CN113881740A - 一种循环制备核苷酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种循环制备核苷酸盐的方法，步骤为：A、将核苷、缩合磷酸盐与水混合进行酶催化反应，得反应液；B、将步骤A反应液调pH值至碱性，降温析出结晶体，得核苷与核苷酸的混合液；C、将步骤B核苷与核苷酸的混合液经过活性炭填充柱，吸附核苷，流出核苷酸溶液，降温结晶，得核苷酸盐；D、用洗脱液将步骤C的活性炭填充柱洗脱得到核苷、核苷酸收集液；E、将步骤D的核苷、核苷酸收集液泵入蒸馏塔，塔顶收集蒸馏出的洗脱液，塔底排出核苷、核苷酸釜底液；F、将步骤E的洗脱液循环到步骤D中，将步骤E的核苷、核苷酸釜底液循环到步骤A中。本发明循环利用核苷和洗脱液，核苷利用率高，核苷酸盐产品收率高、纯度高。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种循环制备核苷酸盐的方法。
背景技术
核苷酸类产品以5'-肌苷酸二钠(IMP)、5'-鸟苷酸二钠(GMP)、5'-呈味核苷酸二钠(I+G)为主，其主要用途是作为食品增鲜剂，用于味精、鸡精、酱油等调味品中以提高鲜度。随着调味品市场需求不断上升，核苷酸的使用量也随之不断增加，市场需求量呈逐年递增态势。
现有的生产方法主要有合成法、发酵法、核酸水解法和生物催化法，生物催化法具有反应条件温和的特点，有较大的应用推广前景。
然而，现有的生物催化制备核苷酸的方法主要存在以下问题：首先，由于生物催化法具有的特性，核苷磷酸化反应存在反应平衡状态，底物核苷反应不完全，根据发明专利CN101265490B公开的报道，反应液核苷利用率低于90％；其次，由于反应液中同时存在核苷和核苷酸，依靠结晶去除未反应完的核苷存在困难，根据发明专利CN111286521A公开报道，核苷酸盐的纯度为94.5～98.1％。
发明内容
针对上述技术缺陷，本发明解决现有制备工艺中反应液核苷利用率低的问题，同时保证所提取的核苷酸品质。本发明提供一种循环制备核苷酸盐的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种循环制备核苷酸盐的方法，包括以下步骤：
A、将核苷、缩合磷酸盐与水混合，搅拌均匀，加入酸性磷酸酶进行酶催化反应，得到反应液；
B、调步骤A的反应液的pH值至碱性，降温析出结晶体，分离磷酸盐，得到核苷与核苷酸的混合液；
C、将步骤B的核苷与核苷酸的混合液经过活性炭填充柱，吸附核苷，流出液为核苷酸溶液，用盐酸中和，加活性炭、保温脱色、降温结晶，得到核苷酸盐；
D、用洗脱液将步骤C的活性炭填充柱洗脱，收集含有少量核苷酸的核苷溶液，得到核苷、核苷酸收集液；
E、将步骤D的核苷、核苷酸收集液泵入蒸馏塔，塔顶收集蒸馏出的洗脱液，塔底排出核苷、核苷酸釜底液；
F、将步骤E的洗脱液循环到上述步骤D的工序中，将步骤E的核苷、核苷酸釜底液循环到上述步骤A的工序中。
所述步骤A中的缩合磷酸盐与核苷的摩尔比为(1.0～6.0):1.0；所述步骤A的酶催化反应pH初始值为4.0～5.5，酶催化初期至反应的前(1/15～2/3)反应时间段内，反应温度为15～30℃，以后反应时间段内，反应温度为30～50℃。在生物化学中，绝大多数酶促反应都是发生在溶液相中的均相反应，这些反应从物理化学本质上看都是可逆反应。当反应体系达到化学平衡后，增加其中一个反应底物的浓度，另一个反应底物的转化率增大。缩合磷酸盐与核苷的反应中，为了提高核苷的转化率，有效的方法是增加缩合磷酸盐的浓度。当核苷浓度一定时，增大缩合磷酸盐与核苷的摩尔比可以增加缩合磷酸盐的浓度。缩合磷酸盐少，核苷转化率低；缩合磷酸盐多，核苷转化率高；但是，过多的缩合磷酸盐会导致原材料投入以及后续分离成本的增加。随着缩合磷酸盐与核苷的摩尔比例升高，反应的转化率增加，但达到一定比例后，转化率不再升高，本发明经过反复试验，得出缩合磷酸盐与核苷的摩尔比为(1.0～6.0):1.0合适。
