CN113881585A - 酵母的工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种酵母的工程菌株及其构建方法、应用，属于生物工程技术领域。所述工程菌株为通过产β‑胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC和基因载体形成的工程菌株ULHpDA*20，所述基因载体包括pYLXP'2载体和prDNALoxp载体。所述虾青素包括3S‑3S’‑虾青素。工程菌株ULHpDA*20的保藏编号为CCTCC NO：M 20211046，工程菌株ULHpDA*20的菌种名称为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。本公开通过该酵母的工程菌株能够高效获得3S‑3S’‑虾青素。

Description

酵母的工程菌株及其构建方法和应用
技术领域
本公开属于生物工程技术领域，特别涉及一种酵母的工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
虾青素(astaxanthin)化学名称为3,3'-二羟基-4,4'－二酮基-β,β'-胡萝卜素，为萜烯类不饱和化合物，是叶黄素的一种，同时也是一种酮式次生类胡萝卜素(Carotenoids)，分子式为C40H52O4。虾青素是自然界中抗氧化活性最强的类胡萝卜素之一，已经被广泛的应用于食品、药品、保健品、化妆品和饲料等领域，具有极高的经济与应用价值。由于天然虾青素的来源少，一般需要人工合成获取大量的虾青素。但化学合成的虾青素为三种构型的混合物，生物活性差且利用度不高，同时化学合成虾青素过程复杂，合成过程中不可避免地会引入其他杂质，生物安全性受到质疑。所以，化学合成的虾青素仅应用于进行水产养殖，被禁止用于食品、化妆品和药品研究等领域。而生物合成的3S-3S’-虾青素被允许使用于食品、化妆品和医药领域，因此生物合成3S-3S’-虾青素备受关注。
相关技术中，天然3S-3S’-虾青素主要基于雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)和副球菌(Paracoccus sp.)合成，但是同时也存在细胞密度低、产量较低、生产成本高和基因操作改造困难等缺点，阻碍了天然3S-3S’-虾青素的大规模应用，因此亟需开发具有食用安全性的工程菌株来进行虾青素的高效生物合成。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是应用较为广泛的一类模式非常规产油酵母，被美国FDA认证为GRAS(generally recognized as safe)菌株。该菌株遗传背景清楚，近些年来也相应开发了较为完善的遗传代谢改造工具。同时相对于常规的工程底盘菌株，解脂耶氏酵母自身拥有高效的乙酰辅酶A的合成通路和高通量的三羧酸循环，能够积累超过90％的脂类物质且不产生内毒素，是理想的积累虾青素等脂类衍生物的工业宿主菌株；与此同时，解脂耶氏酵母能够适应较低的pH和较高渗透压的环境，还可以利用多种碳源进行生存，对生长环境要求较低。
发明内容
本公开实施例提供了一种酵母的工程菌株，可以通过工程菌株发酵高效的获得虾青素。所述技术方案如下：
本公开实施例提供了一种酵母的工程菌株，用于产虾青素，所述工程菌株为通过产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC和基因载体形成的工程菌株 ULHpDA*20，所述基因载体包括pYLXP'2载体和prDNALoxp载体，所述虾青素包括3S-3S’-虾青素。
在本公开的又一种实现方式中，所述工程菌株ULHpDA*20的保藏编号为 CCTCCNO：M 20211046，所述工程菌株ULHpDA*20的菌种名称为解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
在本公开的又一种实现方式中，所述基因载体包括在所述工程菌株YlBC发挥作用的强启动子TEF和终止子XPR2。
在本公开的又一种实现方式中，本公开还提供一种酵母的工程菌株的构建方法，所述构建方法包括：
基于基因载体，构建虾青素的多拷贝的表达载体；
将产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC进行活化处理；
将活化处理后的所述工程菌株YlBC和所述多拷贝的表达载体转化后培养，得到转化子；
将所述转化子进行发酵培养，筛选得到所述工程菌株ULHpDA*20。
在本公开的又一种实现方式中，所述基于基因载体，构建虾青素的多拷贝的表达载体，包括：
基于所述pYLXP'2载体，构建虾青素的单拷贝pYLXP'2载体；
对所述单拷贝pYLXP’2载体进行双酶切，得到pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体和HpcrtW-RIDD基因表达模块；
