疗戈谢氏病的药物组合物中的用途。还提供了异法戈明盐的新型结晶形式、用于制备所述结晶形式的方法以及其在用于调配药物组合物中的用途。

Description

异法戈明盐、使用方法和调配物

相关申请的交叉引用

本国际专利申请要求于2019年4月25日提交的美国临时申请第62/838,445号的优先权，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及异法戈明(isofagomine)、药学上可接受的异法戈明盐、包括异法戈明和药学上可接受的异法戈明盐的药物组合物，并且涉及异法戈明和药学上可接受的异法戈明盐在调配用于治疗戈谢氏病(Gaucher disease)的组合物中的用途。

背景技术

戈谢氏病是一种由GBA基因的突变引起的常染色体隐性病症，这会导致溶酶体酶β-葡糖脑苷脂酶(可替代地GCase)缺乏。GCase水解在白细胞和红细胞膜中的鞘糖脂降解后形成的糖脂葡糖脑苷脂。

这种积累会引起一系列临床表现，包含脾肿大、肝肿大、骨骼病症、血小板减少和贫血。(Beutler等人,“戈谢氏病”,《遗传性疾病的代谢和分子基础(The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease)》,麦格劳-希尔出版公司(McGraw-Hill,Inc.),纽约,1995,第2625-2639页。)在戈谢氏病中，各种形式的突变GCase具有降低的、很少的或没有葡糖神经酰胺切割活性，这取决于一或多个突变的氨基酸。这种病症的严重程度与残留酶活性的相对水平和所产生的底物积累程度相关。

发现特异性GCase酶抑制剂可以在酶合成期间与酶特异性地结合，使ER中的蛋白质折叠稳定，并且随后在溶酶体中的其天然位置处与酶分离，由此通过增加被加工而不是降解的酶的水平来增加酶活性。异法戈明，(3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-羟甲基哌啶，也称为IFG，是结合在野生型和突变GCase两者的活性位点并且在合成和加工期间使酶稳定并且已经显示出在增加突变形式的GCase的活性方面是有效的一种GCase酶抑制剂。在不存在“药理学分子伴侣”的情况下，突变的酶蛋白在ER中错误折叠，在其成熟成终产物的过程中延迟并且随后通过ER相关降解机制进行降解。据显示，在体外，IFG增加了戈谢氏患者的成纤维细胞中的突变GCase的活性。在授权给Sierks等人的美国专利5,844,102和授权给Lundgren等人的5,863,903中描述了此化合物的合成。

IFG异法戈明

(3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-羟甲基-哌啶

还已经显示，IFG增加了如

(一种用于治疗戈谢氏病的维拉西酶(velaglucerase)α的调配物)等GCase药物调配物的稳定性。据显示，例如作为异法戈明盐的IFG与GCase在液体组合物中的组合改进了GCase的体外稳定性，其中高蛋白质浓度可以有助于聚集。具体地，摩尔比为至少1:2.5(GCase:IFG)的液体组合物具有显著较少的GCase聚集和降解，并且提供具有较高GCase活性的调配物。参见PCT/US18/57575，所述文献的内容通过引用并入本文。

药物成分的物理化学性质可以通过选择适当的盐形式来改进。另外，单一药物成分或其盐可以以包含其水合物和溶剂化物的多种结晶形式，即，多晶型形式存在。在此方面，药物成分的替代性形式可能具有广泛不同的性质，例如增强的热力学稳定性、更高的纯度或改进的生物利用度(例如，更好的吸收、溶解模式)。特定化合物形式还可以促进化合物调配物的制造(例如，增强的流动性)、处理和储存(例如，非吸湿性、长保存期)或允许使用较低剂量的治疗剂，从而减少其潜在副作用并且确保药物成分批次与批次之间的等效性。因此，重要的是提供药物成分的新形式，包含其盐和多晶型物，由此提供用于制造、调配、储存和药物用途的改进的性质的潜力。

为了实现IFG的药物开发以及为了实现其潜力，在本领域中需要另外形式的IFG，包含其各种盐和多晶型，所述另外形式的IFG将有助于这种药物成分的改进调配物的制备，以便用于其作为活性药物成分的用途或其作为调配物中的GCase的稳定剂的用途。仍然需要可以提供更大范围的溶解性、稳定性和物理性质的另外的盐和结晶多晶型形式，所述另外的盐和结晶多晶型形式有助于GCase的储存、后续加工和生物利用度的改进。

发明内容

在对异法戈明的不同固体形式进行广泛研究后，令人惊讶地发现并证明一些异法戈明盐提供了有利的生产、处理、储存、稳定性、溶解性和/或治疗性质，所述异法戈明盐包含结晶、水合物和/或溶剂化物形式。

因此，一方面，本公开涉及一种异法戈明盐及其结晶、水合物或溶剂化物形式，其中所述异法戈明盐由有机酸制备。在另外的实施例中，所述异法戈明盐选自异法戈明奎尼酸盐、异法戈明苹果酸盐、异法戈明富马酸盐、异法戈明草酸盐、异法戈明丙二酸盐、异法戈明琥珀酸盐、异法戈明D-酒石酸盐、异法戈明环己基氨基磺酸盐(cylamate)和异法戈明抗坏血酸盐。在另一个实施例中，所述异法戈明盐呈结晶形式。在另外的实施例中，结晶异法戈明盐选自异法戈明奎尼酸盐、异法戈明富马酸盐、异法戈明草酸盐、异法戈明D-酒石酸盐。任选地，异法戈明的结晶形式的特征在于分别在表1、3、5和7中列出的三个或更多个非常强、强和中等强度的XRPD峰。

在另外的方面，本公开涉及异法戈明奎尼酸盐的结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在9.5°±0.2°、15.0°±0.2°、17.4°±0.2°、18.1°±0.2°、20.3°±0.2°、23.8°±0.2°、24.8°±0.2°和25.4°±0.2°的2θ值处具有一或多个特性峰。

在另外的方面，本公开涉及异法戈明富马酸盐的结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在16.1°±0.2°、18.3°±0.2°、18.6°±0.2°、21.9°±0.2°、23.6°±0.2°、23.8°±0.2°和25.5°±0.2°的2θ值处具有一或多个特性峰。

在另外的方面，本公开涉及异法戈明草酸盐的结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在27.8°±0.2°、32.2°±0.2°、35.3°±0.2°、36.6°±0.2°、37.4°±0.2°、38.4°±0.2°、18.5°±0.2°、19.2°±0.2°、21.4°±0.2°、22.6°±0.2°、24.5°±0.2°、24.8°±0.2°、26.8°±0.2°、20.2°±0.2°和23.7°±0.2°的2θ值处具有一或多个特性峰。

在另外的方面，本公开涉及异法戈明D-酒石酸盐的结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在9.8°±0.2°、10.5°±0.2°、15°±0.2°、15.3°±0.2°、15.8°±0.2°、17.4°±0.2°、17.9°±0.2°、18.5°±0.2°、18.9°±0.2°、19.6°±0.2°、21.1°±0.2°、21.7°±0.2°、22°±0.2°、24.2°±0.2°、24.8°±0.2°、26.6°±0.2°、27.1°±0.2°、27.4°±0.2°、33.8°±0.2°、35.7°±0.2°、36.5°±0.2°和37.5°±0.2°的2θ值处具有一或多个特性峰。

本公开的另外的方面包含包括异法戈明(IFG)和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在本公开的药物组合物的一些实施例中，IFG是用于GCase活性成分的稳定剂。在某些实施例中，IFG呈游离碱或盐形式(包含其结晶、水合物和溶剂化物形式)。在另一方面中，异法戈明以足以降低GCase活性成分的降解的量存在；所述量可以显著低于单独的或者当在常规组合疗法中以治疗有效量与GCase活性成分组合施用IFG时的IFG的治疗有效量。在一些实施例中，所述组合物包括60-180mg/mL的葡糖脑苷脂酶(GCase)。在一些实施例中，所述GCase是维拉西酶α。在另外的方面，提供了一种组合物，其包括摩尔比为以下的GCase和IFG：至少约1:>2.5(即，1:x，其中x大于2.5)、约1:3或约1:2.5到约1:3.5。在另外的实施例中，所述组合物进一步包括柠檬酸钠缓冲液、蔗糖和表面活性剂，所述表面活性剂选自PS20、PS80或泊洛沙姆188。在药物组合物的另外的实施例中，所述异法戈明盐的纯度为至少95％。

在本公开的另一方面，提供了一种制备本文所述的药物组合物中的任何药物组合物的方法，所述方法包括将IFG和药学上可接受的载体组合的步骤。一些实施例包括将IFG、GCase和药学上可接受的载体组合的步骤。本文所提供的方法的另外的实施例包括：将所述异法戈明溶解在水中；将pH调节到约6.0；以及添加所述葡糖脑苷脂酶以产生所述组合物。

在另一方面中，提供了一种治疗与GCase途径功能障碍相关的病症或预防与GCase途径功能障碍相关的症状的表现的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述组合物是静脉内或皮下施用的。在一些实施例中，所述组合物是皮下施用的，例如通过皮下注射。在一些实施例中，所述组合物是每周两次、每周一次、小于每周一次或每隔一周一次施用的。

本公开的另一方面涉及一种治疗戈谢氏病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用此类治疗：i)治疗有效量的如以上定义的异法戈明盐或其药物组合物；或ii)治疗有效量的包括异法戈明和GCase的组合物，其中异法戈明是用于所述GCase的稳定性赋形剂。所述治疗可以作为单一疗法或组合疗法进行。在另一方面中，本公开涉及一种用作药物，优选地用于治疗戈谢氏病的异法戈明盐。

在另一方面中，本公开涉及产生异法戈明盐的方法，所述方法包括以下步骤：i)将有机酸溶解在极性质子溶剂中以产生溶液1；ii)将异法戈明游离碱溶解在极性质子溶剂中以产生溶液2；iii)将溶液1和溶液2组合，由此形成沉淀物；iv)分离与异法戈明的有机酸盐相对应的沉淀物。在另外的实施例中，所述有机酸选自奎尼酸、富马酸、草酸、丙二酸、D-酒石酸、L-酒石酸、琥珀酸、环己基氨基磺酸和抗坏血酸。在一些实施例中，所述异法戈明盐呈结晶形式。在另外的实施例中，所述异法戈明游离碱的纯度为至少约98％。

这些方面及其优选实施例也在权利要求中另外限定。

附图说明

图1是异法戈明奎尼酸盐的特性x-射线粉末衍射(XRPD)光谱。

图2是异法戈明奎尼酸盐的特性FT-拉曼光谱。200到3500cm-1的光谱(图2a)和200到2000cm-1的光谱的指纹区(图2B)。

图3是异法戈明奎尼酸盐的特性1H NMR光谱。

图4是异法戈明奎尼酸盐的TG-IR分析的TGA热谱图。

图5是异法戈明奎尼酸盐的差示扫描量热法(DSC)分析。

图6是异法戈明奎尼酸盐的动态蒸汽吸附(DVS)等温线。

图7是异法戈明富马酸盐的特性XRPD光谱。

图8是异法戈明富马酸盐的特性FT-拉曼光谱：200到3500cm-1的光谱(图8A)和200到2000cm-1的光谱的指纹区(图8B)。

图9是异法戈明富马酸盐的特性1H NMR光谱。

图10是异法戈明富马酸盐的TG-IR分析的TGA热谱图。

图11是异法戈明富马酸盐的DSC分析。

图12是异法戈明富马酸盐的DVS等温线。

图13是异法戈明草酸盐的特性XRPD光谱。

图14是异法戈明草酸盐的特性FT-拉曼光谱：200到3500cm-1的光谱(图13A)和200到2000cm-1的光谱的指纹区(图13B)。

图15是异法戈明草酸盐的特性1H NMR光谱。

图16是异法戈明草酸盐的TG-IR分析的TGA热谱图。

图17是异法戈明草酸盐的DSC分析。

图18是异法戈明草酸盐的DVS等温线。

图19是异法戈明D-(-)-酒石酸盐的特性XRPD光谱。

图20是与根据实例1-4制备的异法戈明盐相对应的XRPD光谱的叠加。

图21是异法戈明D-(-)-酒石酸盐(1:1)的特性FT-拉曼光谱：200到3500cm-1的光谱。

图22是异法戈明D-(-)-酒石酸盐(1:1)的特性1H NMR。

图23是异法戈明D-(-)-酒石酸盐(1:1)的TG-IR分析的TGA热谱图。

图24是异法戈明D-(-)-酒石酸盐(1:1)的DSC分析。

图25是异法戈明D-(-)-酒石酸盐(1:1)的DVS等温线。

具体实施方式

定义

新形式和调配物提供了改进药物药品的制造、调配和性能特性的机会。本公开包含具有如改进的稳定性、流动性和纯度等改进的物理化学性质的新形式的异法戈明。

在本公开的上下文内以及在使用每个术语的具体上下文中，本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。下面或在本说明书的其它地方讨论了某些术语，以在描述本公开的组合物和方法以及如何制备和使用本公开的组合物和方法时向从业者提供另外的指导。

如在本文中可互换使用的术语“异法戈明”和“IFG”包含作为游离碱形式的异法戈明以及本文所公开的任何盐形式，除非另外特别说明。除非特别说明，否则所述术语进一步包含其中材料可以是无定形或结晶形式。

如本文所使用的术语“结晶”是指可以是水合和/或溶剂化的材料，所述材料具有化学部分的足够的有序性以通过XRPD或其它衍射技术表现出可辨别的衍射图。通常，通过溶解在溶液中的化合物的直接结晶或通过在不同结晶条件下获得的晶体的相互转化而获得的结晶材料将具有含有结晶中使用的溶剂的晶体，称为结晶溶剂化物。此外，进行结晶的具体溶剂系统和物理实施例(统称为结晶条件)可能导致结晶材料具有结晶条件特有的物理和化学性质，这通常是由于化合物的化学部分在晶体内相对于彼此的取向和/或化合物的具体多晶型形式在结晶材料中的优势。本领域的科学家能够理解，可以表征本文讨论的物理和化学性质，其中实验误差取决于仪器的条件、样品制备和样品纯度。具体地，本领域的科学家普遍知道，X-射线衍射图通常可能会随着实验条件的变化而变化。需要指出的是，X-射线衍射图的相对强度可能随着实验条件的变化而变化；因此，峰值强度的顺序不能被认为是唯一的或决定因素。此外，通常，峰值角的实验误差为5％或更小，因此应考虑这种误差，并且通常所允许误差为±0.2°θ。另外，由于包含样品高度的实验因素的影响，峰值角可能具有整体偏移；通常允许一定的偏移。因此，本领域的科学家可以理解，本公开中的晶形的X-射线衍射图不应与本文所示的实例的X-射线衍射图完全相同。其X-射线衍射图具有相同或类似特性峰的任何晶形均应在本公开的范围内。本领域的科学家可以将本公开中示出的图案与未知晶形的图案进行比较，以鉴定这两组图案是否反映相同或不同的晶形。

在本公开中，“结晶形式”和“多晶型形式”以及其它相关术语是指其晶体结构处于特殊晶形状态的固体化合物。多晶型物的物理和化学性质的差异可以体现在储存稳定性、压缩性、密度、溶解速率等方面。在极端情况下，溶解性或溶解速率的差异可能导致药物无效，甚到产生毒性。

如本文所使用的术语“无定形”是指包括化合物的组合物，所述化合物含有过少的结晶含量以致于无法通过XRPD或其它衍射技术产生可辨别的图案。玻璃质材料是一种无定形材料。玻璃质材料不具有真正的晶格，并且在技术上类似于非常粘的非结晶液体。玻璃可以被更好地描述为准固体无定形材料，而不是真正的固体。

