CN113899844A - 一测多评法评价白术质量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种一测多评法评价白术质量的方法，该方法采用廉价易得的白术内酯Ⅲ作为内参物进行一测多评，建立白术内酯Ⅲ与白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮之间的相对保留时间、相对校正因子，通过校正因子计算白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的含量，采用超高效液相色谱法进行测定。本发明方法通过相对校正因子及色谱峰定位计算指标成分含量，可以同时有效检测出白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮4种成分的含量，可节约成本、简化操作，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对大宗药材白术的质量控制和保证其临床疗效具有重大意义。

Description

一测多评法评价白术质量的方法
技术领域
本发明属于药材质量控制技术领域，具体涉及一种一测多评法评价白术质量的方法。
背景技术
中药成分复杂多变，其药理活性和临床疗效往往是多种成分共同作用的结果。以单一成分或某一类成分的含量作为评价指标，通常无法全面、充分地反映中药的质量。然而通过测定多种成分的含量来控制中药质量，则存在对照品稀缺、不稳定、成本高等诸多问题，给检测造成较大困难。因此，如何通过某一个成分的含量测定来同时测定多个或多种结构相似的药效物质的含量，实现中药质量的有效控制，是亟待解决的问题。
一测多评法(quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS)是中药领域多成分同步质量控制的新模式，指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，通过只测定其中一个稳定、廉价、易得的成分，来实现多个成分(对照品难以得到或供应)的同步测定，可有效解决中药多指标质量控制过程中对照品使用较多、成本高、难以供应等问题，其方法将会是中药多组分同步定量的发展方向。
白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，是一种重要的大宗药材，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎的功效，是浙江道地药材“浙八味”之一，白术根茎含挥发油，挥发油中主要成分为白术内酯类、苍术酮和苍术醇等，对治疗肝硬化腹水、原发性肝癌、美尼尔氏综合症、慢性腰痛、急性肠炎及白细胞减少症等有一定疗效，白术用途广泛，除医疗配方用药外，又是40多种中成药制剂的重要原料。
专利202010678723.2公开了一种白术中有效成分白术内酯Ⅲ、Ⅰ含量的测定方法，该方法分别采用白术内酯Ⅲ、Ⅰ为标准品，通过液相色谱仪进行测定，记录色谱图，以外标法计算白术内酯Ⅲ、Ⅰ的含量；专利201910725324.4公开了一种检测白术药品中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的UPLC方法，该方法分别采用白术内酯Ⅲ、Ⅰ为标准品，通过超高效液相色谱仪进行测定，分别根据标准品白术内酯Ⅲ、Ⅰ的UPLC特征图谱和待测白术样品的UPLC特征图谱对制备得到的待测白术样品进行定量；现有文献报道白术中有效成分测定的方法有：(1)分别采用白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮为标准品，通过高效液相色谱-二极管阵列检测器，测定白术多指标成分的含量，该方法标准品品种多、操作步骤繁琐(王丽敏,周燕红,杨莹,杜伟锋,葛卫红,李昌煜.白术多指标成分含量测定方法优化[J].浙江中医药大学学报,2020,44(07):657-667.)；(2)采用超高效液色谱仪，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，检测波长为235nm，进样量为2μL，流速为0.2mL·min-1，柱温30℃，以白术内酯III为内参物，测定其与白术内酯I、II的相对校正因子，利用该相对校正因子计算白术内酯I、白术内酯II的含量(赵玉娇,梁国锐,宫文霞,田俊生,秦雪梅.白术中3种内酯成分一测多评方法的建立[J].中国药学杂志,2018,53(07):499-503.)。目前尚未见通过测定白术中一种成分的含量来实现同时测定白术中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮4种成分的含量的研究报道。
目前报道的白术质量的评价方法存在检测成分少、标准品品种多、操作步骤繁琐、分析周期长、成本高等问题。因此，建立一种稳定可控、成本低、准确高效的白术质量控制方法具有重要意义。
发明内容
针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的一测多评法评价白术质量的方法，该方法以白术内酯III为内参物，建立白术内酯III与白术内酯II、白术内酯I、苍术酮之间的相对校正因子，通过只测定白术内酯III的含量，用相对校正因子计算出白术内酯II、白术内酯I和苍术酮的含量，建立全面可控的白术质量评价方法，大大降低了检测成本，且检测结果更加稳定可控。
本发明通过以下技术方案加以实现：
S1.材料准备：将供试品白术磨成粉末，过2号筛备用；
S2.混合标准品溶液的制备：精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮4种标准品，溶解，得单一标准品储备液，混合单一标准品储备液，作为混合标准品溶液，备用；