将所述pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体和所述HpcrtW-RIDD基因表达模块进行酶连接处理，得到中间载体pYLXP'2::HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD；
对所述中间载体pYLXP'2::HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD进行多次双酶切和酶连接，得到多拷贝的中间载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*n；
对所述多拷贝的中间载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*n进行双酶切，得到HpcrtZ-RIAD::HpcrtW-RIDD基因多拷贝表达模块；
基于所述prDNALoxp载体，得到prDNALoxp线性化载体；
将所述prDNALoxp线性化载体和所述HpcrtZ-RIAD::HpcrtW-RIDD基因多拷贝表达模块进行酶连接处理，得到所述虾青素的多拷贝的表达载体。
在本公开的又一种实现方式中，所述基于所述pYLXP'2载体，构建虾青素的单拷贝pYLXP’2载体，包括：
将所述pYLXP'2载体进行双酶切，得到具有粘性末端的pYLXP'2线性化载体；
通过凝胶回收试验盒对所述pYLXP'2线性化载体进行片段回收，得到 pYLXP'2载体片段；
将所述pYLXP'2载体片段和目的基因片段组装，得到所述虾青素的单拷贝 pYLXP’2载体。
在本公开的又一种实现方式中，所述将活化处理后的所述工程菌株YlBC和所述多拷贝的表达载体转化后培养，得到转化子，包括：
将所述活化处理后的所述工程菌株YlBC的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到待转化解脂耶氏酵母的YlBC底盘菌株；
将所述YlBC底盘菌株与所述多拷贝的表达载体转化后培养，得到转化子。
在本公开的又一种实现方式中，所述将所述转化子进行发酵培养，筛选得到所述工程菌株ULHpDA*20，包括：
从所述转化子中，选择发酵产生虾青素含量最高的所述转化子作为所述工程菌株ULHpDA*20。
在本公开的又一种实现方式中，本公开还提供一种工程菌株的应用，所述工程菌株应用在虾青素的制备中。
在本公开的又一种实现方式中，本公开还提供一种虾青素的提取方法，所述提取方法基于以上所述的工程菌株或者以上所述构建方法所构建的工程菌株实现，所述提取方法包括：
将工程菌株ULHpDA*20投入培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、漩涡震荡、过滤，得到虾青素提取液；
将所述虾青素提取液进行高效液相色谱检测分离，得到虾青素。
本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
通过本公开实施例提供的酵母的工程菌株进行生物合成3S-3S’-虾青素时，由于能够通过该工程菌株进行发酵同步积累生物量和虾青素，所以，能够显著提高3S-3S’-虾青素的合成效率。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本公开实施例提供的酵母的工程菌株的构建方法的流程图；
图2是本公开实施例提供的虾青素的提取方法的流程图。
保藏信息说明
保藏日期：2021.8.18；
保藏号：CCTCC NO：M 20211046；
株号：ULHpDA*20；
菌种名称：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。
本公开实施例提供了一种酵母的工程菌株，工程菌株为通过产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC和基因载体形成的工程菌株ULHpDA*20，基因载体为pYLXP'2载体和prDNALoxp载体。
通过本公开实施例提供的酵母的工程菌株进行生物合成3S-3S’-虾青素时，由于能够通过该工程菌株进行发酵同步积累生物量和虾青素，显著提高3S-3S’- 虾青素的合成效率。
另外，由于该工程菌株通过产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC为原始出发菌，所以可以通过解脂耶氏酵母自身高效的乙酰辅酶A的合成通路和高通量的三羧酸循环，来使得酵母的工程菌株能够提供充足的虾青素合成前体物且不产生内毒素。与此同时，解脂耶氏酵母能够适应较低的pH和较高渗透压的环境，还可以利用多种碳源发酵，对生长环境要求较低，这样可以大大降低酵母的工程菌株的培养环境控制成本，以便进一步降低3S-3S’-虾青素生物合成的成本。
可选地，基因载体包括在工程菌株YlBC发挥作用的强启动子TEF和终止子XPR2。