如本文所使用的，术语“溶剂的体积”是指每克待溶解材料所使用的溶剂毫升数。例如，溶解在8体积溶剂中的1g酒石酸将溶解在8毫升溶剂中。

术语“戈谢氏病”包含1型、2型和3型(包含3a、3b和3c)及其基于表型表现的中间体和亚组。

术语“有效量(effective amount)”和“有效量(amount effective)”是指足以引起治疗反应的量。治疗反应可以是用户(例如，临床医生)将识别为对疗法具有有效反应的任何反应，包含一或多种症状和替代临床标志物的改善。因此，患有戈谢氏病的患者的治疗反应将通常是戈谢氏病的一或多种症状的改善。“治疗有效量”将根据所使用的调配物、戈谢氏病的类型和其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。治疗反应也将是帕金森氏病(Parkinson's disease)或如路易体痴呆(Lewy BodyDementia)等其它α-突触核蛋白病的一或多种症状的改善，本文的组合物被考虑用于治疗所述疾病。

短语“药学上可接受的”是指生理上可耐受的并且当向人施用时通常不以不可接受的水平产生不良反应的分子实体和组合物。优选地，如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出的可用于动物，并且更具体地用于人。

如本文所使用的，术语“约”是指此术语所限定值的至多+/-10％。例如，约50mM是指50mM+/-5mM；约4％是指4％+/-0.4％。

如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数。因此，例如，提及“一个”载体包含一或多个载体。

如本文所使用的，表述“环境温度”和“室温”是本领域所理解的，并且通常是指约为进行反应的房间的温度，例如通常为约20到22℃(68到72℉)的温度，例如反应温度。更具体地，不对材料或反应混合物进行加热或冷却。

术语“受试者”是指任何哺乳动物，包含但不限于被分类为此类动物的任何动物，包含人、非人灵长类动物、灵长类动物、狒狒、黑猩猩、猴子、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、兔、猫、狗、马、牛、绵羊、山羊、猪等。术语“受试者”可以与术语“患者”互换使用。

如本文所使用的短语“肠胃外施用(parenteral administration、administeredparenterally和administer parenterally)”是指除了肠内施用和局部施用之外的通常通过注射进行的施用方式，并且包含但不限于静脉内(IV)、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下(SC)、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。

术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”是指导致预防症状的化合物的量，例如预防80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的症状(例如，被诊断为患有戈谢氏病的受试者的戈谢氏病的症状)、延迟症状发作或改善戈谢氏病的症状。治疗有效量将例如足以治疗与戈谢氏病相关的病症的一或多种症状、预防所述症状、降低所述症状的严重程度、延迟所述症状的发作和/或降低发生所述症状的风险。有效量可以通过本领域众所周知的方法并且如本说明书的后续部分中描述的方法来确定。

术语“治疗(treatment)”和“治疗方法(therapeutic method)”是指对现有病症的治疗和/或用于预防与所述病症相关的症状的发生或减轻的预防/预防性措施。需要治疗的人可以包含已经患有如GCase途径功能障碍等特定医学病症的个体，以及处于患有所述病症的风险的个体或可能最终患上所述病症的个体。例如通过与病症的发展、病症的存在或进展或对患有病症的受试者的治疗的可能接受性相关的一或多种风险因素的存在来评估对治疗的需要。治疗可以包含减缓或逆转病症或其症状的进展。

术语“治疗”是指以有效改善或预防与病症(例如，本文所述的病症)相关的病状、症状或参数或预防病症的发作、进展或恶化的量、方式和/或模式以统计学显著的程度或本领域的技术人员可检测的程度施用疗法。因此，治疗可以达到治疗效果。有效量、方式或模式可以根据受试者而变化并且可以针对受试者进行调整。在某些实施例中，对与GCase途径功能障碍相关的病症(例如，戈谢氏病)的治疗是导致例如尚未针对GCase途径功能障碍进行治疗的受试者的血红蛋白浓度增加、血小板水平增加、肝脏体积减少、脾脏体积减少或骨骼参数改变(例如，骨矿物质密度增加)中的一或多项的治疗。在某些实施例中，对与GCase途径功能障碍相关的病症(例如，戈谢氏病)的治疗是导致例如已经针对GCase途径功能障碍进行治疗的受试者的血红蛋白浓度增加、血小板水平增加、肝脏体积减少、脾脏体积减少或骨骼参数改变(例如，骨矿物质密度增加)或这些参数中的一或多个参数的维持中的一或多项的治疗。

术语“组合”是指将两种或更多种药剂或疗法用于治疗同一患者，其中药剂或疗法的使用或作用在时间上重叠。药剂或疗法可以同时施用(例如，作为施用于患者的单一调配物或作为同时施用的两种单独的调配物)或者以任何顺序依次地施用。

如本文所使用的，术语“缓释”、“缓释递送”和“缓释药物递送”是指药物的单次施用将药物在血液中的有效浓度维持较长时间段，例如12小时或更长时间。例如，多肽的一般施用途径是皮下、肌内或静脉内(IV)注射。

术语“个体”、“受试者”或“患者”可以互换使用并且是指任何哺乳动物，包含但不限于被分类为此类动物的任何动物，包含人、非人灵长类动物、灵长类动物、狒狒、黑猩猩、猴子、啮齿动物(如小鼠、大鼠)、兔、猫、狗、马、牛、绵羊、山羊、猪等。

“需要治疗的个体”是已经发展或可能发展成戈谢氏病或如帕金森氏病等α-突触核蛋白病的个体。在一个实施例中，个体是德系犹太人群体的成员，其已经被诊断患有或已经被鉴定为由于Gba基因的遗传突变而具有增加的发展戈谢氏病的风险。然而，术语“个体”涵盖世界上患有戈谢氏病或在遗传上处于发展为戈谢氏病的风险，或处于发展为如帕金森氏病等α-突触核蛋白病的风险的任何人。

如在本文中用于描述异法戈明盐的短语“基本上纯的”是指异法戈明盐含有不超过约2％的另一种化合物。优选地，“基本上纯的”异法戈明盐含有约2％或更少的任何其它化合物、约1.8％或更少的任何其它化合物、约1.6％或更少的任何其它化合物、约1.5％或更少的任何其它化合物、约1.3％或更少的任何其它化合物。甚至更优选地，“基本上纯的”异法戈明盐含有约1％或更少的任何其它化合物、约0.8％或更少的任何其它化合物、约0.6％或更少的任何其它化合物、约0.5％或更少的任何其它化合物、约0.3％或更少的任何其它化合物。

纯度百分比可以由本领域的技术人员确定，包含通过HPLC分析或分析薄层色谱法。其它方法是本领域普通技术人员已知的并且包含色谱方法和分光光度方法。

关于GCase、维拉西酶或维拉西酶α的术语“单位”是指在37℃下每分钟将一微摩尔对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷转化成对硝基苯酚或将4-甲基伞形酮β-D-吡喃葡萄糖苷转化成4-甲基伞形酮所需的这些的量。

根据本公开，提供了异法戈明的特定盐形式。所提供的异法戈明盐及其结晶形式与先前描述的异法戈明形式相比具有改进的特性，所述改进的特性包含改进的合成可制造性。例如，在如水和乙醇等溶剂中可以更容易地对所描述的IFG的有机酸盐进行纯化。此外，所提供的形式中的一些形式，例如IFG-富马酸盐，具有与其它已知的异法戈明盐形式类似或更高的稳定性。本文所提供的IFG盐还特别适于工业规模生产，例如大于1kg产品的生产。

在本公开的一些实施例中，有机酸的异法戈明盐是通过以下通用方案制备的。

溶液1的制备如下：将有机酸溶解在极性质子有机溶剂中。溶剂的量不受特别限制。优选地，将有机酸溶解在溶剂中。通常，可以使用2到10体积的溶剂，例如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10体积的溶剂或其之间的任何量。

在一个实施例中，所使用的溶剂的量是在室温下实现完全溶解所必需的最小量。通常，溶液是在室温下制备的，但设想了其中加热溶剂例如以加速溶解或产生超饱和溶液的实施例。在下一步骤之前，可以过滤溶液以去除任何未溶解的物质。可替代地，可以使用浆料法，其中在随后步骤中与溶液2组合之前物质未完全溶解。

溶液2的制备如下：将相对于在溶液1的制备中所使用的有机酸等摩尔量的异法戈明溶解在极性质子有机溶剂中。溶剂的量不受特别限制。优选地，将异法戈明溶解在溶剂中。通常，可以使用2到10体积的溶剂，例如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10体积的溶剂或其之间的任何量。

在一个实施例中，所使用的溶剂的量是在室温下实现完全溶解所必需的最小量。通常，溶液是在室温下制备的，但设想了其中加热溶剂例如以加速溶解或产生超饱和溶液的实施例。在下一步骤之前，可以过滤溶液以去除任何未溶解的物质。可替代地，可以使用浆料法，其中在随后步骤中与溶液1组合之前物质未完全溶解。

在特定实施例中，溶液1是用有机酸制备的。适用于本发明实施例的有机酸包含奎尼酸、马来酸、富马酸、草酸、丙二酸、D-酒石酸、L-酒石酸、琥珀酸、环己基氨基磺酸和抗坏血酸。

然后将溶液2缓慢地添加到溶液1中，由此形成沉淀物。在室温下搅拌后，将所获得浆液过滤，并且将所得固体物质用醇溶剂洗涤、脱液并且然后在真空中干燥。分离产率的范围通常在理论产率的40％与80％之间。

在某些实施例中，所获得的异法戈明选自异法戈明奎尼酸盐、异法戈明苹果酸盐、异法戈明富马酸盐、异法戈明草酸盐、异法戈明丙二酸盐、异法戈明琥珀酸盐、异法戈明D-酒石酸盐、异法戈明环己基氨基磺酸盐和异法戈明抗坏血酸盐。在特定实施例中，所获得的异法戈明盐是结晶的，如通过使用例如x-射线粉末衍射技术或本领域已知的其它衍射技术测量衍射峰所证实的。

在另外的实施例中，异法戈明选自异法戈明奎尼酸盐、异法戈明富马酸盐、异法戈明草酸盐、异法戈明D-酒石酸盐，呈结晶形式，其特征在于分别在表1、3、5和7中列出的三个或更多个非常强、强和中等强度的XRPD峰。

在特定实施例中，IFG是异法戈明奎尼酸盐，其特征在于x-射线衍射图在表1中列出的例如选自以下的至少一个、至少两个或至少三个的2θ值处具有一或多个、两个或更多个、或三个或更多个特性峰：9.5°±0.2°、15.0°±0.2°、17.4°±0.2°、18.1°±0.2°、20.3°±0.2°、23.8°±0.2°、24.8°±0.2°和25.4°±0.2°。在另外的实施例中，IFG是异法戈明奎尼酸盐，其特征在于x-射线衍射图在17.4°±0.2°、15.0°±0.2°、18.1°±0.2°、20.3°±0.2°和24.8°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。在特定实施例中，IFG是异法戈明奎尼酸盐，其特征在于x-射线衍射图在15.0°±0.2°、17.4°±0.2°、18.1°±0.2°和20.3°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。

在特定实施例中，IFG是异法戈明富马酸盐，其特征在于x-射线衍射图在表3中列出的例如选自以下的至少一个、至少两个或至少三个的2θ值处具有一或多个、两个或更多个、或三个或更多个特性峰：16.1°±0.2°、18.3°±0.2°、18.6°±0.2°、21.9°±0.2°、23.6°±0.2°、23.8°±0.2°和25.5°±0.2°。在特定实施例中，IFG是异法戈明富马酸盐，其特征在于x-射线衍射图在23.6°±0.2°、23.8°±0.2°和25.5°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。

在特定实施例中，IFG是异法戈明草酸盐，其特征在于x-射线衍射图在表5中列出的例如选自以下的至少一个、至少两个或至少三个的2θ值处具有一或多个、两个或更多个、或三个或更多个特性峰：27.8°±0.2°、32.2°±0.2°、35.3°±0.2°、36.6°±0.2°、37.4°±0.2°、38.4°±0.2°、18.5°±0.2°、19.2°±0.2°、21.4°±0.2°、22.6°±0.2°、24.5°±0.2°、24.8°±0.2°、26.8°±0.2°、20.2°±0.2°和23.7°±0.2°。在特定实施例中，IFG是异法戈明草酸盐，其特征在于x-射线衍射图在18.5°±0.2°、19.2°±0.2°、21.4°±0.2°、22.6°±0.2°、24.5°±0.2°、24.8°±0.2°、26.8°±0.2°、20.2°±0.2°和23.7°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。在特定实施例中，IFG是异法戈明草酸盐，其特征在于x-射线衍射图在20.2°±0.2°和23.7°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。

在特定实施例中，IFG是异法戈明D-酒石酸盐，其特征在于x-射线衍射图在表5中列出的例如选自以下的至少一个、至少两个或至少三个的2θ值处具有一或多个、两个或更多个、或三个或更多个特性峰：9.8°±0.2°、10.5°±0.2°、15.0°±0.2°、15.3°±0.2°、15.8°±0.2°、17.4°±0.2°、17.9°±0.2°、18.5°±0.2°、18.9°±0.2°、19.6°±0.2°、21.1°±0.2°、21.7°±0.2°、22°±0.2°、24.2°±0.2°、24.8°±0.2°、26.6°±0.2°、27.1°±0.2°、27.4°±0.2°、33.8°±0.2°、35.7°±0.2°、36.5°±0.2°和37.5°±0.2°。在另外的实施例中，IFG是异法戈明D-酒石酸盐，其特征在于x-射线衍射图在10.5°±0.2°、15.0°±0.2°、15.3°±0.2°、18.5°±0.2°、26.6°±0.2°、21.1°±0.2°、21.7°±0.2°和24.2°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。在特定实施例中，IFG是异法戈明D-酒石酸盐，其特征在于x-射线衍射图在21.1°±0.2°、21.7°±0.2°和24.2°±0.2°的2θ值处具有至少一个、至少两个或至少三个特性峰。

用于本公开的极性质子有机溶剂通常包括一或多种低级脂肪族醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等，并且还可以包含水。优选地，使用甲醇和/或乙醇。

在一个实施例中，酸溶液(溶液1)用先前获得的期望的异法戈明盐的结晶物质进行接种，例如以便获得更高的产率或更迅速地产生晶体生长。

在某些实施例中，在溶解之前将异法戈明游离碱进行纯化以用于溶液2。纯化技术是本领域已知的技术并且包含色谱法。在一个实施例中，异法戈明的纯化包含在硅胶上或通过离子交换树脂系统进行色谱法。这些色谱方法去除各种杂质，如在异法戈明合成期间，例如在氢化(3R,4R,5S,6S)-6-(苄氧基)-4,5-二羟基四氢-2H-吡喃-3-甲腈以产生异法戈明的步骤期间形成的中间体。通过对异法戈明游离碱进行纯化而去除的一些杂质包含二聚胺物种、环状亚胺中间体和其它未鉴定的中间体或副产物。通过对异法戈明游离碱进行纯化而去除的具体杂质包含以下鉴定的杂质。

在一个实施例中，在目前描述的制备IFG盐的方法中使用的IFG游离碱含有少于2％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％的杂质。更具体地，在目前描述的制备IFG盐的方法中使用的IFG游离碱含有少于2％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％的杂质SRD006961、SRD006927、SRD006987和SRD006925中的任何一种杂质。在另外的实施例中，IFG游离碱不包括SRD006961、SRD006927、SRD006987和SRD006925中的一或多种。

在另外的实施例中，在目前描述的制备IFG盐的方法中使用的IFG游离碱的纯度为至少90％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％(w/w)。

在另一个实施例中，所产生的IFG盐的纯度为至少95％、96％、97％、98％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％(w/w)。

葡糖脑苷脂酶

维拉西酶是通过在人细胞系中进行基因激活，如通过与启动子进行靶向重组而产生的人β-葡糖脑苷脂酶(GCase)，所述启动子激活所选人细胞系中的内源性β-葡糖脑苷脂酶基因。维拉西酶作为大约63kDa的单体糖蛋白分泌。维拉西酶由具有与天然人蛋白相同的序列的497个氨基酸构成。参见Zimran等人,《血细胞、分子与疾病(Blood Cells MolDis)》,2007,39:115-118。