进一步：在上述循环制备核苷酸盐的方法中，所述步骤A中的缩合磷酸盐与核苷的摩尔比优选为(1.2～5.0):1.0。
所述步骤A中的核苷为肌苷、鸟苷中的一种或者两者的混合物。
所述步骤A中的缩合磷酸盐为酸式焦磷酸钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠中的至少一种。
所述步骤B中的pH值范围为11～11.5。
所述步骤C中活性炭为椰壳颗粒活性炭、煤质颗粒活性炭、果壳颗粒活性炭中的一种。
所述步骤D中的洗脱液为甲醇溶液、乙醇溶液中的一种。
所述甲醇溶液、乙醇溶液的重量百分比浓度为5％～35％。
与现有技术相比，本发明将核苷与核苷酸的混合液经过活性炭填充柱处理，吸附没有反应完全的核苷，收集液核苷酸纯度高，纯净的结晶液利于结晶体析出，降低结晶母液中有效成分的含量，提高核苷酸的质量和收率。
本发明将吸附于活性炭填充柱上的核苷洗脱下来，蒸馏洗脱液，塔底排出核苷、核苷酸釜底液，用于酶催化反应，使得核苷的利用率提高。本发明核苷、核苷酸釜底液含有的少量核苷酸不会影响核苷的转化率，如果不回收核苷、核苷酸釜底液，核苷的利用率约为90％，回收核苷、核苷酸釜底液，投入酶催化反应后，未反应完的核苷得以利用，核苷的利用率大幅度提高到97％以上。
本发明将酶催化反应pH初始值设定为4.0～5.5，后续随着反应进行，磷酸生成，pH值自然降低，核苷的转化率并没有明显影响，为了简化操作，避免反应过程中频繁调节pH值，本发明反应过程中无需为了维持反应液的pH值而添加酸碱。
本发明将酶催化反应初期温度(酶催化初期至反应的前(1/15～2/3)反应时间段内)设定为15～30℃，可以避免因反应初期转化速度过快而导致的反应液粘度高、结团、不易搅拌分散、不利于反应液均匀传质的问题，初期控制反应速度，利于反应传质、传热，利于反应顺利进行，酶催化剩余的反应时间段内，升温至30～50℃利于加快反应速度，且反应完全。反应时间由于底物量、酶活性等而非固定，所以整体反应时间段通常为5～50小时。
本发明将反应液调pH值至11～11.5，降温结晶，主要生成的为磷酸钠，比磷酸氢二钠具有更小的溶解度，利于分离除去磷酸盐。
本发明采用的活性炭填充柱提纯，核苷、核苷酸釜底液循环用于酶催化反应的提纯工艺，有利于质量、收率的提高和成本的降低。即根据核苷酸的特点，本发明对于反应和提纯阶段的浓度、温度及pH值参数进行了有效的调控，既能够有效地去除未反应完的杂质，又能循环利用核苷，提高核苷利用率，另外通过各个阶段的投料配方，吸附提纯等手段控制，进一步提高核苷酸盐品质。本发明用于工业大规模生产核苷酸具有重要的意义。
具体实施方式
本发明的主旨是通过核苷循环制备核苷酸，该方法通过循环利用核苷和洗脱液，具有工艺成本低，核苷利用率高，核苷酸产品纯度高的特点，克服了现有技术存在的核苷利用率低、成本高、产品纯度低的缺点，使核苷利用率和核苷酸质量得到显著提高。
本发明核苷利用率是指：在核苷酸生产中所使用的原料核苷中用于核苷酸化的核苷的摩尔比例。本发明核苷酸收率是指核苷酸反应液提纯后，得到的5'-肌苷酸二钠(IMP)、5'-鸟苷酸二钠(GMP)、5'-呈味核苷酸二钠(I+G)与原料投入反应的肌苷、鸟苷的重量比例。本发明核苷回收率是指：反应液经过活性炭填充柱，洗脱后，塔釜回收的核苷占投入反应的核苷底物的比例。
本发明中所用的酸性磷酸酶为市售品或可以通过公知的发酵法进行制造，例如可以采用发明专利CN103642823B中记载的方法。