其中强启动子TEF的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。终止子XPR2的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
另外，pYLXP'2载体和prDNALoxp载体分别含有一段在解脂耶氏酵母中用于筛选的ura3标签，pYLXP'2载体中的ura3标签的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
由于pYLXP'2载体和prDNALoxp载体中分别含有ura3标签，当pYLXP'2 载体与目的基因片段结合在一起时，相当于是在目的基因片段中进行标记。这样ura3标签会随着目的基因片段一起进入到产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC中，以便通过ura3标签来筛选产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株 YlBC是否成功转化为工程菌株ULHpDA*20。
pYLXP'2载体和prDNALoxp载体均为现有工程菌株常用的pYLXP'2载体和prDNALoxp，具体序列不在赘述。
可选地，工程菌株ULHpDA*20的保藏编号为CCTCC NO：M 20211046，工程菌株ULHpDA*20的菌种名称为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，具体保藏信息可见前文保藏信息说明。
本公开实施例还提供了一种酵母的工程菌株的构建方法，如图1所示，构建方法包括：
S101：基于基因载体构建虾青素的多拷贝的表达载体，基因载体为pYLXP'2 载体和prDNALoxp载体。
多拷贝的表达载体是指具有多个相同的基因序列的表达载体。以上所说的相同的基因序列为目的基因片段。
步骤S101通过以下方式实现：
1011：基于pYLXP'2载体，构建虾青素合成关键酶基因的单拷贝pYLXP’2 载体。
步骤1011包括：
(1)获得pYLXP'2载体和prDNALoxp载体。
pYLXP'2载体和prDNALoxp载体均产自中国农业科学院油料作物研究所应用微生物课题组实验室。
pYLXP'2载体含有一段在解脂耶氏酵母中用于筛选的ura3标签。 prDNALoxp载体含有一段在解脂耶氏酵母中用于筛选的ura3标签且同时具有能够将基因模块整合进入染色体的26S rDNA，二者都含有在解脂耶氏酵母中发挥作用的强启动子TEF和终止子XPR2。
(2)将pYLXP'2载体和prDNALoxp载体分别进行双酶切，得到具有粘性末端的pYLXP'2线性化载体和prDNALoxp线性化载体。
pYLXP'2载体和prDNALoxp载体在理论上为环形质粒。
双酶切为用两个限制性内切酶进行切割，这样环状质粒就产生了两个缺口。也就是，环状质粒变成两段线状DNA了。回收需要的那一段，因为需要的线状 DNA的两端具有与目的基因片段互补的黏性末端，这样，在连接酶的作用下，目的基因片段便可以与需要的那一段线状DNA连接在一起。
本实施例中，pYLXP'2载体使用KpnⅠ(内切酶1)-SnaBⅠ(内切酶2) 双酶切。prDNALoxp载体使用NheⅠ(内切酶1)-SalⅠ(内切酶2)双酶切。
相关反应体系参照表1(双酶切反应体系)，其中，反应条件为：37℃，60min。
表1：双酶切反应体系
Figure RE-GDA0003400159750000061
当酶切反应结束后，使用凝胶电泳确定酶切是否成功。
(3)通过凝胶回收试验盒对线性化载体(pYLXP'2线性化载体和 prDNALoxp线性化载体)进行片段回收，得到载体片段。载体片段包括pYLXP'2 载体片段和prDNALoxp载体片段。
步骤(3)包括：
(3.1)凝胶电泳结束后，在紫外灯下用干净的刀片迅速切下所需回收的 DNA条带，并用吸水纸吸尽表面液体。将切下含有DNA条带的凝胶放入干净的1.5mL离心管中称重，100mg凝胶等同100μL体积，作为一个凝胶体积。
(3.2)加入等倍体积的Buffer GDP(用来溶解琼脂糖凝胶的缓冲液)。 50～55℃水浴7～10min，使凝胶块完全溶解。
(3.3)将溶液转移至FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱中，12000rpm 离心60s，倒掉收集管中废液。
(3.4)再向FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱中加入300μL Buffer GDP，12000rpm离心60s，倒掉收集管中废液。
(3.5)加入600μL Buffer GW(缓冲液)，12000rpm离心60s，弃掉废液，并重复一次。
(3.6)将吸附柱放回干净的收集管，12000rpm离心2min甩干FastPure DNA MiniColumns-G吸附柱。