维拉西酶α的糖基化可以通过在细胞培养期间使用kifunensine(一种甘露糖苷酶I抑制剂)来改变，以便产生主要含有每聚糖具有6-9个甘露糖单元的高甘露糖型聚糖的分泌蛋白，如WO 2013/130963中更详细描述的。

伊米苷酶(imiglucerase)

是重组人β-葡糖脑苷脂酶的另一种形式。伊米苷酶是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组产生的。

他利西酶α(

或

)是在植物细胞中表达的重组葡糖脑苷脂酶(prGCase)。植物重组葡糖脑苷脂酶可以通过至少在美国专利公开号2009/0208477和2008/0038232以及PCT公开号WO 2004/096978和WO 2008/132743中描述的方法获得。

任何重组GCase均可以使用本领域已知的生物反应器和生产规模合成方法来产生。可以使用任何数量的生产规模纯化系统。

药物组合物

在某些实施例中，提供了一种包括异法戈明(IFG)和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，IFG是有机酸盐形式。在另外的实施例中，IFG选自异法戈明奎尼酸盐、异法戈明甲酸盐、异法戈明苹果酸盐、异法戈明草酸盐、异法戈明丙二酸盐、异法戈明琥珀酸盐、异发戈明环己基氨基磺酸盐、异发戈明D-酒石酸盐和异发戈明抗坏血酸盐。在另外的实施例中，异法戈明选自异法戈明奎尼酸盐、异法戈明富马酸盐、异法戈明草酸盐、异法戈明D-酒石酸盐，并且呈结晶形式。在另外的实施例中，结晶形式的特征在于分别在表1、3、5和7中列出的三个或更多个非常强、强和中等强度的XRPD峰。

在某些实施例中，提供了一种包括IFG的组合物，其中IFG作为新型赋形剂是有效的，所述赋形剂使本文所述的用于注射的调配物中的葡糖脑苷脂酶(GCase)酶稳定，并且进一步使注射部位和体内的GCase酶稳定，即，IFG是用于GCase活性成分的稳定剂。在一些实施例中，所述组合物是水溶液。在一些实施例中，所述组合物是冻干物。在另一方面中，IFG以足以降低GCase活性成分的降解的量存在；在某些实施例中，IFG的量可以显著低于单独的或者当在常规组合疗法中以治疗有效量与GCase活性成分组合施用IFG时的IFG的治疗有效量。在某些实施例中，IFG至少约2.5、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5倍摩尔过量于GCase。在另外的实施例中，如果作为单一活性剂施用，则组合物中的IFG包括不会增加内源性血清GCase活性的量。在某些实施例中，IFG以足以维持组合物中的GCase的稳定性的量存在。在一些实施例中，IFG以足以在0-50℃下维持组合物中的GCase的稳定性持续至少三天的量存在。在一些实施例中，IFG以足以在0-40℃下维持组合物中的GCase的稳定性持续至少6个月的量存在。

在另外的方面，提供了一种组合物，其包括摩尔比为以下的葡糖脑苷脂酶(GCase)和IFG：约1:2.5到约1:5或约1:>2.5(即，1:x，其中x大于2.5)。在另外的实施例中，如果作为单一活性剂施用，则x大于2.5且小于将增加内源性血清GCase活性的量。在一些实施例中，所述GCase是维拉西酶α。在一些实施例中，GCase与IFG的摩尔比为约1:1到约1:30。在本文所述的IFG/GCase组合物的一些实施例中，IFG是本文所述的IFG盐。

在本文所述的IFG/GCase组合物的一些实施例中，组合物是包括0.5到5.0mg/kg体重GCase并且还包括IFG(包含本文所述的游离碱、盐和结晶形式)的剂型，例如其中IFG至少约1、1.25、1.5、2、2.5、3、4或5倍摩尔过量于GCase。在一些实施例中，如果作为单一药剂施用，则组合物中的IFG包括不会增加内源性血清GCase活性的量。在一些实施例中，所述组合物包括0.8到4.0mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括1.0到3.0mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括1.2到2.0mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括约1.5mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括1.5mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括2.0到5.0mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括2.25到4.5mg/kgGCase。在一些实施例中，所述组合物包括2.25到3.75mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括3.5到5.0mg/kg GCase。在一些实施例中，IFG 1到5倍或1到10倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 2到10倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 10到30倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 30到100倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG2.5到3.5倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 3倍摩尔比率于GCase。

在任何所提供的组合物，例如在重构时冻干的组合物中的GCase的浓度可以为约60mg/ml到约180mg/ml、约65mg/ml到约175mg/ml、约70mg/ml到约170mg/ml、约75mg/ml到约165mg/ml、约80mg/ml到约160mg/ml、约85mg/ml到约155mg/ml、约90mg/ml到约150mg/ml、约95mg/ml到约145mg/ml、约100mg/ml到约140mg/ml、约105mg/ml到约135mg/ml、约110mg/ml到约130mg/ml或约115mg/ml到约125mg/ml。在替代性实施例中，在任何所提供的组合物中的GCase的浓度可以在选自以下的任何两个浓度之间的范围内：60mg/ml、63mg/ml、66mg/ml、69mg/ml、72mg/ml、75mg/ml、78mg/ml、81mg/ml、84mg/ml、87mg/ml、90mg/ml、93mg/ml、96mg/ml、99mg/ml、102mg/ml、105mg/ml、108mg/ml、111mg/ml、114mg/ml、117mg/ml、120mg/ml、123mg/ml、126mg/ml、129mg/ml、132mg/ml、135mg/ml、138mg/ml、141mg/ml、144mg/ml、147mg/ml、150mg/ml、153mg/ml、156mg/ml、159mg/ml、162mg/ml、165mg/ml、168mg/ml、171mg/ml、174mg/ml、177mg/ml和180mg/ml。在某些实施例中，在任何所提供的组合物中的GCase的浓度为约120mg/ml到约160mg/ml、约125mg/ml到约155mg/ml、约130mg/ml到约150mg/ml、约135mg/ml到约145mg/ml或为约140mg/ml。

在替代性实施例中，在本文公开的任何组合物，例如在重构时冻干的组合物中的GCase的浓度可以为约30mg/ml到约200mg/ml、约40到约180mg/ml、约40mg/ml到约180mg/ml、约50mg/ml到约160mg/ml、约55mg/ml到约140mg/ml、约60到约120mg/ml、约0.5到约10mg/ml、约5到约15mg/ml、约10到约20mg/ml、约15到约25mg/ml、约20到约30mg/ml、约25到约35mg/ml、约30到约40mg/ml、约2到约8mg/ml、约5到约11mg/ml、约8到约14mg/ml、约11到约17mg/ml、约14到约20mg/ml、约17到约23mg/ml、约20到约26mg/ml、约23到约29mg/ml、约26到约32mg/ml、约29到约35mg/ml、约32到约38mg/ml、约2到约5mg/ml、约5到约8mg/ml、约8到约11mg/ml、约11到约14mg/ml、约14到约17mg/ml、约17到约20mg/ml、约20到约23mg/ml、约23到约26mg/ml、约26到约29mg/ml、约29到约32mg/ml、约32到约35mg/ml、约35到约38mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml、约30mg/ml、约31mg/ml、约32mg/ml、约33mg/ml、约34mg/ml、约35mg/ml、约36mg/ml、约37mg/ml、约38mg/ml、约39mg/ml或约40mg/ml。

GCase的浓度可以为50单位/毫升到200单位/毫升、70单位/毫升到160单位/毫升、80单位/毫升到175单位/毫升、90单位/毫升到190单位/毫升、60单位/毫升到145单位/毫升、50单位/毫升到130单位/毫升、80单位/毫升到140单位/毫升、70单位/毫升到120单位/毫升、60单位/毫升到100单位/毫升、50单位/毫升到85单位/毫升、90单位/毫升到160单位/毫升、100单位/毫升到180单位/毫升、120单位/毫升到200单位/毫升、90单位/毫升到125单位/毫升、80单位/毫升到105单位/毫升、70单位/毫升到100单位/毫升、60单位/毫升到90单位/毫升、50单位/毫升到80单位/毫升、100单位/毫升到140单位/毫升、115单位/毫升到160单位/毫升、130单位/毫升到180单位/毫升、145单位/毫升到200单位/毫升、100单位/毫升到115单位/毫升、90单位/毫升到105单位/毫升、80单位/毫升到95单位/毫升、70单位/毫升到85单位/毫升、60单位/毫升到75单位/毫升、50单位/毫升到65单位/毫升、110单位/毫升到125单位/毫升、120单位/毫升到135单位/毫升、130单位/毫升到145单位/毫升、140单位/毫升到160单位/毫升、160单位/毫升到180单位/毫升、180单位/毫升到200单位/毫升、约50单位/毫升、约60单位/毫升、约70单位/毫升、约80单位/毫升、约90单位/毫升、约100单位/毫升、约110单位/毫升、约120单位/毫升、约130单位/毫升、约140单位/毫升、约150单位/毫升、约160单位/毫升、约170单位/毫升、约180单位/毫升、约190单位/毫升、约200单位/毫升、50单位/毫升、60单位/毫升、70单位/毫升、80单位/毫升、90单位/毫升、100单位/毫升、110单位/毫升、120单位/毫升、130单位/毫升、140单位/毫升、150单位/毫升、160单位/毫升、170单位/毫升、180单位/毫升、190单位/毫升或200单位/毫升。

在各个实施例中，所述组合物包括葡糖脑苷脂酶(GCase)和异法戈明(IFG)，其中IFG可以是本文提供的游离碱、盐或结晶形式，其中IFG以至少约1:1、1:1.5、1:2或1:2.5(GCase:IFG)的摩尔比存在。GCase与IFG的摩尔比可以在选自以下的任何两个值之间的范围内：1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3.0、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4.0、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5.0、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6.0、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7.0、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8.0、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9.0、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9、1:10.0、1:10.1、1:10.2、1:10.3、1:10.4、1:10.5、1:10.6、1:10.7、1:10.8、1:10.9、1:11.0、1:11.1、1:11.2、1:11.3、1:11.4、1:11.5、1:11.6、1:11.7、1:11.8、1:11.9、1:12.0、1:12.1、1:12.2、1:12.3、1:12.4、1:12.5、1:12.6、1:12.7、1:12.8、1:12.9、1:13.0、1:13.1、1:13.2、1:13.3、1:13.4、1:13.5、1:13.6、1:13.7、1:13.8、1:13.9、1:14.0、1:14.1、1:14.2、1:14.3、1:14.4、1:14.5、1:14.6、1:14.7、1:14.8、1:14.9、1:15.0、1:15.1、1:15.2、1:15.3、1:15.4、1:15.5、1:15.6、1:15.7、1:15.8、1:15.9、1:16.0、1:16.1、1:16.2、1:16.3、1:16.4、1:16.5、1:16.6、1:16.7、1:16.8、1:16.9、1:17.0、1:17.1、1:17.2、1:17.3、1:17.4、1:17.5、1:17.6、1:17.7、1:17.8、1:17.9、1:18.0、1:18.1、1:18.2、1:18.3、1:18.4、1:18.5、1:18.6、1:18.7、1:18.8、1:18.9、1:19.0、1:19.1、1:19.2、1:19.3、1:19.4、1:19.5、1:19.6、1:19.7、1:19.8、1:19.9、1:20.0、1:20.1、1:20.2、1:20.3、1:20.4、1:20.5、1:20.6、1:20.7、1:20.8、1:20.9、1:21.0、1:21.1、1:21.2、1:21.3、1:21.4、1:21.5、1:21.6、1:21.7、1:21.8、1:21.9、1:22.0、1:22.1、1:22.2、1:22.3、1:22.4、1:22.5、1:22.6、1:22.7、1:22.8、1:22.9、1:23.0、1:23.1、1:23.2、1:23.3、1:23.4、1:23.5、1:23.6、1:23.7、1:23.8、1:23.9、1:23.9、1:24.0、1:24.1、1:24.2、1:24.3、1:24.4、1:24.5、1:24.6、1:24.7、1:24.8、1:24.9、1:25.0、1:25.1、1:25.2、1:25.3、1:25.4、1:25.5、1:25.6、1:25.7、1:25.8、1:25.9、1:26.0、1:26.1、1:26.2、1:26.3、1:26.4、1:26.5、1:26.6、1:26.7、1:26.8、1:26.9、1:27.0、1:27.1、1:27.2、1:27.3、1:27.4、1:27.5、1:27.6、1:27.7、1:27.8、1:27.9、1:28.0、1:28.1、1:28.2、1:28.3、1:28.4、1:28.5、1:28.6、1:28.7、1:28.8、1:28.9、1:29.0、1:29.1、1:29.2、1:29.3、1:29.4、1:29.5、1:29.6、1:29.7、1:29.8、1:29.9或1:30.0。

GCase与IFG的摩尔比可以为1:2.5到1:3.5、1:2.6到1:3.4、1:2.7到1:3.5、1:2.7到1:3.4、1:2.5到1:3.3、1:2.8到1:3.5、1:2.8到1:3.3、1:2.7到1:3.2、1:2.6到1:3.1、1:2.5到1:3.0、1:2.9到1:3.3、1:2.8到1:3.2、1:2.7到1:3.1、1:2.6到1:3.0、1:2.5到1:2.9、1:3.0到1:3.4或1:3.1到1:3.5。

GCase与IFG的摩尔比可以为1:7到1:33、1:8到1:32、1:9到1:33、1:7到1:31、1:9到1:31、1:8到1:30、1:7到1:29、1:10到1:32、1:11到1:33、1:7到1:29、1:10到1:30、1:9到1:29、1:8到1:28、1:7到1:27、1:11到1:31、1:12到1:32、1:13到1:33、1:11到1:29、1:10到1:28、1:9到1:27、1:8到1:26、1:7到1:25、1:12到1:30、1:13到1:31、1:14到1:32、1:15到1:33、1:13到1:29、1:12到1:28、1:11到1:27、1:10到1:26、1:9到1:25、1:8到1:24、1:7到1:23、1:14到1:30、1:15到1:31、1:16到1:32、1:17到1:33、1:14到1:28、1:13到1:27、1:12到1:26、1:11到1:25、1:10到1:24、1:9到1:23、1:8到1:22、1:7到1:21、1:15到1:29、1:16到1:30、1:17到1:31、1:18到1:32、1:19到1:33、1:15到1:27、1:14到1:26、1:13到1:25、1:12到1:24、1:11到1:23、1:10到1:22、1:9到1:21、1:8到1:20、1:7到1:19、1:16到1:28、1:17到1:29、1:18到1:30、1:19到1:31、1:20到1:32或1:21到1:33。

GCase与IFG的摩尔比可以为1:16到1:26、1:15到1:25、1:14到1:24、1:13到1:23、1:12到1:22、1:11到1:31、1:10到1:30、1:9到1:29、1:8到1:28、1:7到1:27、1:17到1:27、1:18到1:28、1:19到1:29、1:20到1:30、1:21到1:31、1:22到1:32、1:23到1:33、1:17到1:25、1:14到1:24、1:13到1:23、1:12到1:22、1:11到1:21、1:10到1:20、1:9到1:19、1:18到1:26、1:19到1:27、1:20到1:28、1:21到1:29、1:22到1:30、1:23到1:31、1:18到1:24、1:17到1:23、1:16到1:22、1:15到1:21、1:14到1:20、1:13到1:19、1:12到1:18、1:11到1:17、1:19到1:25、1:20到1:26、1:21到1:27、1:22到1:28、1:23到1:29、1:24到1:30、1:19到1:23、1:17到1:21、1:15到1:19、1:13到1:17、1:11到1:15、1:9到1:13、1:7到1:11、1:21到1:25、1:23到1:27、1:25到1:29、1:27到1:31、1:29到1:33、1:20到1:23、1:18到1:21、1:16到1:19、1:14到1:17、1:12到1:15、1:10到1:13、1:8到1:11、1:22到1:25、1:24到1:27、1:26到1:29、1:28到1:31或1:30到1:33。