S3.供试品溶液的制备：精密称取步骤S1中的白术粉末，于溶剂中浸泡，提取，离心，过滤，得到供试品溶液；
S4.测定：精密吸取白术内酯Ⅲ标准品溶液与供试品溶液，注入超高液相色谱仪，按一定的色谱条件测定，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的峰值，通过与白术内酯Ⅲ的相对校正因子计算白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的含量。
具体地，本发明所述混合标准品溶液的制备方法如下：精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇溶液，并定容至刻度，配制成浓度分别为0.04-0.85mg/mL、0.04-0.90mg/mL、0.03-0.64mg/mL、0.13-2.73mg/mL的单一标准品储备溶液，精密吸取4种标准品储备溶液，用甲醇稀释，配置成不同浓度的混合对照品溶液，备用。
具体地，本发明所述供试品溶液的制备方法如下：精密称取白术样品2.0g于50mL容量瓶中，加入溶剂浸泡1-6h，超声提取20-60min，离心，取上清液转移至50mL容量瓶中，重复提取2次，合并提取液，加溶剂稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液，备用。
优选地，溶剂选用70％乙醇或70％-100％的甲醇，更优选地，溶剂为100％甲醇。
在本发明中，通过考察70％乙醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇、100％甲醇等不同溶剂对制备得到的白术供试品溶液中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的含量及稳定性的影响，结果显示，与70％乙醇溶剂组相比，90％甲醇和100％甲醇溶剂组制备得到的供试品溶液中苍术酮含量较高；并且，与70％乙醇、70％甲醇、80％甲醇溶剂组制备得到的供试品溶液相比，90％甲醇、100％甲醇溶剂组制备得到的供试品溶液中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮4种成分均保持较好的稳定性。
具体地，本发明所述色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；进样量：1-10μL；紫外检测波长：225-235nm；柱温：20-30℃；流速：0.35-0.45mL/min；流动相：水为流动相A、乙腈为流动相B，其中梯度洗脱过程如下：
t/min A水％ B乙腈％
0-5 20-40 80-60
5-12 40-70 60-30
12-14min 70-90 30-10
14-16min 90-100 10-0
16-20min 100-100 0-0
优选地，所述色谱柱为Waters CORTECS C18色谱柱、Waters ACQUITY UOLC BEHC18色谱柱、Agilent InfinityLabPoroshe Ⅱ 120SB-C18色谱柱，更优选Waters CORTECSC18色谱柱。
优选地，紫外检测波长为230nm。
优选地，检测柱温为25℃。
优选地，检测流速为0.40mL/min。
在本发明中，通过对本发明方法色谱条件及系统适用性的考察，结果显示，检测器波长为225-235nm、柱温为20-30℃，流速为0.35-0.45mL/min时，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的色谱峰分离度无明显差异，综合对比白术内酯Ⅲ与白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮之间的相对校正因子和本发明方法的实用性，优选检测器波长为230nm、柱温为25℃、流速为0.40mL/min。
具体地，本发明白术内酯Ⅲ与白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮之间的相对校正因子计算方法为：精密吸取低浓度混合标准品溶液1μL、2μL、3μL注入超高液相色谱仪；按色谱条件测定，以白术内酯III为内参物，测定白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的峰面积；根据相对校正因子计算公式fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)(其中Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ci为其它成分质量浓度，Ai为其他成分色谱峰面积)计算白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的相对校正因子，分别是1.07、1.56、17.08。其中色谱条件如下：色谱柱：Waters CORTECS C18色谱柱，检测波长：230nm；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱程序：
Figure BDA0003329488490000061
在本发明中，分别考察了不同检测波长、色谱柱、仪器、柱温、流速等对本发明方法相对校正因子的影响，结果显示，检测波长为225～235nm，色谱柱为Waters ACQUITY UOLCBEH C18、Waters CORTECS C18、Agilent InfinityLabPoroshee 120SB-C18，仪器为Agilent1290infinity Ⅱ UPLC、Waters Acquity UPLC，柱温为25-35℃，流速为0.35-0.45mL/min测得的白术内酯III与白术内酯I、白术内酯II、苍术酮之间的相对校正因子间无显著性差异，提示本发明方法所确定白术内酯III与白术内酯I、白术内酯II、苍术酮之间相对的校正因子有较好的耐用性。