(3.7)取出FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱，放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜的中间部位加入已经加热过的50μL Elution Buffer(洗脱缓冲剂)，室温放置2min，12000rpm离心2min。弃FastPure DNA Mini Columns-G 吸附柱，把载体片段保存于-20℃。
(4)获取目的基因片段。
本实施中，目的基因片段是通过在cDNA文库中进行选择。
目的基因片段是通过在美国国家生物技术信息中心上查询得到目的基因片段cDNA的基因信息，然后按照查询的基因信息进行合成得到。目的基因片段 cDNA中没有带启动子和终止子。
其中，cDNA(complementary DNA)，是一种互补脱氧核糖核酸，与mRNA 链互补的单链DNA，以其mRNA为模板，在适当引物的存在下，由mRNA与 DNA进行一定条件下合成的，便可得到cDNA。
本实施例中，cDNA包括RIDD和RIAD多肽标签小段。其中，RIDD和RIAD是cAMP依赖型蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase)结构中的多肽标签小段，能够互相进行特异性识别而相互连接。利用这一特性，两个分子的 RIDD和一个分子的RIAD就能够互连形成一个模块化组装酶结构，每一个酶分子都最大程度保持了其独立的空间结构，同时通过多肽末端进行组合，其催化效率将进一步提升，以此进一步提高3S-3S’-虾青素的合成产率。
另外，RIDD多肽标签小段的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示和RIAD 多肽标签小段的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。
(5)将pYLXP′2载体片段和目的基因片段组装，得到虾青素的单拷贝 pYLXP’2载体。
将载体片段和目的基因片段cDNA使用Gibson Assembly Cloning Kit组装 (吉布森组装克隆试剂盒)，反应体系参见表2。
表2：组装体系
试剂 使用量
pYLXP′2载体片段 100ng
cDNA片段 200ng
Assembly Master Mix(2X) 5μL
ddH2O Up to 10μL
其中，反应条件为：50℃，20min，这样便可得到对应的虾青素的单拷贝 pYLXP’2载体。
本实施例中，为了得到对单拷贝pYLXP’2载体进行筛选和复制，将以上获得单拷贝pYLXP’2载体用于转化大肠杆菌DH5α，以便筛选虾青素的pYLXP′2 载体的转化性能(也就是判断以上方法中单拷贝pYLXP’2载体是否已被转化成功)。
具体步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中取出商业化感受态大肠杆菌DH5α，置于0℃冰浴5min，使其充分融化。
(2)在超净工作台中，取10μL质粒载体加入大肠杆菌DH5α的菌液中，轻轻用枪头混匀，0℃冰浴30min。
(3)42℃水浴热激45s，马上放入冰中2min。
(4)加入800μL无抗性的LB液体培养基后，37℃，220rpm复苏40min；
(5)在超净工作台中，取100μL复苏液涂布于含氨苄青霉素抗性LB平板上，封口后培养基倒置于37℃恒温培养箱中，过夜培养。
从LB筛选平板随机挑选转化子保存于新平板，经菌落PCR检测并随机挑取3个单菌落摇菌1000μL，送测序公司测序，测序使用通用测序引物。得到测序结果后，经比对验证插入DNA片段正确。
再从大肠杆菌内提取以上复制的多个虾青素的单拷贝pYLXP’2载体。
大肠杆菌的单拷贝pYLXP’2载体的提取，具体步骤为：
(1)收集5-10mL过夜培养的菌液，13000rpm离心1min沉淀菌体，弃上清。
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer P1/RNaseA混和液，漩涡振荡混合均匀。
(3)往重悬混和液中加入250μL Elution P2，轻轻颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解。
(4)加入350μL Elution P3，温和颠倒8-10次至形成白色絮状沉淀。25℃，13000rpm离心10min。转移上清液至套有2mL收集管的FastPure DNA Mini Columns吸附柱中，25℃，13000rpm离心1min，倒去收集管中的废液。
(5)把吸附重新装回收集管，加入600μL Buffer PW2(缓冲液)，25℃，13000rpm离心1min，弃去废液。重新装回收集管，再加入700μL Buffer PW2，离心弃废液。
(6)25℃，13000rpm离心空柱2min以甩干吸附柱。把吸附装在干净的 1.5mL干净离心管上，加入30-100μL Elution Buffer于吸附中，静置2min，13000 rpm离心2min洗脱出单拷贝pYLXP’2载体DNA。提取的单拷贝pYLXP’2载体DNA使用NanoDrop One测定浓度后保存在-20℃。