GCase与IFG的摩尔比可以为1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:35、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99或1:100。

GCase与IFG的摩尔比可以为1:30到1:100、1:30到1:80、1:40到1:90、1:50到1:100、1:30到1:60、1:40到1:70、1:50到1:80、1:60到1:90、1:70到1:100、1:30到1:50、1:40到1:60、1:50到1:70、1:60到1:80、1:70到1:90、1:80到1:100、1:30到1:40、1:40到1:50、1:50到1:60、1:60到1:70、1:70到1:80、1:80到1:90或1:90到1:100。

在本文所述的其它各个实施例中，组合物包括摩尔比为1:2.5–1:3.5的葡糖脑苷脂酶(GCase)和IFG富马酸盐。

在本文所述的其它各个实施例中，组合物包括摩尔比为1:2.5–1:3.5的葡糖脑苷脂酶(GCase)和IFG奎尼酸盐。

在本文所述的其它各个实施例中，组合物包括摩尔比为1:2.5–1:3.5的葡糖脑苷脂酶(GCase)和IFG草酸盐。

在本文所述的其它各个实施例中，组合物包括摩尔比为1:2.5–1:3.5的葡糖脑苷脂酶(GCase)和IFG琥珀酸盐。

在本文所述的其它各个实施例中，组合物包括摩尔比为1:2.5–1:3.5的葡糖脑苷脂酶(GCase)和IFG环己基氨基磺酸盐。

在另一方面中，提供了一种制备本文所述的任何IFG或IFG/GCase组合物的方法。一方面，所述方法包括：将本文所述的IFG或其盐溶解在溶剂，例如水中；将pH调节到约6.0；以及添加葡糖脑苷脂酶(GCase)以产生所述组合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括在添加GCase之前将IFG冻干。在一些实施例中，所述方法进一步包括添加聚山梨醇酯20到0.01％。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过0.22μm膜过滤组合物。在一些实施例中，IFG以足以维持组合物中的GCase的稳定性的量存在。在一些实施例中，IFG以足以在0-50℃下维持组合物中的GCase的稳定性持续至少三天的量存在。在一些实施例中，IFG以足以在0-40℃下维持组合物中的GCase的稳定性持续至少6个月的量存在。

在一些实施例中，组合物包括45-120mg/mL的维拉西酶α和0.2到1.8mg/mL结晶IFGD-酒石酸盐。在一些实施例中，组合物包括60mg/mL的维拉西酶α和0.9mg/mL结晶IFG D-酒石酸盐。

在一些实施例中，组合物包括60-180mg/mL维拉西酶α和如上所述的摩尔比、例如约1:2.5到约1:3.5或约1:3.3的IFG。在某些实施例中，组合物进一步包括约5mM到约15mM或约10mM的缓冲液(例如，柠檬酸钠或柠檬酸或其组合)；量为约200mM到约300mM或约250mM的碳水化合物(例如，蔗糖)以及量在约0.05％到约0.5％或约0.1％的范围内的表面活性剂(例如，PS20、PS80或泊洛沙姆188)。在某些实施例中，IFG呈游离碱形式。在替代性实施例中，IFG呈盐形式，其中所述盐由有机酸制备，例如奎尼酸、马来酸、富马酸、草酸、丙二酸、D-酒石酸、L-酒石酸、琥珀酸、环己基氨基磺酸或抗坏血酸。在另一个实施例中，IFG盐呈结晶形式。

前述实施例中的任一实施例，其中用于稳定溶液中的GCase的异法戈明化合物是异法戈明酒石酸盐。前述实施例中的任一实施例，其中用于稳定溶液中的GCase的异法戈明化合物是异法戈明富马酸盐。在某些实施例中，所述GCase是维拉西酶α。

在本文所述的组合物的另外的实施例中，GCase在≤-65℃下储存时稳定达18个月、20个月、24个月、26个月、28个月、30个月、32个月、34个月、36个月、38个月、40个月、42个月、44个月、46个月或48个月。在某些实施例中，GCase在≤-65℃的长期储存条件下储存时稳定达18个月。在某些实施例中，GCase在≤-65℃的长期储存条件下储存时稳定达30个月。在某些实施例中，GCase在-20±5℃下储存时稳定达8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月。在某些实施例中，GCase在5±3°下储存时稳定达1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月。

药物载体

本公开的药物组合物可以包含一或多种药学上可接受的载体。如本文所使用的，语言“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、赋形剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸附延迟剂等。药物调配物是既定技术并且进一步描述于以下文献中：例如Gennaro(编辑),《雷明顿：药学科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)》,第20版,利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins)(2000)(ISBN：0683306472)；Ansel等人,《药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》,第7版,利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(1999)(ISBN：0683305727)；以及Kibbe(编辑),《药用赋形剂手册美国药学协会(Handbook of Pharmaceutical Excipients AmericanPharmaceutical Association)》,第3版(2000)(ISBN：091733096X)。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则此类介质可以用于本公开的组合物中。还可以将补充的活性化合物掺入到组合物中。

无菌可注射溶液可以通过将IFG以及任选地如GCase等另一种活性成分根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将活性化合物掺入到无菌媒剂中来制备，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分。在用于无菌可注射溶液的组合物的无菌粉末的情况下，优选的组合物方法是真空干燥和冷冻干燥，例如冻干，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。

化合物(例如，本文所述的IFG和IFG/GCase组合物)可以与将保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，所述载体如控释调配物，包含植入物和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域的技术人员而言是显而易见的。这些材料还可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和新星制药有限公司(NovaPharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包含靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域的技术人员已知的例如美国专利第4,522,811号中描述的方法来制备。

对于IV施用，合适的载体包含生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR EL^TM(新泽西州帕西波尼市的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应具有达到易于注射的程度的流动性。组合物在制造和储存条件下应该是稳定的并且可以抗如细菌和真菌等微生物的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣，通过在分散液的情况下维持所需的粒度并且通过使用包含非离子聚(环氧乙烷)(PEO)—聚(环氧丙烷)(PPO)共聚物(例如，泊洛沙姆68、88、98、108、124、188、237、338和407)以及通过在添加月桂酸之前乙氧基化脱水山梨糖醇形成的聚山梨醇酯型非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20，也称为聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、如甘露醇、山梨醇等多元醇、氯化钠。可以通过包含延迟吸附的药剂，例如单硬脂酸铝、人血清白蛋白和明胶来实现可注射组合物的延长的稳定性。

抗氧化剂和其它稳定剂

本文所述的IFG和GCase/IFG组合物可以进一步包括抗氧化剂。一种合适的抗氧化剂是半胱氨酸。半胱氨酸可以以0.030％到0.100％、0.050％到0.080％、0.040％到0.070％、0.030％到0.060％、0.060％到0.090％、0.070％到0.100％、0.065％到0.080％、0.060％到0.075％、0.055％到0.070％、0.050％到0.065％、0.070％到0.085％、0.075％到0.090％、约0.065％、约0.070％、约0.075％、约0.080％、0.065％、0.070％、0.075％或0.080％存在。不希望受理论束缚，半胱氨酸可以进一步使GCase稳定。

本文所述的IFG和GCase/IFG组合物可以进一步包括碳水化合物，如蔗糖或海藻糖。碳水化合物，例如蔗糖或海藻糖，可以以12％到19％、13％到18％、14％到17％、12％到15％、13％到16％、15％到17％、约16％或16％存在。不希望受理论束缚，蔗糖或海藻糖可以通过降低硫醇(-SH)基团的可用性来进一步使GCase稳定。

本文中的IFG和GCase/IFG组合物可以进一步包括洗涤剂。所述洗涤剂可以是聚山梨醇酯20或任何数量的基于泊洛沙姆的化合物。

在某些实施例中，在预选条件下，GCase的稳定性比缺乏碳水化合物(蔗糖或海藻糖)、抗氧化剂或碳水化合物和抗氧化剂两者而不同的组合物中的GCase的稳定性高至少5-80％(例如，高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％)。

IFG和GCase/IFG组合物可以在储存在容器中之前清除氧气。另外，容器理想地是气密的，以便防止氧气侵入。本文所述的组合物(例如,含有GCase的液体组合物)中的GCase可以具有延长的稳定性。例如，在预选条件下，例如，在气密容器中在2-8℃的温度下储存持续至多3个月、6个月、9个月、12个月或24个月(或在一些实施例中更长时间)的时间段时，组合物中的GCase将保留其在储存之前所具有的稳定性的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。

可以通过提供含有0.075％半胱氨酸、16％蔗糖的组合物，将pH调节到5.7，将GCase调节到候选浓度并且清除O₂组合物来测试合适的蛋白质浓度。将在预定时间测量的候选浓度的GCase/IFG，例如GCase/IFG组合物中的GCase的稳定性(例如，聚集百分比或降解百分比)与一或多个标准品进行比较。对GCase在每个浓度下的稳定性进行比较。适用性可以通过对稳定性具有与本文所述的浓度相当或更好的效果的候选浓度来显示。

GCase稳定性可以通过贯穿本申请描述的任何方法来测量，例如通过测量蛋白质聚集或蛋白质降解。蛋白质聚集可以例如通过尺寸排阻色谱法、非变性PAGE或用于确定尺寸的其它方法等来确定。蛋白质降解可以通过例如反相HPLC、非变性PAGE、离子交换色谱法、SEC、SEC HPLC、肽作图或类似方法来确定。

pH可以对本文所述的各种GCase/IFG组合物中的GCase的稳定性产生影响。pH可以影响GCase的构象和/或聚集和/或降解和/或反应性。可以用于调节蛋白质组合物的pH的缓冲液包含组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、琥珀酸盐、乙酸盐、谷氨酸盐、Tris、酒石酸盐、天冬氨酸盐、马来酸盐和乳酸盐的盐溶液。在某些实施例中，IFG/GCase调配物包括柠檬酸钠缓冲液。

表面活性剂

本文所述的IFG和GCase/IFG组合物可以进一步包括一或多种表面活性剂。不希望受理论束缚，表面活性剂可以增加蛋白质稳定性，如通过提供可以在摇动时或在运输期间减少蛋白质降解的空气/液体界面。可以选择在特定液体组合物中增加蛋白质稳定性的表面活性剂，例如通过不引起蛋白质降解。合适的表面活性剂包含非离子聚(环氧乙烷)(PEO)—聚(环氧丙烷)(PPO)共聚物(例如，泊洛沙姆68、88、98、108、124、188、237、338和407)以及通过在添加如月桂酸或油酸等不饱和脂肪酸之前乙氧基化脱水山梨糖醇形成的聚山梨醇酯型非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20，也称为聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯，以及聚山梨醇酯80，也称为聚氧乙烯(80)脱水山梨糖醇单油酸酯)。示例性表面活性剂是泊洛沙姆188、PS20、PS80和/或普朗尼克F68。表面活性剂可以以介于约0.005％与约5％之间，例如介于约0.01％与约1％之间，例如约0.025％与约0.5％之间，例如约0.03％与约0.25％之间，例如约0.04％到约0.1％之间，例如约0.05％到约0.075％之间，例如0.05％的量存在。理想的表面活性剂或其组合是未被GCase修饰或切割的表面活性剂。

例如，可以通过提供含有2mg/ml GCase、一定量的IFG、0.075％半胱氨酸、16％蔗糖的组合物，然后将pH调节到5.7，然后添加候选表面活性剂并且清除O₂组合物来测试候选表面活性剂。测量含有候选表面活性剂的在预定时间与一或多个标准品进行比较的GCase/IFG组合物的稳定性，例如以聚合百分比或降解百分比表示。例如，合适的标准品将是类似于测试条件的组合物，不同之处在于不向组合物中添加表面活性剂。可以在模拟“真实世界”场景，例如储存和运输的条件下对经处理的(含有表面活性剂)和未经处理的(不含表面活性剂)组合物的稳定性进行比较。标准品可以是类似于测试组合物的组合物，不同之处在于使用另一种表面活性剂代替泊洛沙姆188。然后泊洛沙姆188将是用于比较基础的标准。适用性可以通过对稳定性具有与本文所述的表面活性剂相当或更好的效果的候选表面活性剂来显示。如果确定候选表面活性剂是合适的(例如，与标准品之一相比，候选表面活性剂增加了组合物的稳定性)，则候选表面活性剂的浓度可以被精制。例如，可以在一定值范围内增加或降低浓度，并且与标准品和所测试的其它浓度进行比较，以确定哪个浓度引起稳定性的最大增加。

可替代地，在本文所述的组合物中使用两种或更多种表面活性剂的组合。如上所述，可以通过将GCase/IFG组合物与表面活性剂的测试组合的稳定性和GCase/IFG组合物与泊洛沙姆188的稳定性进行比较来测试所述组合的适用性。

包装和递送

本文所述的IFG和IFG/GCase组合物可以与各种医疗装置一起施用。例如，本文所述的组合物可以通过无针皮下注射装置来施用，如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中公开的装置。可用于本公开的众所周知的植入物和模块的实例包含：美国专利第4,487,603号，所述美国专利公开了用于以受控速率分配药物的植入式微型输注泵；美国专利第4,486,194号，所述美国专利公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，所述美国专利公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，所述美国专利公开了用于连续药物递送的可变流量植入式输注设备；美国专利第4,439,196号，所述美国专利公开了具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利第4,475,196号，所述美国专利公开了渗透药物递送系统。当然，许多其它此类植入物、递送系统和模块也是已知的。

本文所述的IFG和GCase/IFG组合物可以包装在双腔室注射器中。例如，冻干形式的IFG和GCase/IFG组合物可以置于第一注射器腔室中，并且液体可以存在于第二注射器腔室中(参见例如美国公开申请号2004-0249339)。

本文所述的IFG和GCase/IFG组合物可以包装在无针注射器中(参见例如美国专利第6,406,455号和第6,939,324号)。简而言之，举例来说，注射装置包含：气体腔室，所述气体腔室含有气体或气体源；端口，所述端口可以允许从所述气体腔室释放气体；柱塞，所述柱塞在从所述气体腔室释放所述气体时可以引起至少第一活塞的移动；第一活塞；第二活塞；第一腔室，例如可用于药物储存和混合的腔室；活塞壳体，所述第一活塞、所述第二活塞和所述第一腔室安置在所述活塞壳体中；移位构件，所述移位构件可以独立于来自所述气体腔室的气体的动力而引起所述第一活塞和所述第二活塞中的一个或两个的移动(所述移位构件可以是所述柱塞或单独的构件)；与所述第一腔室连通的适于无针注射的孔口；其中所述第一活塞和所述第二活塞可滑动地安置在所述活塞壳体内，并且所述移位构件、所述气体源和所述柱塞被安置成使得：在所述活塞的第一位置中，由所述第一活塞、所述活塞壳体和所述第二活塞在所述活塞壳体内限定第二腔室，例如流体储存器，所述移位构件可以将所述活塞中的一个或两个移动到第二位置中，其中所述第一活塞处于使得所述第二腔室与所述第一腔室连通的位置，所述第二腔室可以是流体储存器，所述第一腔室可以是药物储存和混合腔室，并且所述第二活塞在所述第一活塞的方向上移动，由此减小所述第二腔室的体积并且允许流体从所述第二腔室转移到所述第一腔室，所述柱塞在从所述气体腔室释放气体时引起所述第一活塞移动以便减小所述第一腔室的体积，从而允许物质通过所述孔口从所述腔室排出并且例如排出到受试者。

无针注射器可以包含用于第一组分，例如干燥或液体组分和第二组分，例如液体组分的单独模块。所述模块可以作为两个单独的组件提供，并且例如由将向他或她自己施用所述组件的受试者或由另一个人，例如由提供或递送医疗保健的个体组装。所述模块可以一起可以形成本文所述的装置的活塞壳体的全部或部分。所述装置可以用于提供任何第一组分和第二组分，其中期望单独地储存或提供所述组分并且在向受试者施用之前将所述组分组合。

