CN113881662A

CN113881662A - 一种通过5’端丙烯酰胺化的pcr产物在固相介质中制备单链dna的方法

Info

Publication number: CN113881662A
Application number: CN202111058376.4A
Authority: CN
Inventors: 田庆常; 王淑玲; 程慧娟; 杨倩
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2022-01-04

Abstract

本发明一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法，属于分子生物学领域。制备过程：（1）通过PCR反应扩增出大量5’端丙烯酰胺化的目的片段；（2）制备聚丙烯酰胺凝胶固相分离介质；（3）高剪切乳化分散机高速匀质将固相介质分散成细小颗粒；（4）DNA双链高温解螺旋，分离固/液相获得DNA单链，即得产物。该方法将5’丙烯酰胺化的PCR产物与聚丙烯酰胺凝胶聚合，将此DNA双链束缚在固相凝胶介质中，通过高温DNA双链解螺旋，5’‑丙烯酰胺化的DNA链被束缚在聚丙烯酰胺凝胶中，另一条单链扩散在上清中。运用本发明制备的单链DNA可用于探针制备和标记、固相DNA测序、肿瘤微环境等领域。

Description

一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链 DNA的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法。

背景技术

DNA在生物成像，仿生技术和合成生物学中的众多应用中起着重要作用。这些应用中的许多依赖于单链DNA的可用性。取决于所需的大小，规模和纯度，单链DNA的生产可能变得非常昂贵或繁重。大部分DNA以双螺旋结构存在，但一经热或碱处理就会变为单链状态。单链DNA在分子流体力学性质、吸收光谱、碱基反应性质等方面都和双链DNA不同。许多应用领域要求使用单链DNA模板。获得的单链DNA 模板用于多方面的下游应用，例如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，焦磷酸测序技术和SNP分析以及单链构象多态性，固相DNA测序，DNA芯片和微阵列，等位基因特异性延伸和引物延伸。单链DNA模板还可用于体外诱变、核酸酶S1定位、探针制备和标记、差减杂交及其他多种分子技术。常用解开双链的方法分为化学法和物理法。化学法如T7逆转录法、核酸外切酶法、变性高效液相色谱法、磁珠捕获法等，但因需严格控制RNA酶的污染、单链得率依赖于外切酶的活性、需要昂贵的仪器而难以普及、使用的包被磁珠较为昂贵等方面而受到限制。另一方面虽然已开发芯片技术为大规模合成单链DNA提供了相对简单便捷的方法，但是，大多受到合成单链DNA种类或实验条件等方面的限制而无法推广成为一种实验室常规方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于克服现有技术中仪器昂贵、操作复杂、试剂不易获得等方面的限制，而提供一种通过 5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法。该制备方法能够在常规实验室以简单、有效、便捷的方式获得单链DNA。

本发明通过以下技术方案加以实现：

(1)通过PCR反应扩增出大量5’端丙烯酰胺化的目的片段

按照下表在0.2mLPCR管中制备对照组和实验组的反应体系：

将上述制备的反应体系在PCR仪上执行以下程序：

(2)制备聚丙烯酰胺凝胶固相分离介质，并用TE缓冲液或其他缓冲液洗涤数次以去除多余的引物、核酸和缓冲液组分及制胶过程中残留的有机溶剂；

试剂	终体系
		10×TBE	1×TBE
30％Acr-Bis(29∶1)	7.5％<u>Acr-Bis</u>
		10％过硫酸铵	1.25％
四甲基乙二胺	2％
		PCR反应液	5<u>uM</u>
水	补至400<u>ul</u>

制备适当体积的非变性聚丙烯酰胺凝胶，这个体系包括10×TBE 缓冲液、10％过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)、30％Acr-Bis、5’端修饰丙烯酰胺的引物进行的PCR扩增反应液，以保证PCR反应液中的丙烯酰胺单体与甲叉双丙烯酰胺充分交联，形成凝胶固相介质。

制备聚丙烯酰胺凝胶固相介质的方法为较佳浓度体系，其加入顺序依次为10×TBE缓冲液、30％Acr-Bis、5’端修饰丙烯酰胺的引物、 TEMED、10％过硫酸铵，加水补充至适当体系。

(3)高剪切乳化分散机高速匀质将固相介质分散成细小颗粒，用 TE缓冲液或其他缓冲液洗涤数次以去除残留的有机溶剂、模板核酸分子、2×Taq plus MasterMix、非固相引物等；