在本发明中，对本发明方法的精密度、稳定性、重复性及准确度进行考察，结果显示本发明方法的精密度、稳定性、重复性及准确度良好，提示本发明方法可用于评价白术的质量。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法基于超高效液相色谱技术，结合一测多评法，该方法准确、可靠，适用于白术药材中多成分的含量测定，有利于白术药材及相关制剂的全面质量控制，且本方法检测灵敏度高、稳定性好、成本低、操作简便、易于掌握、便于进一步推广；
(2)本发明以白术内酯III作为内参物，计算白术中白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的相对校正因子，并用校正因子计算白术内酯III、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的含量，白术内酯III廉价容易得到，从而可以大幅度降低检测成本和检测时间，而且方法快速、准确，更全面的控制白术的质量，对大宗药材白术的质量控制和保证其临床疗效具有重大意义；
(3)针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明方法高实用性、节约成本、简便、快捷，可有效检测出白术中白术内酯III、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮四种成分的含量，为建立白术药材的质量评价标准提供依据。
(4)本发明意外发现，采用70％-100％甲醇溶液提取制备白术供试品溶液，得到的白术供试品溶液中苍术酮的含量大大提高，且白术供试品溶液中的白术内酯III、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮4种成分均能保持较好的稳定性。
附图说明
图1为实施例1的超高效液相色谱图，其中，A为混合对照品溶液的超高效液相色谱图；B为白术供试品的超高效液相色谱图；
图2是本发明实施例2中不同溶剂提取对白术供试品溶液中白术内酯III、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮含量的影响；
图3是本发明实施例2中100％甲醇溶剂提取对白术供试品溶液中白术内酯III、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮稳定性的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明中采用的设备有：Agilent 1290infinity Ⅱ UPLC、Waters AcquityUPLC；Waters CORTECS C18色谱柱(2.1×100mm，2.7μm)，Ascentis Express Phenyl-HexylC18(100*4.6mm，2.7μm)色谱柱，Agilent InfinityLab Poroshe Ⅱ orosheeLa18色谱柱(2.1×100mm，2.7μm)；Centrifuge 5430R高速冷冻离心机；KQ52000E型超声波清洗器。
本发明中选用的所有试剂：白术药材(产地为浙江、安徽、河北)，白术内酯Ⅲ(成都普思生物科技股份有限公司，PS010512)、白术内酯Ⅱ(成都普思生物科技股份有限公司，PS010511)、白术内酯Ⅰ(成都普思生物科技股份有限公司，PS010510)、苍术酮(成都普思生物科技股份有限公司，PS011118)，乙腈(色谱纯，默克)，水(自制，为一级水)，甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
实施例1：一测多评法测定白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮含量
(1)材料准备：将白术磨成粉末，过2号筛，备用；
(2)混合标准品溶液的配制：精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为0.849mg/mL、0.898mg/mL、0.637mg/mL、2.73mg/mL的单一标准品溶液，精密吸取上述4种标准品溶液0.5、2、4、6、8、10mL，用甲醇定容至100mL，混合摇匀，作为混合对照品溶液，备用；
(3)供试品溶液的配制：精密称取白术样品2.0069g于50mL容量瓶中，加入10mL甲醇浸泡2h，超声提取30min，离心，取上清液转移至50mL容量瓶中，重复提取2次，合并提取液，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液，备用；
(4)色谱条件：
色谱柱：Waters CORTECS C18色谱柱，检测波长：230nm；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；进样量：1μL；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0003329488490000091
(5)相对校正因子的确定：精密吸取步骤(3)中的低浓度混合标准品溶液1μL、2μL、3μL，在步骤(4)色谱分析条件下，记录色谱峰面积及保留时间，以白术内酯III为内参物，测定白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的峰面积，根据相对校正因子计算公式fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)(其中Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ci为其它成分质量浓度，Ai为其他成分色谱峰面积)计算白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的相对校正因子分别是1.07、1.56、17.08，以白术内酯III相对保留时间为1.00，白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的分别是1.26、1.46、1.96，见表2。