治疗方法

在另一方面中，提供了一种治疗与GCase途径功能障碍相关的病症的方法，所述方法包括施用本文所述的组合物中的任何组合物。在另一方面中，提供了包括GCase和IFG的所公开的组合物，所述组合物用于治疗与GCase途径功能障碍相关的病症的方法中，所述方法包括施用本文所述的组合物中的任何组合物。在另一方面中，提供了本文所提供的组合物GCase和IFG在制造用于治疗GCase途径功能障碍的方法的药物中的用途。在一些实施例中，所述方法对于治疗GCase途径中的病症是有效的。在某些实施例中，当与GCase途径功能障碍相关的一或多种症状得到改善或减轻时，所述病症得到治疗。在一些实施例中，所述组合物是静脉内或皮下施用的。在一些实施例中，所述组合物是皮下施用的，例如通过皮下注射。在一些实施例中，所述组合物是每周两次、每周一次、小于每周一次或每隔一周一次施用的。

在一些实施例中，所述病症包括GCase活性缺陷。在一些实施例中，所述GCase活性缺陷包括降低的酶活性。在一些实施例中，所述病症包括α-突触核蛋白失调。在一些实施例中，所述病症是溶酶体贮积病，例如戈谢氏病、法布里氏病(Fabry disease)、庞贝氏病(Pompe disease)、粘多糖贮积症或多系统萎缩症。在一些实施例中，所述病症是神经变性病症，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或路易体痴呆。

在另一方面中，提供了一种治疗GCase途径功能障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述受试者是人。

在一些实施例中，GCase的暴露、活性或生物利用度在向有需要的受试者施用包括本文所述的GCase和IFG的组合物中的任何组合物时增加，例如相对于单独等量的GCase的暴露、活性或生物利用度。在一些实施例中，脾脏中GCase的暴露、活性或生物利用度增加。在一些实施例中，肝脏中GCase的暴露、活性或生物利用度增加。在一些实施例中，血清中GCase的暴露、活性或生物利用度增加。在一些实施例中，所述组合物是通过IV施用的。在一些实施例中，所述组合物是通过皮下施用的。

在另一方面中，提供了一种治疗GCase途径功能障碍的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包括0.5到5.0mg/kg体重GCase的剂量并且包括IFG(包含但不限于本文所述的盐和结晶形式)，例如其中IFG至少约1、1.25、1.5、2、2.5、3、4或5倍摩尔过量于GCase。在一些实施例中，所述组合物是通过皮下施用的。在一些实施例中，组合物中的IFG以在作为单一药剂施用时或更具体地在没有共施用GCase的情况下不会增加内源性血清GCase活性的量施用。

在另一方面中，提供了一种组合物，所述组合物包括0.5到5.0mg/kg体重GCase并且包括IFG(包含但不限于本文所述的盐和结晶形式)，例如其中IFG至少约1、1.25、1.5、2、2.5、3、4或5倍摩尔过量于GCase，所述组合物用于治疗与GCase途径功能障碍相关的病症的方法中。在另一方面中，提供了包括0.5到5.0mg/kg体重GCase的剂量并且包括IFG(包含但不限于本文所述的盐和结晶形式)的组合物在制造用于治疗GCase途径功能障碍的方法的药物中的用途，例如其中IFG至少约1、1.25、1.5、2、2.5、3、4或5倍摩尔过量于GCase。在一些实施例中，所述方法对于治疗与GCase途径功能障碍相关的病症是有效的。在某些实施例中，当与GCase途径功能障碍相关的一或多种症状得到改善或减轻时，所述病症得到治疗。在一些实施例中，所述组合物是静脉内或皮下施用的。在一些实施例中，所述组合物是皮下施用的，例如通过皮下注射。在一些实施例中，所述组合物是每周两次、每周一次、小于每周一次或每隔一周一次施用的。

在一些实施例中，用于所公开方法的组合物包括0.8到4.0mg/kg体重GCase的剂量。在一些实施例中，所述组合物包括1.0到3.0mg/kg GCase的剂量。在一些实施例中，所述组合物包括1.2到2.0mg/kg GCase的剂量。在一些实施例中，所述组合物包括约1.5mg/kgGCase。在一些实施例中，所述组合物包括1.5mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括2.0到5.0mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括2.25到4.5mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括2.25到3.75mg/kg GCase。在一些实施例中，所述组合物包括3.5到5.0mg/kg GCase。

在前述实施例中的任一实施例中，用于稳定溶液中的GCase的异法戈明化合物是异法戈明酒石酸盐。在前述实施例中的任一实施例中，用于稳定溶液中的GCase的异法戈明化合物是异法戈明富马酸盐。在某些实施例中，所述GCase是维拉西酶α。

前述实施例中的任一实施例，其中用于稳定溶液中的GCase的异法戈明化合物是异法戈明酒石酸盐。前述实施例中的任一实施例，其中用于稳定溶液中的GCase的异法戈明化合物是异法戈明富马酸盐。在某些实施例中，所述GCase是维拉西酶α。

在本文所述的组合物的另外的实施例中，GCase在≤-65℃下储存时稳定，持续18个月、20个月、24个月、26个月、28个月、30个月、32个月、34个月、36个月、38个月、40个月、42个月、44个月、46个月或48个月。在某些实施例中，GCase在≤-65℃的长期储存条件下储存时稳定，持续18个月。在某些实施例中，GCase在≤-65℃的长期储存条件下储存时稳定，持续30个月。在某些实施例中，GCase在-20±5℃下储存时稳定，持续8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月。在某些实施例中，GCase在5±3°下储存时稳定，持续1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月。

在用于所公开方法的组合物的一些实施例中，IFG 1到5倍或1到10倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 2到10倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 10到30倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 30到100倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG2.5到3.5倍摩尔比率于GCase。在一些实施例中，IFG 3倍摩尔比率于GCase。

可以向患者施用本文所述的任何IFG和GCase/IFG调配物。GCase剂量可以为约60单位/千克或60单位/千克，每隔一周施用一次。GCase剂量可以为约30单位/千克或30单位/千克，每周施用一次。可替代地，GCase剂量的范围可以为每隔一周施用一次30到80单位/千克、每隔一周施用一次40到70单位/千克、每隔一周施用一次50到80单位/千克、每隔一周施用一次45到65单位/千克、每隔一周施用一次40到60单位/千克、每隔一周施用一次35到55单位/千克、每隔一周施用一次30到50单位/千克、每隔一周施用一次45到65单位/千克、每隔一周施用一次50到70单位/千克、每隔一周施用一次55到75单位/千克、每隔一周施用一次60到80单位/千克、每隔一周施用一次55到65单位/千克、每隔一周施用一次45到55单位/千克、每隔一周施用一次35到45单位/千克或每隔一周施用一次65到75单位/千克。可替代地，GCase剂量的范围可以为每周施用一次15到40单位/千克、每周施用一次20到35单位/千克、每周施用一次25到40单位/千克、每周施用一次22.5到32.5单位/千克、每周施用一次20到30单位/千克、每周施用一次17.5到22.5单位/千克、每周施用一次15到25单位/千克、每周施用一次22.5到32.5单位/千克、每周施用一次25到35单位/千克、每周施用一次22.5到37.5单位/千克、每周施用一次30到40单位/千克、每周施用一次27.5到32.5单位/千克、每周施用一次22.5到27.5单位/千克、每周施用一次17.5到22.5单位/千克或每周施用一次32.5到37.5单位/千克。GCase剂量可以为约1.5mg/kg或1.5mg/kg，每隔一周施用一次。GCase剂量可以为约0.75mg/kg或0.75mg/kg，每周施用一次。可替代地，GCase剂量的范围可以为每隔一周施用一次0.75到2.0mg/kg、每隔一周施用一次1.0到1.75mg/kg、每隔一周施用一次1.25到2.0mg/kg、每隔一周施用一次1.125到1.625mg/kg、每隔一周施用一次1.0到1.5mg/kg、每隔一周施用一次0.875到1.375mg/kg、每隔一周施用一次0.75到1.25mg/kg、每隔一周施用一次1.215到1.625mg/kg、每隔一周施用一次1.25到1.75mg/kg、每隔一周施用一次1.375到1.875mg/kg、每隔一周施用一次1.5到2.0mg/kg、每隔一周施用一次1.375到1.625mg/kg、每隔一周施用一次1.125到1.375mg/kg、每隔一周施用一次0.875到1.125mg/kg或每隔一周施用一次1.625到1.875mg/kg。可替代地，GCase剂量的范围可以为每周施用一次0.375到1.0mg/kg、、每周施用一次0.5到0.875mg/kg、每周施用一次0.625到1.0mg/kg、每周施用一次0.5625到0.8125mg/kg、每周施用一次0.5到0.75mg/kg、每周施用一次0.4375到0.5625mg/kg、每周施用一次0.375到0.625mg/kg、每周施用一次0.5625到0.8125mg/kg、每周施用一次0.625到0.875mg/kg、每周施用一次0.5625到0.9375mg/kg、每周施用一次0.75到1.0mg/kg、每周施用一次0.6875到0.8125mg/kg、每周施用一次0.5625到0.6875mg/kg、每周施用一次0.4375到0.5625mg/kg或每周施用一次0.8125到0.9375mg/kg。

可以向患者施用本文所述的任何IFG和GCase/IFG调配物。GCase剂量可以为约90到180单位/千克，每隔一周施用一次。GCase剂量可以为约90单位/千克或90单位/千克，每周施用一次。可替代地，GCase剂量的范围可以为每隔一周施用一次90到150单位/千克、每隔一周施用一次110到160单位/千克、每隔一周施用一次120到180单位/千克、每隔一周施用一次120到150单位/千克、每隔一周施用一次90到120单位/千克、每隔一周施用一次100到130单位/千克、每隔一周施用一次110到140单位/千克、每隔一周施用一次120到150单位/千克、每隔一周施用一次130到160单位/千克、每隔一周施用一次140到170单位/千克或每隔一周施用一次150到180单位/千克。可替代地，GCase剂量的范围可以为每隔一周施用一次90到110单位/千克、每隔一周施用一次100到120单位/千克、每隔一周施用一次110到130单位/千克、每隔一周施用一次120到140单位/千克、每隔一周施用一次130到150单位/千克、每隔一周施用一次140到160单位/千克、每隔一周施用一次150到170单位/千克或每隔一周施用一次160到180单位/千克。GCase剂量可以为约2.25到4.5mg/kg，每隔一周施用一次。可替代地，GCase剂量的范围可以为每隔一周施用一次2.25到3.75mg/kg、每隔一周施用一次2.75到4.0mg/kg、每隔一周施用一次3.0到4.5mg/kg、每隔一周施用一次3.0到3.75mg/kg、每隔一周施用一次2.25到3.0mg/kg、每隔一周施用一次2.5到3.25mg/kg、每隔一周施用一次2.75到3.5mg/kg、每隔一周施用一次3.0到3.75mg/kg、每隔一周施用一次3.25到4.0mg/kg、每隔一周施用一次3.5到4.25mg/kg或每隔一周施用一次3.75到4.5mg/kg。可替代地，GCase剂量的范围可以为每隔一周施用一次2.25到2.75mg/kg、每隔一周施用一次2.5到3.0mg/kg、每隔一周施用一次2.75到3.25mg/kg、每隔一周施用一次3.0到3.5mg/kg、每隔一周施用一次3.25到3.75mg/kg、每隔一周施用一次3.5到4.0mg/kg、每隔一周施用一次3.75到4.25mg/kg或每隔一周施用一次4.0到4.5mg/kg。

可以施用IFG和GCase/IFG组合物来治疗与GCase途径功能障碍相关的病症，如溶酶体贮积病。示例性溶酶体贮积病包含戈谢氏病、法布里氏病、庞贝氏病、粘多糖贮积症和多系统萎缩症。所述病症可以是神经变性病症，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或路易体痴呆。可替代地，所述病症可能涉及α-突触核蛋白失调。

在治疗病症时，IFG和GCase/IFG组合物可以静脉内或皮下施用。皮下施用包含皮下注射。可以使用各种给药方案来施用组合物。例如，可以每周施用一次、每两周施用一次、每月施用一次组合物可以例如每三天施用一次、每四天施用一次、每五天施用一次、每六天施用一次、每八天施用一次、每九天施用一次、每10天施用一次、每11天施用一次、每12天施用一次、每13天施用一次、每15天施用一次或每16天施用一次组合物。由于各种因素，施用频率可以在整个治疗进程中发生变化。

实例

还通过以下实例描述和说明本发明。然而，在说明书中的任何地方使用这些和其它实例仅是说明性的，并且绝不限制本发明或任何例示术语的范围和含义。同样地，本发明不限于本文所述的任何实施例。实际上，在阅读本说明书后，对本发明的许多修改和变化对于本领域的技术人员而言可以是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神或范围的情况下可以作出这些变化。因此，本发明仅受所附权利要求书的条款以及所述权利要求授权获得的等效物的整个范围的限制。

本公开中的X-射线粉末衍射图是通过Stoe Stadi P X-射线粉末衍射仪获得的。本公开的X-射线粉末衍射方法的参数如下。

使用此仪器的测量在40kV的管电压和40mA的管功率下以透射进行。弯曲的Ge单色仪允许使用Cu-Kα1辐射进行测试。设置了以下参数：0.02°2Θ步长尺寸、12秒步长时间、1.5-50.5°2Θ扫描范围和1°2Θ检测器步长(步长扫描中的检测器模式)。对于典型的样品制备，将约10mg的样品放置在两个乙酸箔之间并且安装到Stoe透射样品支架中。在测量期间使样品旋转。所有样品制备和测量都是在环境空气氛中进行的。

实例A：异法戈明游离碱的纯化：

根据已知方法获得异法戈明游离碱，例如根据如由Danishefsky等人在《四面体通讯(Tetrahedron Letters)》1990；31(16),2229中报告的或如在EP1860101B1中所述的由D(-)-阿拉伯糖合成或根据由L-(-)-木糖合成，参见Meloncelli,P.J.和Stick,R.V.《澳大利亚化学杂志(Aust.J.Chem)》,2006,第59卷,第827-833页。所获得的IFG游离碱使用硅胶填充柱进行纯化，并且用由二氯甲烷、甲醇和氢氧化铵组成的溶剂梯度进行洗脱，从而逐渐增大洗脱剂的极性，直到IFG游离碱被洗脱。通过TLC分析级分并且然后将级分适当合并，真空去除挥发物，以提供具有小于2％杂质的经纯化的IFG游离碱，如通过HPLC确定的。

实例1：异法戈明奎尼酸盐

溶液1制备如下：在室温下，在约4体积的甲醇中制备奎尼酸溶液。

溶液2制备如下：在室温下，制备经纯化的IFG(根据实例A获得的)于甲醇中的溶液。相对于在溶液1的制备中所使用的奎尼酸，使用等摩尔量的IFG。

然后将溶液2缓慢地添加到溶液1中，由此形成结晶物质。在室温下搅拌之后，过滤浆液，并且将所得固体物质用甲醇洗涤、脱液并且然后在真空中干燥。获得IFG SP245-QNC-P2的奎尼酸盐的结晶样品。

所获得的异法戈明奎尼酸盐的X-射线粉末衍射

从以上实例1中描述的方案获得的SP245-QNC-P2的XRPD图谱示出于图1中，并且在下表1中列出(vs＝非常强，s＝强，m＝中等，w＝弱，vw＝非常弱的强度)。特性峰选自非常强、强和中等衍射峰。

表1：异法戈明奎尼酸盐的XRPD峰。

异法戈明奎尼酸盐的拉曼光谱法

记录SP245-QNC-P2的拉曼光谱并且呈现在图2中。200到3500cm^-1的FT-拉曼光谱(图2A)和200到2000cm^-1的FT-拉曼光谱的指纹区(图2B)的概述。