(4)加热磁力搅拌器下，DNA双链高温变性、解螺旋，分离固/ 液相获得DNA单链，即得产物。

进一步地，将5’-丙烯酰胺化的PCR产物与聚丙烯酰胺凝胶交联，将此双链DNA束缚在固相凝胶介质中。通过高温80-100℃DNA 双链变性、解螺旋，5'-丙烯酰胺化的DNA单链被束缚在聚丙烯酰胺凝胶中，另一条单链DNA则扩散在上清中。

进一步地，在模板的扩增反应中5’端丙烯酰胺化的引物作为固相引物，在DNA聚合酶的作用下延伸，扩增反应25-40个循环，此循环包括加热变性、退火、在2×Taq plusMasterMix与DNA聚合酶的作用下寡核苷酸引物延伸。

进一步地，DNA产物为以5’端修饰丙烯酰胺的引物进行的PCR 扩增，所得反应液；目的条带互补链的引物序列为5’Acrydite-引物序列-3’，而目的条带的引物序列为正常序列；制备模板为双链DNA， 2×Taq plus MasterMix与DNA聚合酶作用下，模板、特异修饰的引物即可完成反应，不需要别的再生体系

进一步地，将PCR反应液与聚丙烯酰胺凝胶聚合过程中，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺(Acr-Bis)交联形成带有线性聚丙烯酰胺-共丙烯酰胺标记的聚合物。

进一步地，将DNA双链束缚在固相凝胶介质中，通过80-100℃加热、磁力搅拌使DNA双链变性、解螺旋，5’-丙烯酰胺化的DNA单链被束缚在聚丙烯酰胺凝胶中(沉淀)，另一条单链DNA则游离出来扩散在上清中；固相/液相的分离，在80-100℃高温下取上清，利用高压真空浓缩仪可得更高浓度的产物；加热30min以上后，停止磁力搅拌，在高温状态下静置一段时间，可肉眼观察到凝胶絮状物沉在底部，则用移液枪轻轻吸取适量上清，即得目标产物。

本发明所述的引物序列如下：

R引物—5’Acrydite-引物序列-3’；

F引物—5’引物序列-3’；

步骤(4)中所得产物的验证与表征包括以下：

紫外分光光度计测单双链DNA特异波长处的吸光度差异，因单链 DNA碱基暴露较双链DNA多，G\C双键在A260处的吸光度较大。

超微量核酸蛋白检测仪测其含量，A260是核酸的最大吸收波长， A280为蛋白质的最大吸收波长，两者的比值反映样品的纯度，纯净的DNA样品A260/A280大于1.8。

8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证实验，因双链DNA电荷密度更大，拓扑结构更加紧密，且共价闭合的DNA其空间位阻较小，而开环 DNA空间位阻较大，故在电泳图中双链DNA较单链DNA跑的快。

本发明具有明显优于现有技术的特点，其积极进步效果在于：

(1)降低成本，避免了繁杂的操作过程：本发明利用常规的引物合成特异目的片段与聚丙烯酰胺凝胶聚合，分散成细小颗粒，洗涤，利用物理条件加热变性解螺旋即得；

(2)新颖性：本发明以常规实验PCR反应、聚丙烯酰胺凝胶为基础，建立了体外加热解开双链的方法，不需其他特异性剪切酶、限制性内切酶等试剂；

(3)简便、易得：本发明所用试剂为常规实验室所具备的PCR反应体系、配置聚丙烯酰胺凝胶的试剂，无其他特殊；目的产物的获得仅通过物理条件加热即可，无需复杂的化学过程。

附图说明

图1为单链DNA的制备方法流程示意图。其中(a)为5'-丙烯酰胺化引物的PCR反应；(b)为聚丙烯酰胺凝胶的形成与目的产物的分离；

图2为5’-丙烯酰胺化引物与未修饰的引物经PCR反应后与聚丙烯酰胺凝胶聚合对照图；

图3为紫外分光光度计测DNA在A260处的吸光度；

图4为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳图；

图5为核酸染料法对单链DNA表征图；

其中M表示marker，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图中marker为双链 marker，相同长度的ssDNA和dsDNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中ssDNA 的迁移速率较慢。F-Acr 1表示GoldViewⅠ型核酸染料对丙烯酰胺化单链DNA进行染色；F-Acr2表示GoldViewⅡ型核酸染料对丙烯酰胺化单链DNA进行染色。