1012：对单拷贝pYLXP’2载体进行双酶切，得到pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体和HpcrtW-RIDD基因表达模块。
其中，HpCrtW载体的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。HpCrtZ载体的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。
1013：将pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体和HpcrtW-RIDD基因表达模块进行酶连接处理，得到中间载体pYLXP'2::HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD。
1014：对中间载体pYLXP'2::HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD进行多次双酶切和酶连接，得到多拷贝的中间载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*n。
本实施例中，n＝4。
1015：对多拷贝的中间载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*n进行双酶切，得到HpcrtZ-RIAD::HpcrtW-RIDD基因多拷贝表达模块。
1016：将prDNALoxp线性化载体和HpcrtZ-RIAD::HpcrtW-RIDD基因多拷贝表达模块进行酶连接处理，得到虾青素的多拷贝的表达载体。
也就是说，构建重组虾青素载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*4需要经过多步相同步骤酶切连接，然后进行转移载体得到 prDNALoxp::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*4。
本实施例中，获取HpcrtW-RIDD基因表达模块时，双酶切反应使用NheⅠ-Cla Ⅰ双酶切体系。
获取pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体时，双酶切反应使用AvrⅡ-ClaⅠ双酶切体系。
当然，在双酶切反应结束后，依然使用凝胶电泳回收相应片段或载体，然后使用T4DNA连接酶连接，连接体系为：
表3：连接体系
Figure RE-GDA0003400159750000101
连接体系于25℃反应20min，反应体系转化大肠杆菌DH5α。
通过多步酶切连接，得到重组虾青素表达载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*4以及多拷贝的表达载体prDNALoxp::[HpcrtW-RIDD:: HpcrtZ-RIAD]*4。
S102：将产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC进行活化处理。
S103：将活化处理后的工程菌株YlBC和多拷贝的质粒载体转化后培养，得到转化子。
步骤S103通过以下方式实现：
1031：活化处理后的工程菌株YlBC的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到待转化解脂耶氏酵母的YlBC底盘菌株。
将活化24-36h的解脂耶氏酵母YlBC菌液涂于固体YPD(Yeast Extract PeptoneDextrose Medium，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)培养基平板，在28℃条件下静置培养48h。在固体培养基平板挑取产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母的 YlBC底盘菌株。
1032：将YlBC底盘菌株与多拷贝的质粒载体转化后培养，得到转化子。
首先，使用灭菌的1.5mL离心管，加入PEG6000 90μL、2mol/L醋酸锂5μL、挑选后的YlBC底盘菌株、ssDNA 5μL混合均匀，随后加入300ng左右的多拷贝的表达载体(也就是线性化的prDNALoxp::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*4载体) 混合均匀，放于30℃温育30-40min，同时每隔10min震荡混匀一次。
然后，将上述离心管置于39℃静置热激10min，加入400μL无菌水后，将离心管内的液体涂于固体CSM筛选平板培养基，将平板培养基倒置于28℃培养箱静置培养72h至转化子长出。
PEG是聚乙二醇英文名polyethylene glycol的简称。ssDNA为single strand DNA(单链核酸)的缩写。