异法戈明奎尼酸盐的¹H-NMR光谱法

SP245-QNC-P2的¹H-NMR光谱记录在DMSO-d₆中并且呈现在图3中。光谱与1:1的盐形成一致。

异法戈明奎尼酸盐的TG-FTIR

进行TG-FTIR测量，并且揭示在25℃与200℃之间质量损失小于1％。所获得的结晶形式SP245-QNC-P2是无水/非溶剂化的。TG-FTIR热谱图呈现在图4中，并且示出了与水和痕量甲醇相对应的0.9％的质量损失。在200℃以上可观察到分解。

异法戈明奎尼酸盐的差示扫描量热法

差示扫描量热法揭示在204.4℃下的熔融峰值(参见图5)。然而，分解在熔化过程结束之前就已经开始，并且无法确定熔化焓。

异法戈明奎尼酸盐的动态蒸气吸附

使用DVS测量法，在存在可变水蒸气压力的情况下研究了IFG奎尼酸盐(样品SP245-QNC-P2)的行为。DVS测试的结果作为样品SP245-QNC-P2的DVS等温线呈现在图6和图6B中：相对样品重量(红色曲线)和相对湿度(蓝色曲线)随时间的变化。

当相对湿度从50％降低到0％时，未观察到显著的重量损失。此外，当RH从0％增加到80％时，未观察到重量增益，然后直到95％RH时观察到20％质量增益并且在95％下储存时观察到另外的70％重量增益。在实例1制备的SP245-QNC-P2盐在高相对湿度，即，约80％RH以上下是吸湿性的。将DVS测量后回收的样品进行XRPD，并且未观察到形态变化，但注意到了结晶度增益。

通过元素组成分析进行的异法戈明奎尼酸盐的同一性

IFG奎尼酸盐SP245-QNC-P2的化学同一性通过使用CHNO含量测定以及针对水和溶剂含量的TG-FTIR的元素组成分析来验证。所获得的结果总结在表2中，表2提供了样品SP245-QNC-P2的CHNO含量分析与(1:1)溶剂和分子量为339.34g/mol且式为C13H25NO9的无水盐的理论组成进行比较的结果。CHNO分析的结果与溶剂和无水奎尼酸盐的理论含量非常良好地的匹配。

表2：异法戈明奎尼酸盐的元素分析

实例2：异法戈明富马酸盐

溶液1制备如下：在室温下，在约4体积的甲醇中制备富马酸溶液。

溶液2制备如下：在室温下，制备经纯化的IFG(根据实例A获得的)于约4体积甲醇中的溶液。相对于在溶液1的制备中所使用的富马酸，使用等摩尔量的IFG。

然后将溶液2缓慢地添加到溶液1中，由此形成结晶物质。在室温下搅拌之后，过滤浆液，并且将所得固体物质用甲醇溶剂洗涤、脱液并且然后在真空中干燥。获得IFG SP245-FUM-P4的富马酸盐的结晶样品。

异法戈明富马酸盐的X-射线粉末衍射

从以上实例2中描述的方案获得的SP245-FUM-P4的XRPD图谱示出于图7中，并且在下表3中列出(vs＝非常强，s＝强，m＝中等，w＝弱，vw＝非常弱的强度)。特性峰选自非常强、强和中等衍射峰。

表3：异法戈明富马酸盐的XRPD峰

异法戈明富马酸盐的拉曼光谱法

记录SP245-FUM-P4的拉曼光谱并且呈现在图8中。200到3500cm^-1的FT-拉曼光谱(图8A)和200到2000cm-1的FT-拉曼光谱的指纹区(图8B)的概述。

异法戈明富马酸盐的¹H-NMR光谱法

SP245-FUM-P4的¹H-NMR光谱记录在D₂O中并且呈现在图9中。光谱与1:1的盐形成一致。

异法戈明富马酸盐的TG-FTIR

SP245-FUM-P4的TG-FTIR热谱图呈现在图10中，并且在25℃与150℃之间没有显示出显著的质量损失。富马酸盐呈无溶剂且无水形式。在150℃以上可观察到分解。

异法戈明富马酸盐的差示扫描量热法

SP245-FUM-P4的差示扫描量热法揭示了熔融峰温度为168.6℃，起始温度为165.6℃以及熔化焓为157J/g(参见图11)。

异法戈明富马酸盐的动态蒸气吸附

使用DVS研究了相对湿度变化对IFG富马酸盐样品SP245-FUM-P4的影响。图12示出了样品SP245-FUM-P4的DVS等温线：相对样品重量(红色曲线)和相对湿度(蓝色曲线)随时间的变化(图12A)以及相对样品重量随相对湿度的变化(图12B)。

当相对湿度从50％降低到0％RH时，未观察到显著的重量损失(<1重量％)，并且然后当RH从0％增加到80％RH时，未观察到样品质量的显著增益。当扫描至95％RH时观察到11％的重量增益，并且在95％下储存五小时后出现另外的47％的重量增益。在第二个循环期间，与第一个循环相比，在95％RH下观察到重量增益从5％开始。IFG富马酸盐在约80％以上的相对湿度下是吸湿性的。

通过XRPD分析DVS测量后回收的结晶物质，并且所述结晶物质与用作DVS测试的起始材料的样品SP245-FUM-P4相对应。

通过元素组成分析进行的异法戈明富马酸盐的同一性

IFG富马酸盐SP245-FUM-P4的化学同一性通过使用CHNO含量测定以及针对水和溶剂含量的TG-FTIR的元素组成分析来验证。所获得的结果总结在表4中—样品SP245-FUM-P4的CHNO含量分析与(1:1)溶剂和分子量为263.35g/mol且式为C10H17NO7的无水盐的理论组成进行比较。CHNO分析的结果显示与溶剂和无水富马酸盐的理论含量优异的匹配。

表4：异法戈明富马酸盐的元素分析

实例3：异法戈明草酸盐

溶液1制备如下：在室温下，在约2.5体积的甲醇中制备草酸溶液。

溶液2制备如下：在室温下，在约2.6体积的甲醇中制备经纯化的IFG(根据实例A获得的)于甲醇中的溶液。相对于在溶液1的制备中所使用的草酸，使用等摩尔量的IFG。

然后将溶液2缓慢地添加到溶液1中，由此形成结晶物质。在室温下搅拌之后，过滤浆液，并且将所得固体物质用甲醇洗涤、脱液并且然后在真空中干燥。获得IFG草酸盐SP245-OXA-P1的结晶样品。

异法戈明草酸盐的X-射线粉末衍射

从以上实例1中描述的方案获得的SP245-OXA-P1的XRPD图谱示出于图13中，并且在下表5中列出(vs＝非常强，s＝强，m＝中等，w＝弱，vw＝非常弱的强度)。特性峰选自非常强、强和中等衍射峰。

表5：异法戈明草酸盐的XRPD峰

异法戈明草酸盐的拉曼光谱法

记录SP245-OXA-P1的拉曼光谱并且呈现在图14中。200到3500cm^-1的FT-拉曼光谱(图14A)和200到2000cm^-1的FT-拉曼光谱的指纹区(图14B)的概述。

异法戈明草酸盐的¹H-NMR光谱法

SP245-OXA-P1的¹H-NMR光谱记录在D₂O中并且呈现在图15中。光谱与1:1的盐形成一致。

异法戈明草酸盐的TG-FTIR

SP245-OXA-P1的TG-FTIR热谱图呈现在图16中，并且在25℃与150℃之间没有显示出显著的质量损失。富马酸盐呈无溶剂且无水形式。

异法戈明草酸盐的差示扫描量热法

SP245-OXA-P1的差示扫描量热法揭示了熔融峰温度为143.9℃，起始温度为140.6℃，以及相关熔化焓为158.7J/g(图17)。

异法戈明草酸盐的动态蒸气吸附

使用DVS研究了相对湿度变化对IFG草酸盐样品SP245-OXA-P1的影响。图18示出了DVS等温线：相对样品重量(红色曲线)和相对湿度(蓝色曲线)随时间的变化(图18A)以及相对样品重量随相对湿度的变化(图18B)。

当相对湿度从50％降低到0％时，未观察到显著的重量损失。此外，当RH从0％增加到75％时，未观察到重量增益，然后直到95％RH时观察到30％质量增益并且在95％下储存时观察到另外的90％重量增益。草酸盐在80％RH以上是吸湿性的。将DVS测量后回收的样品进行XRPD，并且所获得的XRPD图谱与起始材料相对应。

通过元素组成分析进行的异法戈明草酸盐的同一性

IFG富马酸盐SP245-OXA-P1的化学同一性通过使用CHNO含量测定以及针对水和溶剂含量的TG-FTIR的元素组成分析来验证。所获得的结果总结在表6中—样品SP245-OXA-P1的CHNO含量分析与(1:1)溶剂和分子量为237.21g/mol且式为C8H15NO7的无水盐的理论组成进行比较。CHNO分析的结果显示与溶剂和无水富马酸盐的理论含量优异的匹配。

表6：异法戈明草酸盐的元素分析

实例4：结晶异法戈明酒石酸盐

按照以下方案制备D-酒石酸和L-酒石酸。

溶液1制备如下：在室温下，在约2体积的甲醇中制备酒石酸溶液。

溶液2制备如下：在室温下，制备经纯化的IFG(根据实例A获得的)于约2体积甲醇中的溶液。相对于在溶液1的制备中所使用的酒石酸，使用等摩尔量的IFG。

然后将溶液2缓慢地添加到溶液1中，由此形成结晶物质。在室温下搅拌之后，过滤浆液，并且将所得固体物质用甲醇洗涤、脱液并且然后在真空中干燥。

结晶IFG-D-(-)-酒石酸盐样品SP245-DTA-P3是根据以上方案使用溶液1中的D-酒石酸获得的。结晶IFG L-(+)-酒石酸盐样品SP245-LTA-P5也是根据以上方案使用溶液1中的L-酒石酸获得的。

D-酒石酸盐已经在范围为毫克到多达600+克规模的多种规模上进行制备，其中典型的产率为约40-60％。

异法戈明D-(-)-酒石酸盐的X-射线粉末衍射

从以上实例4中描述的方案获得的SP245-DTA-P3的XRPD图谱示出于图19中，并且在下表7中列出(vs＝非常强，s＝强，m＝中等，w＝弱，vw＝非常弱的强度)。特性峰选自非常强、强和中等衍射峰。

表7：异法戈明D-(-)-酒石酸盐的XRPD峰。

异法戈明D-(-)-酒石酸盐的拉曼光谱法

记录SP245-DTA-P3的200到3500cm^-1的拉曼光谱并且呈现在图21中。

异法戈明D-(-)-酒石酸盐的¹H-NMR光谱法

SP245-DTA-P3的¹H-NMR光谱记录在D₂O中并且呈现在图22中。光谱与1:1的盐形成一致。

异法戈明D-(-)-酒石酸盐的TG-FTIR

SP245-DTA-P3的TG-FTIR热谱图呈现在图23中，并且在25℃与150℃之间没有显示出显著的质量损失。酒石酸盐呈无溶剂且无水形式。

异法戈明D-(-)-酒石酸盐的差示扫描量热法

SP245-DTA-P3的差示扫描量热法揭示了熔融峰温度为146.6℃，起始温度为约132℃，以及相关熔化焓为158.7J/g(图24)。

异法戈明D-(-)-酒石酸盐的动态蒸气吸附

使用DVS研究了相对湿度变化对结晶IFG酒石酸盐样品SP245-DTA-P3的影响。图25示出了DVS等温线：相对样品重量(红色曲线)和相对湿度(蓝色曲线)随时间的变化。在相对湿度(RH)从0％增加到70％时没有观察到质量变化，表明这种盐在高达70％的RH下不吸湿。然而，在将RH从70％改变到95％时，导致32％的质量增益，并且将材料保持在95％RH下，导致70％的另外质量增加。

通过元素组成分析进行的异法戈明D-酒石酸盐的同一性

IFG D-酒石酸盐SP245-DTA-P3的化学同一性通过使用CHNO含量测定的元素组成分析以及针对水和溶剂含量的TG-FTIR来验证。所获得的结果总结在表8中—样品SP245-OXA-P1的CHNO含量分析与分子量为237.21g/mol且式为C8H15NO7的(1:1)无溶剂且无水盐的理论组成进行比较。CHNO分析的结果显示与无溶剂且无水单酒石酸盐的理论含量优异的匹配。

表8：异法戈明D-(-)-酒石酸盐的元素分析

实例5：异法戈明盐的稳定性研究

为了获得关于四种结晶IFG盐的热稳定性的见解，在80℃下在若干天内进行储存应激测试。将游离碱的样品(SP245-FB-P4)、富马酸盐样品(SP245-FUM-P5)、D-酒石酸盐样品(SP245-DTA-P7)、L-酒石酸盐样品(SP245-LTA-P5)和草酸盐样品SP245-OXA-P2在密闭小瓶中在80℃下储存一天、三天和七天。通过CAD和¹H-NMR测试样品。

进行CAD-HPLC以便鉴定在给定的条件下储存时可能产生的可能的加合物或热降解产物。通过CAD-HPLC检查所有样品；然而，在起始材料与所储存样品之间没有观察到显著的变化。这些结果呈现在表9中并且表明IFG盐在所检查条件下是稳定的。另外，对七天储存的结晶盐样品进行XRPD，并且储存之前和之后的XRPD图谱基本上相同。

在80℃下储存七天之后，所有盐都比游离碱显著更稳定。对七天储存的样品进行NMR光谱学。对于游离碱样品，与未受应激的样品相比，在储存之后观察到若干另外的NMR信号，并且因此证实了在HPLC中观察到的纯度损失。在盐的NMR样品中没有注意到显著的变化。

表9：异法戈明盐的稳定性研究的CAD-HPLC结果。

实例6：示例性GCase和IFG/GCase药物调配物

用于上述调配物A、B和C的IFG选自以下之一：IFG游离碱、IFG奎尼酸盐、IFG苹果酸盐、IFG富马酸盐、IFG草酸盐、IFG丙二酸盐、IFG琥珀酸盐、IFG D-酒石酸盐、IFG环己基氨基磺酸盐或IFG抗坏血酸盐。

实例7—酒石酸盐和富马酸盐IFG/GCase调配物的稳定性研究

本报告总结了在含有异法戈明酒石酸盐或异法戈明富马酸盐的调配物中收集的维拉西酶α的稳定性研究的数据。这项研究的目的是评估异法戈明富马酸盐是否具有与异法戈明酒石酸盐相当的稳定作用，以及异法戈明富马酸盐是否可以是异法戈明酒石酸盐的替代性盐。

这项研究评估了大约140mg/mL的含有在储存和机械应激期间评估的两种不同的IFG盐形式：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐的维拉西酶α调配物的稳定性。结果显示：

1)在制备之后，在两种调配物之间在外观、pH、蛋白质浓度、重量摩尔渗透压浓度、P188浓度、亚可见颗粒、RP-HPLC、SDS-PAGE、活性、还原和非还原条件下的完整质量和在T0、40℃和-20℃下持续长达1个月的肽作图方面以及在摇动24小时后没有显著差异。在T0、-20℃下持续1个月并且以200rpm摇动24小时观察到A320值的轻微差异。

2)在T0下并且在40℃下储存一个月后，富马酸盐调配物中的异法戈明含量略高于酒石酸盐调配物中的异法戈明含量。富马酸盐调配物的粘度略高于酒石酸盐调配物的粘度。

3)两种不同的SE-HPLC方法的聚集数据显示，在40℃下储存期间富马酸盐调配物不如酒石酸盐调配物稳定。在-20℃下储存或摇动24小时后未观察到显著差异。

4)DSC结果还显示，酒石酸盐调配物中的维拉西酶α的Tm值略高于富马酸盐调配物中的Tm值。

总的来说，这些结果显示，在T0时制备的这两种调配物与所有测定都是相当的，不同之处在于异法戈明含量略高于酒石酸盐调配物中的异法戈明含量。两种调配物在摇动、在-20℃下储存和在-40℃下储存期间都是稳定的。然而，如通过SEC所测量的，富马酸盐调配物在-40℃下储存期间相对不如酒石酸盐调配物稳定，并且富马酸盐调配物的粘度也略高于酒石酸盐调配物的粘度。