具体实施方式

下面结合说明书附图，通过实例进一步说明本发明。但不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。下面实例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明基于现有技术中存在的局限和单链DNA广泛的应用，提出了一种在体外快速以简单、有效、便捷的方式获得单链DNA的新型研究方法，获得的这种单链DNA长度在400nt左右。本发明首先用5' 丙烯酸酯修饰的引物与DNA模板进行PCR扩增，后将PCR扩增产物与丙烯酰胺、10％过硫酸铵、四甲基乙二胺等共聚，形成了带有线性聚丙烯酰胺-共丙烯酸标记的聚合物，对此共聚物进行高速匀质破碎，于94℃高温下进行热变性，5'-丙烯酸酯修饰的合成链被束缚在聚丙烯酰胺凝胶中(沉淀)，另一条链则分散在溶液中，通过离心或是静置一段时间后取上清液，利用高压真空浓缩仪可得更高浓度的产物，其制备流程图如图1所示，该方法所需试剂简单易得，操作环境简单，不需复杂、昂贵的仪器，且用时较短，产率较高

实施例1：制备5’端丙烯酰胺化的单链DNA并对其进行表征。

GTTTCAATTCGTACAATGCCTGGCATGTTCATTCGAATATAAGGCCGCCGCCTTCCA GTCAGGGTAGCCAAAAGTATAATCCCGGGTGGAAACTAAACTAAAAACCGTACTCAC AACTTTCCGCGGACGCTAACAGACAAATAGACACACTATCAGGTCAGGAACTGCCGT CACATACGACACTGCCCCTCACGTAAGGGCCACCGACCATGTGGGCAAATTCGTAAT AAATTCGGGGTGAGGGGGATTCAAGACAAGCAACCTTGTTAGTCAGCTCAAACAGCG ATTTAACGGTTGAGTAACACATCAAAACACCGTTCGAGGTCAAGCCTGGCGTGTTTA ACAAGTTCTTGATATCATATATAAATGTAATAAGAAGTTTGGTAATATTCAATTCGA AG(SEQ ID No.1所示)

R引物：5’Acrydite-CTTCGAATTGAATACCAAACTT-3’(SEQ ID No.2所示)

F引物：5’-GTTTCAATTCGTACAATGCCTGGCATG-3’(SEQ ID No.3所示)。通过5’端丙烯酰胺化引物扩增出对应的双链DNA，过程如图1(a) 所示。

按照下表在0.2 mLPCR管中制备对照组和实验组的反应体系：

	50uL反应体系	终浓度
			2×MasterMix	25uL	1×
10uM5’Acrydite-R引物	2uL	0.4uM
			10uM F引物	2uL	0.4uM
模板	2uL	25ng
			水	19uL

将上述制备的反应体系在PCR仪上执行以下程序：

按照下表制备凝胶聚合反应体系：

试剂	体积(<u>uL</u>)
		10×TBE	40
30％Acr-Bis(29∶1)	100
		10％过硫酸铵	3.2
四甲基乙二胺	0.4
		PCR反应液	200
水	56.4

反应结果

如图2，对照组和实验组分别加入核酸染料，在凝胶成像仪下可以观察到以5’Acrydite-R引物扩增的目的片段牢牢嵌入到聚丙烯酰胺凝胶中，而未修饰的引物扩增的反应液在凝胶中未观察到荧光。

将凝胶破碎成絮状物，94℃加热30min，高温下静置取上清，测其吸光度与含量。

如图3，紫外分光光度计检测ssDNA和dsDNA在A260处的吸光度差异，结果显示，ssDNA在A260处的吸光度较dsDNA大，差异具有统计学意义(P＜0.0001)，符合目标产物的预期结果。

如表1，超微量核酸蛋白检测仪检测ssDNA的含量与纯度，结果显示， ssDNA在A260/A280比值较dsDNA大，符合预期结果。

表1

如图4，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳(100V电压，1h) 验证目标产物与dsDNA，结果显示，ssDNA相对于dsDNA的位置靠前，即其迁移速率相对dsDNA较慢，电泳图中也无其他明显的条带，符合预期。

实施例2：丙烯酰胺修饰F引物制备单链DNA。

R引物：5’-CTTCGAATTGAATACCAAACTT-3’

F引物：5’Acrydite-GTTTCAATTCGTACAATGCCTGGCATG-3’

按照下表在0.2 mLPCR管中制备对照组和实验组的反应体系：

	20uL反应体系	终浓度
			2×T5 Super PCR Mix(PAGE)	10uL	1×
10uM R引物	1uL	0.5uM
			10uM5’Acrydite-F引物	1uL	0.5uM
模板	1uL	1ug
			水	7uL