表2待测成分相对保留时间、校正因子
Figure BDA0003329488490000101
(6)样品的含量测定：分别精密吸取白术内酯Ⅲ标准品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高液相色谱仪，在步骤(4)系统适应性的色谱条件下测定，通过步骤(5)中的相对校正因子，根据一测多评法计算公式计算白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的含量，一测多评法计算公式为：
Figure BDA0003329488490000102
其中，w为各待测成分的含量，fsi为各待测成分的相对校正因子，AS为其余待测成分的色谱峰面积，Cr为白术内酯Ⅲ对照品的浓度，V为总体积，Ar为白术内酯Ⅲ的峰面积，m为样品的称样量，结果测得白术样品中白术内酯III、白术内酯II、白术内酯I和苍术酮的含量分别为0.023％、0.020％、0.019％、0.538％，见图1。
实施例2：提取溶剂对白术供试品溶液中白术内酯III、白术内酯II、白术内酯I和苍术酮含量及稳定性的影响
基于实施例1，对本发明供试品溶液的制备方法中提取溶剂对白术供试品溶液中白术内酯III、白术内酯II、白术内酯I和苍术酮含量及稳定性的影响进行研究：
分别将实施例1步骤(3)中的溶剂甲醇改为70％甲醇溶剂组、80％甲醇溶剂组、90％甲醇溶剂组、100％甲醇溶剂组和70％乙醇溶剂组，其它操作方法不变得到70％乙醇溶剂组白术供试品溶液、70％甲醇溶剂组白术供试品溶液、80％甲醇溶剂组白术供试品溶液、90％甲醇溶剂组白术供试品溶液、100％甲醇溶剂组供试品溶液，然后分别采用本发明方法检测放置1、2、3、4、5、6、7天后白术供试品溶液中白术内酯III、白术内酯II、白术内酯I和苍术酮含量，结果显示，与70％乙醇溶剂组相比，70％甲醇溶剂组、80％甲醇溶剂组、90％甲醇溶剂组和100％甲醇溶剂组制备得到的供试品溶液中苍术酮含量较高；与70％乙醇溶剂组、70％甲醇溶剂组、80％甲醇溶剂组、90％甲醇溶剂组制备得到的供试品溶液相比，100％甲醇溶剂组制备得到的供试品溶液中苍术酮的稳定性较好，见图2和图3。
实施例3：一测多评方法学验证
基于实施例1，对本发明方法从以下方面进行方法学验证:
3.1标准曲线的绘制
精密吸取步骤(2)中各浓度的混合标准品溶液，按照步骤(4)中的色谱条件进行分析测定，记录相应的峰面积，以质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的线性关系如表3所示。
表3各组分线性关系
Figure BDA0003329488490000121
3.2精密度试验
分别精密吸取步骤(3)中的供试品溶液，按照步骤(4)中的色谱条件进样，连续进样6次，记录相应的峰面积，计算得各峰的峰面积RSD值，详见表4，结果表明仪器精密度良好。
3.3稳定性试验
精密称取步骤(3)中的供试品溶液1μL，按照步骤(4)中的色谱条件进行分析测定，分别于0、3、6、9、12、24h进样，记录相应的峰面积，计算得各峰的峰面积RSD值，详见表4，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
3.4重复性试验
精密称取白术样品6份，每份约2.0g，按照步骤(3)中的方法制备得到6份供试品溶液，在步骤(4)中的色谱条件下进行分析测定，记录相应的峰面积，计算6份样品中各成分含量的RSD，详见表4，结果表明本发明方法重复性良好。
3.5加样回收试验
精密称取各组份含量已知的白术粉末2.0g，共6份，分别精密加入白术内酯Ⅲ(8.49mg/mL)、白术内酯Ⅱ(8.98mg/mL)、白术内酯Ⅰ(6.37mg/mL)、苍术酮(27.30mg/mL)的混合对照品溶液适量，按照步骤(3)的方法制备供试品溶液，在步骤(4)中的色谱条件下进行分析测定，结果见表4，结果表明本发明方法准确度良好。
表4精密度、重复性、稳定性、准确的考察
Figure BDA0003329488490000131
实施例4：色谱条件及系统适用性的考察
基于实施例1，按照步骤(3)中供试品溶液的制备方法制备供试品，取步骤(2)中配置的系列浓度的混合标准品溶液，进样体积为1μL，分别考察了检测器波长±5nm、流速±0.5mL/min、柱温±5℃等，进行测定时仪器色谱行为变化，比较同一批白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮4个成分的测定含量，并比较其分离度、拖尾因子、理论塔板数：
4.1检测器波长考察
采用DAD全波长扫描对标准溶液，分别测定白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的最大吸收波长，紫外光谱图显示，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ和苍术酮在220nm处有最大吸收波长，白术内酯Ⅰ在276nm处有最大吸收波长。同时比较了225nm、230nm、235nm处4个成分的含量，无明显差异，因此检测波长设定为225-235nm，而对比三者的相对校正因子，优选波长230nm，见表5。
表5不同波长实验结果
Figure BDA0003329488490000132
Figure BDA0003329488490000141
4.2流速考察