这组数据表明，异法戈明富马酸盐可以是异法戈明酒石酸盐的替代方案，但关于稳定性和粘度略有折中。

1.样品制备

将维拉西酶α在室温下解冻。将解冻的维拉西酶α在室温下用Millipore

TFF系统使用Pellicon XL盒浓缩(目录编号：PXB010A50，

10KDa，化学聚醚砜)。将维拉西酶α浓缩到大约160mg/mL。然后将浓缩的维拉西酶α(47.5mL)加载到Slide-A-

透析盒(10K MWCO)中，并且在2-8℃下针对2.0L的含有7.5mM异法戈明富马酸盐或异法戈明酒石酸盐的调配物缓冲液透析两次。

表10示出了两种调配物缓冲液的组成。将异法戈明酒石酸盐调配物和异法戈明富马酸盐调配物的pH用1.0NaOH分别从5.61和4.48调节到6.0。

表10：含有IFG酒石酸盐和IFG富马酸盐的维拉西酶α调配物的组成

	酒石酸盐调配物(原始)	富马酸盐调配物(替代物)
			IFG摩尔浓度	7.5mM	7.5mM
盐形式	酒石酸盐	富马酸盐
			柠檬酸	0.0mM	8.32mM
柠檬酸钠	10mM	1.68mM
			P188	0.1％W/W	0.1％W/W
蔗糖	250mM	250mM
			pH	6.0	6.0

将每种浓缩的蛋白质调配物溶液过滤(用Millipore Steriflip-

)并无菌填充到6R I型玻璃瓶中，并且用20-mm灰色橡胶血清塞塞住并用铝密封件卷曲。

1.1应激条件

1.1.1在40℃下储存

将一组填充的小瓶在40℃下倒置储存17天(0.5个月)和32天(1个月)。

1.1.2在-20℃下储存

将填充的小瓶在-20℃下直立储存32天(1个月)。

1.1.3搅拌

在室温下以水平朝向在旋转摇床上以200rpm进行搅拌，持续24小时。

1.2测试方法

1.2.1常规测定方法

表11示出了测试方法的列表。

表11：测试方法

2.数据分析

在40℃和-20℃下以及在摇动应激下，将含有IFG-富马酸盐(此后为富马酸盐调配物)的维拉西酶α调配物的稳定性趋势与含有IFG-酒石酸盐(此后为酒石酸盐调配物)的维拉西酶α的稳定性趋势进行比较。

2.1外观

在常规光照下，在完整的小瓶中观察到外观。用于酒石酸盐调配物和富马酸盐调配物两者的所有小瓶在T0时、在40℃下储存0.5个月和1个月之后、在-20℃下储存1个月之后或以200rpm摇动24小时之后是澄清到轻微乳白色、无色、基本上不含可见颗粒。

2.2 pH

表12示出了pH结果。两种调配物的pH在40℃下均没有变化。

表12：pH结果

	T0	40℃，持续1个月
			酒石酸盐调配物	5.92	5.92
富马酸盐调配物	5.90	5.93

2.3蛋白质浓度

使用SoloVPE，通过改变路径长度并精确地测量未稀释药物物质在280nm处的吸光度作为路径长度的函数来测量蛋白质浓度。280nm处的吸光度由320nm处的吸光度校正，这是光散射的指标。根据比尔定律，数据的斜率(吸光度单位/mm)与蛋白质浓度成正比。维拉西酶α蛋白浓度使用吸光度与路径长度的线性图的斜率和维拉西酶α的1.63(mg/mL)^-1(cm)^-1的消光系数来计算。结果以mg/mL为单位表示。表13示出了浓度结果。在40℃下储存1个月之后没有显著变化。

表13：浓度(mg/mL)结果

	T0	40℃，持续1个月
			酒石酸盐缓冲液	0.01	NS
富马酸盐缓冲液	1.2	NS
			酒石酸盐调配物	141.8	142.9
富马酸盐调配物	140.0	139.6

2.4 P188浓度

表14示出了P188浓度结果。就P188浓度而言，这两种调配物之间没有显著差异。

表14：P188浓度(％w/v)

	T0
		酒石酸盐调配物	0.209
富马酸盐调配物	0.221

2.5 IFG浓度

将维拉西酶α药物物质调配在含有3mM异法戈明(IFG)的缓冲液中。将维拉西酶α药物物质中的IFG浓度通过反相超高效液相色谱法(UPLC)进行分析。在这种方法中，6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)与IFG发生定量反应，所述反应将IFG转化成UV可检测形式并且然后通过UPLC进行分离。检测波长为260nm。运行IFG标准以产生标准曲线。对IFG标准数据进行线性回归，并且所得参数用于计算样品中的IFG浓度。结果以mM为单位报告。

表15示出了IFG浓度结果。在40℃下储存一个月期间没有发生变化。然而，富马酸盐调配物含有比酒石酸盐调配物略高的IFG浓度。

表15：IFG浓度

	T0	40℃，持续1个月
			酒石酸盐调配物	7.73	7.16
富马酸盐调配物	9.39	9.42

2.6重量摩尔渗透压浓度

表16示出了重量摩尔渗透压浓度结果。重量摩尔渗透压浓度没有显著差异，然而结果却高于最佳重量摩尔渗透压浓度，但与使用相同方法的其它研究的结果一致。

表16：重量摩尔渗透压浓度结果(mOSm)

	T0(n＝2)
		酒石酸盐调配物	376.5+10.6
富马酸盐调配物	370.5+10.6

2.7亚可见颗粒

表17示出了亚可见颗粒结果。这两种调配物之间没有显著差异。然而，在40℃和-20℃下储存期间以及在以200rpm摇动24小时之后，这两种调配物的亚可见颗粒计数有所增加。

表17：酒石酸盐和富马酸盐调配物中的维拉西酶α的亚可见颗粒计数(平均值±SD，n＝3/4)

2.8粘度

使用500-μL注射器用m-VROC粘度计测量粘度。将每个样品在20℃下以50、100和200微升/分钟的流速进行测试，并且报告平均结果。在测量之前，将测量粘度的样品在2-8℃下储存3个月，并且没有观察到外观的明显变化。

表18示出了这两种调配物的粘度。酒石酸盐调配物中的维拉西酶α的粘度略低于富马酸盐调配物中的维拉西酶α的粘度。

表18：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐调配物中的维拉西酶α的粘度

	粘度(cP)
		酒石酸盐调配物	5.9
富马酸盐调配物	6.6

2.9 A320

使用平板读取器收集A320数据。将样品(每个孔)加载到UV-

微板(96孔，

澄清)，并且在320nm处收集数据。

表19示出了维拉西酶α调配物在不同处理条件下的A320值。在T0、-20℃下持续一个月并且在摇动24小时之后，富马酸盐调配物的A320值略高于酒石酸盐调配物的A320值。在40℃下储存0.5个月和1个月之后，在这两种调配物之间没有观察到显著差异。

表19：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐调配物中的维拉西酶α的A320值(平均值±SD，n＝3)

	酒石酸盐	富马酸盐
			T0	0.272±0.000	0.291±0.003
40C-0.5个月	0.357±0.001	0.360±0.000
			40C-1个月	0.392±0.001	0.391±0.001
-20C-1个月	0.290±0.002	0.309±0.002
			以200rpm摇动24小时	0.289±0.000	0.306±0.001

2.10活性

通过测量底物对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷被维拉西酶α水解为对硝基苯酚和β-D-吡喃葡萄糖苷的速率来确定体外活性。通过添加甘氨酸碳酸盐缓冲液终止反应。在405nm处测量特性黄色对硝基苯酚产物的吸光度。维拉西酶α酶活性通过对在测定中产生的标准曲线进行插值来确定。将一个单位(U)的酶活性定义为在指定的测定条件下每分钟转化一微摩尔对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷所需的维拉西酶α的量。维拉西酶α样品的可报告活性值为U/mL。

表20示出了活性结果。在40℃和-20℃下储存长达1个月之后并且以200rpm摇动24小时之后，没有显著变化。

表20：活性结果

	酒石酸盐	富马酸盐
			T0	35.0	36.4
40℃，持续0.5个月	38.9	38.0
			40℃，持续1个月	35.8	37.9
-20℃，持续1个月	37.9	38.5
			以200rpm摇动24小时	33.0	36.7

2.11 SE-HPLC.

尺寸排阻HPLC(SE HPLC)用于评估维拉西酶α的尺寸均匀性。所述方法通过蛋白质的流体动力学尺寸来分离蛋白质。较大物种(例如，聚集体、二聚体和寡聚体)比维拉西酶α单体主要物种更早地作为前峰洗脱，而较小物种(例如，降解产物和片段)更晚地作为后峰洗脱。通过214nm处的吸光度检测洗脱峰。这种方法报告了主峰百分比和高分子量(HMW)物种百分比。所有样品均通过两种不同的SE-HPLC方法进行测试：RE-PMP-0010和RE-PMP-0013。RE-PMP-0010是一种用于商业

的方法，其中维拉西酶α分子单体在缓冲液峰之后被洗脱，这可能是由于维拉西酶α分子与固定相之间的相互作用。RE-PMP-0013是一种针对VPRIV-SubQ调配物开发的方法，并且在这种方法中，10％的乙腈用作洗脱缓冲液的组分。在研究中使用这两种方法来表征这两种调配物中的维拉西酶α。

2.11.1 VPRIV方法(RE-PMP-0010).

评估了分别在T0、40℃持续0.5个月和1个月、-20℃持续1个月和水平摇动24小时下这两种调配物的维拉西酶α的SE-HPLC色谱图。

表21示出了在不同条件下处理后维拉西酶α的SE-HPLC保留时间。40C17D与在40℃下持续17天(或0.5个月)的储存条件相对应，40C1M与在40℃下持续1个月的储存条件相对应，N20C1M与在-20℃下持续1个月的储存条件相对应。单体峰在34分钟时被洗脱，并且聚集体物种在12.8分钟到23.9分钟之间被洗脱。缓冲液峰在25-27分钟时被洗脱。然而，在40℃下储存0.5个月和1个月之后聚集体物种的分布与在T0时或在-20℃下储存1个月或摇动24小时之后维拉西酶α中的分布有所不同。然而，在酒石酸盐调配物与富马酸盐调配物之间在所有处理条件下，这些物种的峰位没有明显差异。

表21：酒石酸盐和富马酸盐调配物中的维拉西酶α的SE-HPLC保留时间(分钟)

样品	HMWS 1	HMWS 2	聚集体	未知1	未知2	未知3	单体
								酒石酸盐T0	12.89	15.52	16.35	19.56	21.47	22.34	33.99
富马酸盐T0	13.02	15.66	16.52	19.77	21.73	22.98	34.44
								酒石酸盐40C17D	12.85	--	16.29	19.57	23.09	23.70	33.93
富马酸盐40C17D	12.87	--	16.28	19.55	21.96	23.74	33.89
								酒石酸盐40C1M	12.82	--	16.30	19.56	23.06	23.82	33.98
富马酸盐40C1M	12.83	--	16.31	19.57	22.03	23.86	34.22
								酒石酸盐N20C1M	12.84	15.49	16.33	19.55	21.46	22.34	33.95
富马酸盐N20C1M	12.90	15.52	16.35	19.57	21.48	22.67	34.16
								摇动的酒石酸盐	12.88	15.52	16.34	19.56	21.46	22.38	33.84
摇动的富马酸盐	12.87	15.52	16.33	19.56	21.47	22.55	34.06

表22示出了在不同条件下处理后维拉西酶α中的不同物种的SE-HPLC相对峰面积。在40℃下储存0.5个月、在-20℃下储存1个月或摇动24小时之后，在T0下，这两种调配物没有明显差异。在40℃下持续1个月，富马酸盐调配物显示出比酒石酸盐调配物更高的聚集水平。

表22：酒石酸盐和富马酸盐调配物中的维拉西酶α的SE-HPLC相对峰面积

2.11.2 SE-HPLC方法(RE-PMP-0013)

使用适应于VPRIV SubQ调配物的方法，评估了分别在T0、40℃持续0.5个月和1个月、-20℃持续1个月和水平摇动24小时下这两种调配物中的维拉西酶α的SE-HPLC色谱图。

表23示出了维拉西酶α的SE-HPLC峰的保留时间。在-20℃储存0.5个月并且还摇动24小时之后，对于两种调配物，在T0下，在大约16.4分钟时出现聚集体物种并且在19.6分钟时出现单体峰。在40℃下储存0.5个月和1.0个月之后出现另外的聚集体峰(未知1)。然而，在相同处理条件下，在这两种调配物之间的物种的保留时间和分布方面没有明显差异。

表23：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐调配物中的维拉西酶α的SE-HPLC保留时间

表24示出了两种调配物的SE-HPLC峰的相对峰面积。在-20℃下储存并且摇动24小时之后，在T0下，在这两种调配物之间没有显著差异。富马酸盐调配物的HMWS(未知1+聚集体)的总量大于酒石酸盐调配物的HMWS的总量。

表24：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐调配物中的维拉西酶α的SE-HPLC相对峰面积

2.12 RP-HPLC

进行反相高效液相色谱法(HPLC)以测量维拉西酶α中的潜在过程和产物相关杂质的相对量。这种方法通过具有渐增的有机物含量梯度的反相柱解析维拉西酶α降解产物。所述方法检测主要的维拉西酶α峰，加上在214nm处主峰之前和之后的其它峰。纯度报告为主峰的相对面积百分比。

评估了分别在T0、40℃下储存0.5个月和1个月、在-20℃下储存1个月和水平摇动24小时下维拉西酶α的RP-HPLC色谱图。在40℃下储存0.5个月和1.0个月之后，这两种调配物的色谱图略有不同。

表25示出了维拉西酶α的RP-HPLC峰的保留时间。在-20℃储存1个月和摇动24小时之后，在T0下，维拉西酶α酶的保留时间在这两种调配物之间没有显著差异。在40℃下储存0.5个月和1.0个月的维拉西酶α的相对峰洗脱时间在这两种调配物之间略有不同。

表25：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐调配物中的维拉西酶α的RP-HPLC保留时间

表26示出了两种调配物的相对RP-HPLC峰面积。在-20℃下储存并且摇动24小时之后，在T0下，在这两种调配物之间没有显著差异。在40℃下储存0.5个月和1.0个月的这两种调配物之间在峰C和主峰的相对峰面积上存在轻微差异。

表26：异法戈明酒石酸盐和异法戈明富马酸盐调配物中的维拉西酶α的RP-HPLC相对峰面积

2.13 SDS-PAGE

在变性和还原条件下，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)用于评估维拉西酶α的纯度。将维拉西酶α测试样品、参考标准物和两个测定对照用样品稀释缓冲液稀释，并且与还原剂(二硫苏糖醇)混合，在加热下变性并且加载到Tris-甘氨酸梯度凝胶上。还在凝胶上测试分子量标志物。电泳后，将凝胶进行考马斯(Coomassie)蓝染色并显影。评估测试样品是否存在碎片或不可还原的聚集体。通过与具有2种不同杂质水平(1.0％和3.0％)的参考标准物和测定对照进行比较来评估纯度。

分别评估了酒石酸盐和富马酸盐调配物中的维拉西酶α的SDS-PAGE结果。在-20℃下储存1个月并且摇动24小时之后，两种调配物中的维拉西酶α没有显著降解。然而，对于在40℃下储存0.5个月和1.0个月的两种调配物，维拉西酶α明显降解为更小MW的物种。然而，对于所有处理条件，这两种调配物之间没有明显差异。