下面将通过本发明的实施例进行更加详细的说明。但以下这些实施例只是为了对本发明进行详细的说明而列举的示例，本发明的范围并不只局限于这些实施例。
实施例1
(1)将124.5g肌苷、200g酸式焦磷酸钠与350mL水混合，搅拌均匀，加入380mL从活性炭填充柱洗脱、蒸馏排出的肌苷、肌苷酸釜底液，釜底液中含9.5g肌苷，用盐酸将pH调节为4.5，加入酸性磷酸酶95mL，在26℃反应3小时，再将温度升至32℃反应至肌苷转化率89.5％，反应约25小时，得到含肌苷酸的反应液。
(2)用50％氢氧化钠溶液将上述反应液pH调节为11.2，降温至5℃，冷却析晶，分离磷酸盐，得到肌苷与肌苷酸的混合液。
(3)将肌苷与肌苷酸的混合液流经200mL活性炭填充柱，收集肌苷酸流出部分，用盐酸调节pH为7.0，加热至65～75℃，加入0.5％粉末活性炭，保温30分钟，过滤，滤液降温结晶，10℃分离结晶，干燥得到成品5'-肌苷酸二钠166.8g，检测色谱纯度99.1％，收率124.5％。
(4)用12％乙醇溶液洗脱上述活性炭柱，收集洗脱液，将洗脱液用填料塔蒸馏，塔顶部分回收乙醇溶液，用于工序(4)配置洗脱液，塔底排出肌苷、肌苷酸釜底液，回收肌苷10.5g，肌苷回收率8％，投入后续批次工序(1)反应体系中作为反应底物。工序(1)中的肌苷利用率89.5％，通过(1)～(4)工序，肌苷利用率提升到97.5％。另外，工序(1)中的肌苷转化率并未因此而降低。
实施例2
(1)将131.4g鸟苷、265g焦磷酸钠与950mL水混合，搅拌均匀，加入750mL从活性炭填充柱洗脱、蒸馏排出的鸟苷、鸟苷酸釜底液，釜底液中含10.1g鸟苷，用盐酸将pH调节为4.3，加入酸性磷酸酶135mL，在27℃反应3小时，再将温度升至44℃反应至鸟苷转化率89.8％，反应约27小时，得到含鸟苷酸的反应液。
(2)用50％氢氧化钠溶液将上述反应液pH调节为11.7，降温至3℃，冷却析晶，分离磷酸盐，得到鸟苷与鸟苷酸的混合液。
(3)将鸟苷与鸟苷酸的混合液流经200mL活性炭填充柱，收集鸟苷酸流出部分，用盐酸调节pH为7.2，加热至65～75℃，加入0.7％粉末活性炭，保温30分钟，过滤，滤液加入500mL90％浓度乙醇溶液，降温结晶，10℃分离结晶，干燥得到成品5'-鸟苷酸二钠172.8g，检测色谱纯度99.3％，收率122.1％。
(4)用25％甲醇溶液洗脱上述活性炭柱，收集洗脱液，将洗脱液用填料塔蒸馏，塔顶部分回收甲醇溶液，用于工序(4)配置洗脱液，塔底排出鸟苷、鸟苷酸釜底液，回收鸟苷10.6g，鸟苷回收率7.5％，投入后续批次工序(1)反应体系中作为反应底物。工序(1)中的鸟苷利用率89.8％，通过(1)～(4)工序，鸟苷利用率提升到97.3％。另外，工序(1)中的鸟苷转化率并未因此而降低。
实施例3
(1)将61肌苷、64.4g鸟苷、155g酸式焦磷酸钠和55g三聚磷酸钠与770mL水混合，搅拌均匀，加入730mL从活性炭填充柱洗脱、蒸馏排出的肌苷、肌苷酸、鸟苷、鸟苷酸釜底液，釜底液中含6肌苷、5.6g鸟苷，用盐酸将pH调节为4.6，加入酸性磷酸酶155mL，在28℃反应3小时，再将温度升至35℃反应至肌苷、鸟苷转化率90.2％，反应约30小时，得到含肌苷酸、鸟苷酸的反应液。
(2)用50％氢氧化钠溶液将上述反应液pH调节为11.5，降温至2℃，冷却析晶，分离磷酸盐，得到肌苷与肌苷酸、鸟苷与鸟苷酸的混合液。
(3)将肌苷与肌苷酸、鸟苷与鸟苷酸的混合液流经200mL活性炭填充柱，收集肌苷酸、鸟苷酸流出部分，用盐酸调节pH为7.1，加热至65～75℃，加入0.6％粉末活性炭，保温30分钟，过滤，滤液加入500mL90％浓度乙醇溶液，降温结晶，10℃分离结晶，干燥得到成品5'-呈味核苷酸二钠169.3g，检测色谱纯度99.5％，收率123.6％。