考察不同流速(0.35mL·min-1、0.40mL·min-1、0.45mL·min-1)对样品分离度的影响，结果表明，三个流速下分离度无明显差异，因此检测流速设定为0.35～0.45mL·min-1，而对比三者的相对校正因子，优选流速为0.40mL·min-1，见表6。
表6不同流速实验结果
Figure BDA0003329488490000142
Figure BDA0003329488490000151
4.3柱温考察
考察不同柱温(20℃、25℃、30℃)对样品分离的影响，结果表明，三个温度下的分离度无明显差异，均能达到良好的分离效果，因此柱温设定为20-30℃，而对比三者的相对校正因子及方法的实用性，优选25℃，见表7。
表7不同柱温实验结果
Figure BDA0003329488490000152
Figure BDA0003329488490000161
实施例5：相对校正因子的耐用性考察
基于实施例1，分别考察了不同检测波长、色谱柱、仪器、柱温、流速对本发明方法中的相对校正因子的影响：
5.1不同检测波长对相对校正因子的测定
取步骤(3)中的混合标准品溶液，分别考察了225、230、235nm不同检测波长对相对校正因子的影响，以白术内酯Ⅲ色谱峰作为内标峰(S)，分别计算其它各组分的相对校正因子，结果各组分相对校正因子的RSD值均＜2.0％，结果表明不同检测波长测得的相对校正因子并无显著性差异，见表8。
5.2不同色谱柱相对校正因子的测定
采用Waters Acquity型超高效液相色谱仪，分别考察了Waters ACQUITY UOLCBEH C18(色谱柱1)、Waters CORTECS C18(色谱柱2)、Agilent InfinityLabPoroshee120SB-C18(色谱柱3)3根不同色谱柱对各成分相对校正因子的影响，以白术内酯Ⅲ色谱峰作为内标峰(S)，分别计算其它各组分的相对校正因子，结果各组分相对校正因子的RSD值均＜2.0％，结果结果表明不同色谱柱测得的相对校正因子并无显著性差异，见表8。
5.3不同仪器相对校正因子的测定
采用Waters CORTECS C18分别在Agilent 1290infinity1 UPLC、Waters AcquityUPLC两台不同实验仪器上对各成分校对因子的影响，以白术内酯Ⅲ色谱峰作为内标峰(S)，分别计算其它各组分的相对校正因子，结果各组分相对校正因子的RSD值均＜2.0％，结果表明3根不同色谱柱在两台不同仪器上测得的相对校正因子并无显著性差异，见表8。
5.4不同柱温和流速相对校正因子的计算
考察了不同柱温(20、25、30℃)及不同流速(0.35、0.40、0.45mL/min)对相对因子的影响，结果各组分相对校正因子的RSD值均＜2.0％，结果表明在不同柱温及不同流速下测得各组分相对校正因子无显著性差异，见表8。
表8校正因子的耐用性考察
Figure BDA0003329488490000171
Figure BDA0003329488490000181
5.5色谱峰的定位
色谱峰的准确定位是保证QAMS法应用的前提，一般可以采用保留时间差(Δts/i)或相对保留值(ts/i)等参数定位，本方法分别在Agilent 1290infinityⅡ和WatersAcquity两台超高液相色谱仪上及Waters ACQUITY UOLC BEH C18(色谱柱1)、WatersCORTECS C18(色谱柱2)、Agilent InfinityLabPoroshee 120SB-C18(色谱柱3)3种不同规格色谱柱上考察了各待测组分色谱峰的相对保留时间的重现性，结果表明，不同仪器和色谱柱下白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮4种成分的相对保留时间的RSD值均小于2.0％，说明该方法可准确地定位目标峰，因此利用相对保留时间作为白术目标色谱峰定位的方法是可行的，见表9。
表9不同色谱柱及不同仪器测得的相对保留时间
Figure BDA0003329488490000182
实施例6：一测多评法与外标法的比较
基于实施例1，分别将20批白术样品按照步骤(1)制备白术粉末，按照步骤(3)制备供试品溶液，按照步骤(4)中的色谱条件进样分析，采用标准曲线法测定样品中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的含量，再用本发明建立的一测多评法对其进行计算，结果表明相关系数均大于0.99，P值均大于0.05％，说明两者之间无显著性差异，提示本方法用于白术质量评价是可行的，见表10。
表10一测多评法与标准曲线法测定白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的含量比较
Figure BDA0003329488490000191
通过上述检测结果显示，本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本、分析周期短，现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，可以有效检测出白术中白术内酯III、白术内酯II、白术内酯I、苍术酮四种成分的含量，更全面反映白术的质量状况，为建立白术药材的质量评价标准提供依据，同时对大宗药材白术的质量控制和保证其临床疗效具有重大意义。

Claims (10)

1.一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于，该方法采用白术内酯Ⅲ作为内参物进行一测多评，建立白术内酯Ⅲ与白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮之间的相对校正因子，通过相对校正因子计算白术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的含量，具体方法包括以下步骤：