将上述制备的反应体系在PCR仪上执行以下程序：

按照下表制备凝胶聚合反应体系：

试剂	体积(<u>uL</u>)
		10×TBE	80
30％Acr-Bis(29∶1)	200
		10％过硫酸铵	6.4
四甲基乙二胺	0.8
		PCR反应液	400
水	112.8

将凝胶破碎成絮状物，94℃加热30min，高温静置取上清，核酸染料法进行表征。

反应结果

通过对制备的单链与加热前的PCR反应液加GoldViewⅠ型(针对双链DNA)、Ⅱ型(针对单链DNA)核酸染料进行表征，可以发现，加热前的PCR反应物与GoldViewⅠ型核酸染料混合后进行电泳观察到有明亮条带；单链DNA与GoldViewⅠ型核酸染料混合后进行电泳观察没有条带，而与GoldViewⅡ型核酸染料混合后电泳可观察到条带，说明通过以上方法制得的是单链DNA。

如图5，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳(100V电压，1h) 验证目标产物与dsDNA，结果显示，GoldViewⅠ型核酸染料无法使 ssDNA显色，GoldViewⅡ型核酸染料使ssDNA显色，符合预期。以上所述的实例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以作出其他不同形式的变化或变动。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> 模板(template)

<400> 1

gtttcaattc gtacaatgcc tggcatgttc attcgaatat aaggccgccg ccttccagtc 60

agggtagcca aaagtataat cccgggtgga aactaaacta aaaaccgtac tcacaacttt 120

ccgcggacgc taacagacaa atagacacac tatcaggtca ggaactgccg tcacatacga 180

cactgcccct cacgtaaggg ccaccgacca tgtgggcaaa ttcgtaataa attcggggtg 240

agggggattc aagacaagca accttgttag tcagctcaaa cagcgattta acggttgagt 300

aacacatcaa aacaccgttc gaggtcaagc ctggcgtgtt taacaagttc ttgatatcat 360

atataaatgt aataagaagt ttggtaatat tcaattcgaa g 401

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 2

cttcgaattg aataccaaac tt 22

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

gtttcaattc gtacaatgcc tggcatg 27

Claims

1.一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）制备PCR反应体系并通过PCR反应扩增出大量5’端丙烯酰胺化的目的片段，取模板，在模板的扩增反应中以5’端丙烯酰胺化的引物作为固相引物，在DNA聚合酶的作用下延伸，将反应体系进行PCR扩增；

2）将步骤1）制得的PCR反应液进行制胶处理，制备聚丙烯酰胺凝胶固相分离介质，并用TE缓冲液洗涤数次以去除多余的引物、核酸和缓冲液组分及制胶过程中残留的有机溶剂；

3）将步骤2）制得的凝胶加入缓冲液后于高剪切乳化分散机高速匀质将固相介质分散成细小颗粒，缓冲液洗涤数次以去除残留的有机溶剂、模板核酸分子、2×Taq plusMasterMix、非固相引物，制得悬乳液；

4）将步骤3）制得的悬乳液于加热磁力搅拌器下，DNA双链高温变性、解螺旋，分离固/液相获得DNA单链，即得产单链DNA产物。

2.如权利要求1所述的一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法，其特征在于步骤1）中PCR反应体系包括：2× Taq plusMasterMix 终浓度1×；10uM5’的 R引物，终浓度0.2-1.0uM；10 uM F引物，终浓度0.2-1.0uM；模板，终浓度为1-50 ng的质粒及10 ng-1 ug的基因组；ddH₂O补充至50 uL。

3.如权利要求1所述的一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法，其特征在于步骤1）中PCR反应程序为：预变性：94℃，5min，循环数1；变性：94℃，30s；退火：Tm-5℃，30s；延伸：72℃，1 kb/min；变性、退火及延伸的循环数25-40；最后延伸，72℃，循环数1。

4.如权利要求1所述的一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法，其特征在于步骤2）胺凝胶固相分离介质体系包括10×TBE缓冲液、10%过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、30%Acr-Bis、5’端修饰丙烯酰胺的引物进行的PCR扩增反应液，以保证PCR反应液中的丙烯酰胺单体与甲叉双丙烯酰胺充分交联，形成凝胶固相介质。

5.如权利要求1所述的一种通过5’端丙烯酰胺化的PCR产物在固相介质中制备单链DNA的方法，其特征在于步骤4）反应条件为：80-100℃加热且磁力搅拌至少30 min，在80-100℃的温度条件下分离固/液相获得DNA单链，利用高压真空浓缩仪浓缩2 h以上可得更高浓度的产物。