(4)用20％乙醇溶液洗脱上述活性炭柱，收集洗脱液，将洗脱液用填料塔蒸馏，塔顶部分回收乙醇溶液，用于工序(4)配置洗脱液，塔底排出肌苷、肌苷酸、鸟苷、鸟苷酸釜底液，回收5.3肌苷、4.8g鸟苷，肌苷、鸟苷回收率7.4％，投入后续批次工序(1)反应体系中作为反应底物。工序(1)中的肌苷、鸟苷利用率90.2％，通过(1)～(4)工序，肌苷、鸟苷利用率提升到97.6％。另外，工序(1)中的肌苷、鸟苷转化率并未因此而降低。
上述实施例1～3采用高效液相色谱法检测5'-肌苷酸二钠、5'-鸟苷酸二钠或5'-呈味核苷酸二钠的色谱纯度。具体方法如下：
流动相：称取5.0g磷酸二氢钾，置于1000mL烧杯中，加入1000mL超纯水，在磁力搅拌器上搅拌至磷酸二氢钾完全溶解，过滤，待用。
色谱柱：BDS-C18(5um,4.6×250mm)
柱温：35℃
流速：1.2mL/min
检测器：紫外检测器，(λ＝254mm)
进样量：2uL
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将核苷、缩合磷酸盐与水混合，搅拌均匀，加入酸性磷酸酶进行酶催化反应，得到反应液；
B、调步骤A的反应液的pH值至碱性，降温析出结晶体，分离磷酸盐，得到核苷与核苷酸的混合液；
C、将步骤B的核苷与核苷酸的混合液经过活性炭填充柱，吸附核苷，流出液为核苷酸溶液，用盐酸中和，加活性炭、保温脱色、降温结晶，得到核苷酸盐；
D、用洗脱液将步骤C的活性炭填充柱洗脱，收集含有核苷酸的核苷溶液，得到核苷、核苷酸收集液；
E、将步骤D的核苷、核苷酸收集液泵入蒸馏塔，塔顶收集蒸馏出的洗脱液，塔底排出核苷、核苷酸釜底液；
F、将步骤E的洗脱液循环到上述步骤D的工序中，将步骤E的核苷、核苷酸釜底液循环到上述步骤A的工序中；
所述步骤A中的缩合磷酸盐与核苷的摩尔比为(1.0～6.0):1.0；所述步骤A的酶催化反应pH初始值为4.0～5.5，酶催化初期至反应的前(1/15～2/3)反应时间段内，反应温度为15～30℃，以后反应时间段内，反应温度为30～50℃。
2.根据权利要求1所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述步骤A中的缩合磷酸盐与核苷的摩尔比为(1.2～5.0):1.0。
3.根据权利要求1所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述步骤A中的核苷为肌苷、鸟苷中的一种或者两者的混合物。
4.根据权利要求1所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述步骤A中的缩合磷酸盐为酸式焦磷酸钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠中的至少一种。
5.根据权利要求1所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述步骤B中的pH值范围为11～11.5。
6.根据权利要求1所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述步骤C中活性炭为椰壳颗粒活性炭、煤质颗粒活性炭、果壳颗粒活性炭中的一种。
7.根据权利要求1所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述步骤D中的洗脱液为甲醇溶液、乙醇溶液中的一种。
8.根据权利要求7所述循环制备核苷酸盐的方法，其特征在于：所述甲醇溶液、乙醇溶液的重量百分比浓度为5％～35％。
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