1)材料准备：将供试品白术磨成粉末，过2号筛备用；
2)混合标准品溶液的制备：精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮4种标准品，溶解，得单一标准品储备液，混合单一标准品储备液，即得混合标准品溶液，备用；
3)供试品溶液的制备：精密称取步骤1)中的白术粉末，于溶剂中浸泡，提取，离心，过滤，得到供试品溶液；
4)测定：精密吸取白术内酯Ⅲ标准品溶液与供试品溶液，注入超高液相色谱仪，按一定的色谱条件测定，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的峰值，通过与白术内酯Ⅲ的相对校正因子计算白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的含量。
2.如权利要求1所述的一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于步骤2)中混合标准品溶液的制备，具体包括以下步骤：
a)精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮，分别置于容量瓶中；
b)加适量甲醇溶液溶解，并定容至刻度，配制单一标准品储备溶液，其浓度分别为0.04-0.85mg/mL、0.04-0.90mg/mL、0.03-0.64mg/mL、0.13-2.73mg/mL；
c)精密吸取步骤b)中的4种标准品储备溶液，用甲醇稀释，配置成不同浓度的混合对照品溶液，备用。
3.如权利要求1所述的一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于步骤3)中供试品溶液的制备，具体包括以下步骤：
a)精密称取步骤1)中的白术粉末2.0g置于50mL容量瓶中；
b)加入溶剂浸泡1-6h，得白术浸泡液；
c)将步骤b)的白术浸泡液置于超声波仪中进行超声提取20-60min，离心，取上清液转移置50mL容量瓶中；
d)重复步骤c)两次，合并提取液，并加入甲醇稀释至刻度，摇匀；
e)提取液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
4.如权利要求1所述的一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于步骤4)中，一定的色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱，进样量：1-10μL，紫外检测波长：225-235nm，柱温：20-30℃，流速：0.35-0.45mL/min，流动相：水为流动相A、乙腈为流动相B，其中梯度洗脱过程如下：
t/min A 水％ B 乙腈％ 0-5 20-40 80-60 5-12 40-70 60-30 12-14min 70-90 30-10 14-16min 90-100 10-0 16-20min 100-100 0-0
。
5.如权利要求1所述的一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于，所述白术内酯Ⅲ与白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮之间的相对校正因子是按照如下方法计算得到的：
a)精密吸取权利要求2制备的低浓度混合标准品溶液1μL、2μL、3μL注入超高液相色谱仪；
b)按如下色谱条件测定：色谱柱：Waters CORTECS C18色谱柱，检测波长：230nm；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱程序：
Figure FDA0003329488480000031
c)以白术内酯III为内参物，测定白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的峰面积；
d)根据相对校正因子计算公式fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)计算白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术酮的相对校正因子，其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ci为其它成分质量浓度，Ai为其他成分色谱峰面积。
6.如权利要求1或3所述一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于，所述溶剂为70％-100％的甲醇或70％乙醇。
7.如权利要求4所述一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters CORTECS C18色谱柱、Ascentis Express Phenyl-Hexyl C18色谱柱、AgilentInfinityLabPorosheⅡ 120 SB-C18色谱柱，优选Waters CORTECS C18色谱柱。
8.如权利要求4所述一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于，所述进样量为1μL，紫外检测波长为230nm，柱温为25℃，流速为0.40mL/min。
9.如权利要求1-8任一所述一测多评法评价白术质量的方法，其特征在于，分析样品扩展为白术药材、饮片、炮制品、提取物和相关制剂。
10.如权利要求1所述的一测多评法评价白术质量的方法在检测白术中白术内酯III、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮含量中的应用。
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