2.14 DSC

使用Micro-Cal VP DSC软件以1℃/分钟的升温速率从10℃到95℃收集DSC数据。在将调配物稀释到大约4.67mg/mL之后，收集DSC热谱图。还收集了相应缓冲液的数据。将每种缓冲液的热谱图相对于水-水热谱图进行校正。将每种活性调配物的热谱图相对于其相应缓冲液进行校正并且进行评估。

对于两种缓冲液，在大约52℃下均会出现相变。富马酸盐缓冲液的转变热转变事件更为突出。两种缓冲液中的维拉西酶α显示出显著的峰，并且所述峰的Tm总结在表27中。这两种调配物中的维拉西酶α的Tm值相当。

表27：酒石酸盐和富马酸盐调配物中的维拉西酶α的Tm(℃)值

	酒石酸盐调配物	富马酸盐调配物
			运行1	71.58	71.28
运行2	71.17	71.08
			平均数	71.38	71.18
SD	0.29	0.14

2.15质谱法

2.15.1完整质量

用非还原样品和还原样品两者收集完整质量。

通过将1μL的每个样品与400μl的0.1％TFA混合来制备非还原样品，并且然后将10μl的所得混合物注射到LC-MS系统中。按以下程序制备还原样品：将每个样品用6M胍变性，用DTT还原并且用IAA烷基化。脱盐后，将10μl的约0.5mg/ml的每个样品(在100mM Tris中，pH 8.5)注射到6600中。

HPLC条件：柱:ACE 5Phenyl-300，1.0×50mm，5μm，P/N ACE-225-0501M：流动相A：含0.1％三氟乙酸的水溶液；以及B：含0.085％三氟乙酸的乙腈，并且梯度洗脱条件示出于表28中。

表28：用于收集完整质谱法的梯度洗脱条件

时间	流速	A％	B％	曲线
					初始	0.2	90	10	初始
3	0.2	90	10	6
					5	0.2	70	30	6
7	0.2	60	40	6
					17	0.2	50	50	6
19	0.2	5	95	6
					23	0.2	5	95	6
24	0.2	90	10	6
					27	0.2	90	10	6

评估维拉西酶α调配物的非还原和还原质量色谱图。在所述条件中的每个条件下，在这两种调配物之间没有观察到保留时间和质量的显著差异。

2.16肽作图

将维拉西酶α样品变性、还原和烷基化。添加另外的DTT以淬灭过量的烷基化，并且使用NAP-5脱盐柱对反应混合物进行脱盐。将内蛋白酶Lys-C添加到脱盐的样品中并且在37℃下反应5小时，此后，将N-聚糖酶-PLUS添加到消化的样品中并且在37℃下反应1小时。在保持在40℃下的ACE C18柱(150×2.1mm，3μ，

)上分离所得脱肽。

使用在含2％到43％乙腈的水溶液的范围内与三氟乙酸的弯曲梯度和0.25毫升/分钟的流速来分离肽。

在以200rpm摇动24小时、在40℃储存1个月、在-20℃储存1个月之后，在T0下，分别评估酒石酸盐和富马酸盐调配物中的维拉西酶α的肽作图结果。评估了经鉴定的肽的序列和丰度。每种肽的保留时间以及质量结果在调配物之间没有显著差异。

3.结论

以相同的方式制备含有140mg/mL维拉西酶α和异法戈明酒石酸盐或异法戈明富马酸盐的维拉西酶α调配物，并且在40℃和-20℃的储存条件下评估持续长达1个月并且在以200rpm摇动24小时之后进行评估。

在T0下，在两种调配物之间在外观、pH、蛋白质浓度、重量摩尔渗透压浓度、P188浓度、亚可见颗粒、RP-HPLC、SE-HPLC、SDS-PAGE、活性、还原和非还原条件下的完整质量以及肽作图方面没有显著差异。富马酸盐调配物中的异法戈明含量高于酒石酸盐调配物的异法戈明含量，富马酸盐调配物的A320值略大于酒石酸盐调配物的A320值。酒石酸盐调配物的Tm值略大于富马酸盐调配物的Tm值。另外，富马酸盐调配物的粘度结果略高于酒石酸盐调配物。

在40℃储存长达1个月期间，这两种调配物的质量属性结果通过外观、pH、蛋白质浓度、亚可见颗粒、RP-HPLC、SDS-PAGE、活性、A320、还原和非还原条件下的完整质量以及肽作图是相当的。然而，SE-HPLC结果显示，富马酸盐调配物在聚集水平上与酒石酸盐调配物相比稍微不太稳定。另外，富马酸盐调配物的异法戈明含量略高于酒石酸盐调配物，这与T0结果一致。

在-20℃下储存1个月之后并且在以200rpm摇动24小时之后，这两种调配物的质量属性结果通过外观、亚可见颗粒、RP-HPLC、SE-HPLC、SDS-PAGE、活性、还原和非还原条件下的完整质量以及肽作图是相当的。富马酸盐调配物的A320值略大于酒石酸盐调配物的A320值。

总之，在储存和机械应激期间，异法戈明富马酸盐具有与异法戈明酒石酸盐很大程度上相当的稳定作用。然而，预期异法戈明酒石酸盐在储存期间具有略高的聚集水平和略高的粘度。

实例8：维拉西酶α调配物B-IFG酒石酸盐在各种储存条件下的稳定性研究

为了获得关于用异法戈明酒石酸盐调配的药物维拉西酶α-IFG酒石酸盐调配物B(参见以上实例6)的长期储存稳定性的见解，进行了长期储存应激测试。所述调配物具有适于皮下施用的高蛋白质浓度。

用于稳定溶液中的维拉西酶α的异法戈明化合物是异法戈明酒石酸盐。调配物缓冲液含有3mM异法戈明(游离异法戈明)，并且蛋白质以1:1的摩尔比结合异法戈明。在60mg/mL蛋白质浓度下，蛋白质的摩尔浓度为约1Mm(糖基化维拉西酶α的分子量为63kDa)。在UFDF过程期间，当病毒过滤池被浓缩并且经缓冲液交换时，大约1mM异法戈明将与蛋白质结合。药物物质的异法戈明总含量是游离和结合的异法戈明的总和，并且针对维拉西酶α-IFG酒石酸盐调配物B进行监测。

在长期储存条件(≤-65℃)下，长达18个月的纯度测试结果显示，通过SE-HPLC的高分子量物种有所增加，而通过RP-HPLC和SDS-PAGE(考马斯)的高分子量物种没有变化。蛋白质含量、pH和效力结果显示在长达18个月内没有趋势。这些程序如实例7中所述。

长期储存条件下的所有结果均满足规范。观察到可见颗粒，并且可见颗粒归因于处理材料所处的非受控环境并且与蛋白质调配物或稳定性无关。维拉西酶α调配物B-IFG酒石酸盐的外观的标准是“基本不含颗粒”。在GMP条件下未预期可见颗粒。在所有时间点和储存条件下，颜色和透明度的测试均符合规范。

基于实时稳定性数据，维拉西酶α药物物质可在≤-65℃储存时稳定，持续18个月。参见下表29。由此产生的可用数据和趋势图表证明，当在≤-65℃的长期储存条件下储存时，预期维拉西酶α药物产品在整个30个月内保持在规范的接受标准内。

在加速(-20±5℃)和应激(5±3℃)条件下分别生成十二个月和三个月的数据。分别参见下表30和31。在加速储存条件(-20±5℃)下，趋势与长期储存条件相当。在应激储存条件(5±3℃)下，维拉西酶α药物物质可稳定长达3个月。

3.1外观

药物产品在≤-65℃的长期储存温度下的外观结果满足接受标准。对于所有测试样品均未观察到明显的变化。

3.2 pH

维拉西酶α药物产品在≤-65℃的长期储存温度下的pH结果满足接受标准。没有观察到显著的变化或趋势。

3.3蛋白质浓度(A280)

蛋白质浓度的确定通过测量280nm处的吸光度(A280)来进行。在≤-65℃的长期储存温度下，维拉西酶α药物产品的可用蛋白质浓度结果在所有测试样品的接受标准内。没有观察到明显的变化或趋势。

3.4 SE-HPLC

在≤-65℃的长期储存温度下，60mg/mL的维拉西酶α药物产品的可用SE-HPLC结果在所有测试样品的接受标准内。没有观察到明显的变化或趋势。

3.5比活性

在≤-65℃的长期储存温度下，维拉西酶α药物产品的可用比活性结果在所有测试样品的接受标准内。没有观察到明显的变化或趋势。

3.6 SDS-PAGE

在≤-65℃的长期储存温度下，维拉西酶α药物产品的可用SDS-PAGE结果在接受标准内。

3.7亚可见微粒

在≤-65℃的长期储存温度下，维拉西酶α药物产品的可用结果在所有测试样品的接受标准内。

3.8细胞摄取生物测定(CUB)

在≤-65℃的长期储存温度下，维拉西酶α药物产品的可用CUB结果在所有测试样品的接受标准内。观察到相对摄取略有增加。

3.9异法戈明(IFG)含量

在≤-65℃的长期储存温度下，维拉西酶α药物产品的可用异法戈明总浓度结果在所有测试样品的接受标准内。观察到IFG含量略有下降。如果异法戈明水平下降到维持葡糖脑苷脂酶的稳定性所需的量以下，则将预期可见和/或亚可见微粒以及SEC-HPLC HMWS增加。未观察到这些属性的统计学显著趋势。

3.10结论

稳定性结果支持在≤-65℃的长期储存条件下，维拉西酶α的保质期从12个月延长到30个月。

表29：在长-期储存条件(≤-65℃)下18个月之后维拉西酶α调配物B-IFG酒石酸盐的稳定性数据。

NS＝未按方案调度；NT–未测试

^a–在研究开始时尚未进行IFG含量测试。

表30：在-20±5℃下12个月之后维拉西酶α调配物B-IFG酒石酸盐的稳定性数据。

表31：在-5±3℃下3个月之后维拉西酶α调配物B-IFG酒石酸盐的稳定性数据。

a–观察到一些白色颗粒。

***

本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。应进一步理解，所有值都是近似的并且被提供用于描述。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以包含定义的本说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。

Claims (34)

1.一种异法戈明的盐，其中所述盐选自奎尼酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、环己基氨基磺酸盐和抗坏血酸盐。

2.根据权利要求1所述的盐，其中所述盐是异法戈明奎尼酸盐。

3.根据权利要求1所述的盐，其中所述盐是异法戈明富马酸盐。

4.根据权利要求1所述的盐，其中所述盐是异法戈明草酸盐。

5.根据权利要求1所述的盐，其中所述盐是异法戈明琥珀酸盐。

6.根据权利要求1所述的盐，其中所述盐是异法戈明环己基氨基磺酸盐。

7.根据权利要求2所述的盐，其中异法戈明奎尼酸盐呈结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在选自以下的2θ值处具有三个或更多个特征峰：9.5°±0.2°、15.0°±0.2°、17.4°±0.2°、18.1°±0.2°、20.3°±0.2°、23.8°±0.2°、24.8°±0.2°和25.4°±0.2°。

8.根据权利要求3所述的盐，其中异法戈明富马酸盐呈结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在选自以下的2θ值处具有三个或更多个特征峰：16.1°±0.2°、18.3°±0.2°、18.6°±0.2°、21.9°±0.2°、23.6°±0.2°、23.8°±0.2°和25.5°±0.2°。

9.根据权利要求4所述的盐，其中异法戈明草酸盐呈结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在选自以下的2θ值处具有三个或更多个特征峰：27.8°±0.2°、32.2°±0.2°、35.3°±0.2°、36.6°±0.2°、37.4°±0.2°、38.4°±0.2°、18.5°±0.2°、19.2°±0.2°、21.4°±0.2°、22.6°±0.2°、24.5°±0.2°、24.8°±0.2°、26.8°±0.2°、20.2°±0.2°和23.7°±0.2°。

10.根据权利要求5所述的盐，其中异法戈明琥珀酸盐呈结晶形式，其特征在于具有XRPD峰。

11.根据权利要求6所述的盐，其中异法戈明环己基氨基磺酸盐呈结晶形式，其特征在于具有XRPD峰。

12.一种异法戈明的盐，其中所述盐是异法戈明D-酒石酸盐的结晶形式，其特征在于x-射线衍射图在选自以下的2θ值处具有三个或更多个特征峰：9.8°±0.2°、10.5°±0.2°、15°±0.2°、15.3°±0.2°、15.8°±0.2°、17.4°±0.2°、17.9°±0.2°、18.5°±0.2°、18.9°±0.2°、19.6°±0.2°、21.1°±0.2°、21.7°±0.2°、22°±0.2°、24.2°±0.2°、24.8°±0.2°、26.6°±0.2°、27.1°±0.2°、27.4°±0.2°、33.8°±0.2°、35.7°±0.2°、36.5°±0.2°和37.5°±0.2°。

13.一种药物组合物，其包括至少一种根据权利要求1到12中任一权利要求所述的异法戈明盐以及药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其进一步包括葡糖脑苷脂酶，其中异法戈明以足以使所述葡糖脑苷脂酶稳定的量存在。

15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述葡糖脑苷脂酶是维拉西酶α。

16.根据权利要求13到15中任一权利要求所述的药物组合物，其中所述葡糖脑苷脂酶与所述异法戈明的摩尔比为约1:2.5到约1:3.5。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物包括60-180mg/mL的葡糖脑苷脂酶，并且其中异法戈明以相对于所述葡糖脑苷脂酶至少约3倍摩尔过量存在。

18.一种药物组合物，其包括摩尔比为约1:3的葡糖脑苷脂酶和异法戈明，其中所述组合物进一步包括柠檬酸钠缓冲液、蔗糖以及一或多种表面活性剂，所述一或多种表面活性剂选自PS20、PS80和泊洛沙姆188。

19.一种制备根据权利要求13到18中任一权利要求所述的药物组合物的方法，所述方法包括将异法戈明和药学上可接受的载体组合。

20.一种制备根据权利要求14到18中任一权利要求所述的药物组合物的方法，所述方法包括：将异法戈明溶解在水中；将pH调节到约6.0；以及添加葡糖脑苷脂酶以产生所述组合物。

21.一种治疗与GCase途径功能障碍相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求13到18中任一权利要求所述的组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法对于治疗所述病症是有效的。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物是静脉内或皮下施用的。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述组合物是皮下施用的。

25.一种治疗与GCase途径功能障碍相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包括0.5mg/kg到5.0mg/kg的葡糖脑苷脂酶和相对于所述葡糖脑苷脂酶至少约3倍摩尔过量的异法戈明的组合物，其中所述组合物是皮下施用的。

26.一种治疗戈谢氏病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用此类治疗：i)治疗有效量的根据权利要求1到12中任一权利要求所述的异法戈明盐或其调配物；或ii)治疗有效量的根据权利要求13到18中任一权利要求所述的药物组合物。

27.一种产生异法戈明盐的方法，所述方法包括以下步骤：

i)将有机酸溶解在极性质子溶剂中以产生溶液1；

ii)将异法戈明游离碱溶解在极性质子溶剂中以产生溶液2；

iii)将溶液1和溶液2组合，由此形成沉淀物；以及

iv)分离与所述异法戈明盐相对应的沉淀物；

其中所述有机酸选自奎尼酸、富马酸、草酸、丙二酸、D-酒石酸、L-酒石酸、琥珀酸、环己基氨基磺酸和抗坏血酸。

28.根据权利要求26所述的产生异法戈明盐的方法，其中所述异法戈明盐呈结晶形式。

29.根据权利要求26所述的产生异法戈明盐的方法，其中所述异法戈明游离碱的纯度为至少约98％。

30.一种组合物，其包括根据权利要求1到13中任一权利要求所述的异法戈明盐，其中所述异法戈明盐的纯度为至少约95％。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述异法戈明盐的纯度为至少约96％。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述异法戈明盐的纯度为至少约97％。

33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述异法戈明盐的纯度为至少约98％。

34.根据权利要求30所述的组合物，其中所述异法戈明盐的纯度为至少约99％。

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