S104：将转化子进行发酵培养，筛选得到工程菌株ULHpDA*20。
步骤S104通过以下方式实现：
1041：从转化子中，选择发酵产生虾青素含量最高的转化子作为工程菌株ULHpDA*20，
初筛挑取转化后颜色较深且较大的单菌落，加入装有5mL活化CSM培养基的玻璃试管中，28℃、220r/min，培养48h至OD600值>0.5，然后使用发酵 CSM培养基发酵培养72h。
根据类胡萝卜素提取及分析检测方法测定虾青素的含量，选取虾青素含量最高的转化子即为工程菌株ULHpDA*20。
本实施例中，以上工程菌株ULHpDA*20在合成3S-3S’-虾青素时，同时也可以形成其他类胡萝卜素。其他类胡萝卜素包括角黄素(canthaxanthin)，海胆酮(echinenone)，芬尼黄质(phoenicoxanthin)，3-羟基海胆酮(3-or 3’-hydroxyechinenone)，β-胡萝卜素(β-carotene)。
以下为本公开实施例通过以上方法获取3S-3S’-虾青素与其他菌株获取 3S-3S’-虾青素的产量对比表：
表4：产量对比表
Figure RE-GDA0003400159750000121
本公开实施例还提供了一种酵母的工程菌株的应用，酵母的工程菌株应用在虾青素的制备中。
本公开实施例还提供了一种虾青素的提取方法，提取方法基于以上工程菌株或者以上构建方法所构建的工程菌株实现，如图2所示，提取方法包括：
S201：将工程菌株ULHpDA*20投入至培养基中进行发酵，得到发酵液。
S202：将发酵液进行离心、漩涡震荡、过滤，得到虾青素提取液。
本实施例中，取5mL工程菌株ULHpDA*20发酵液10mL试管中，并以4500 r/min离心10min，去除上清。
然后，试管中加10mL缓冲溶液重悬，以4500r/min离心两次，每次10min，将上清液尽量吸取干净，然后在试管中加入含0.01％BHT的乙酸乙酯6mL，同时加入15～20颗3mm玻璃珠，2500r/min漩涡震荡45min，取300μL的溶液过两次0.22μm疏水性滤膜进行过滤。
S203：将虾青素提取液进行高效液相色谱检测分离，得到3S-3S’-虾青素。
本实施例中，高效液相色谱(HPLC)色谱条件：色谱柱为YMC Carotenoid C 30(4.6mm×250mm，5μm)。
流动相为A-B液进行梯度洗脱，0～90min，0-100％B液，100％-0％A液。体积流量1.0mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长450nm。
流动相A液：甲醇/甲基叔丁基醚/水＝81/15/4；流动相B液：甲醇/甲基叔丁基醚/水＝7/90/3。
以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 酵母的工程菌株及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 406
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac ttgtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 406
<210> 2
<211> 419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccatggcct gtccccacgt tgccggtctt gcctcctact acctgtccat caatgacgag 60
gttctcaccc ctgcccaggt cgaggctctt attactgagt ccaacaccgg tgttcttccc 120
accaccaacc tcaagggctc tcccaacgct gttgcctaca acggtgttgg catttaggca 180
attaacagat agtttgccgg tgataattct cttaacctcc cacactcctt tgacataacg 240
atttatgtaa cgaaactgaa atttgaccag atattgttgt aaatagaaaa tctggcttgt 300
aggtggcaaa atgcggcgtc tttgttcatc aattccctct gtgactactc gtcatccctt 360
tatgttcgac tgtcgtattt cttattttcc atacatatgc aagtgagatg cccgtgtcc 419
<210> 3
<211> 1211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgagaaacac aacaacatgc cccattggac agatcatgcg gatacacagg ttgtgcagta 60
tcatacatac tcgatcagac aggtcgtctg accatcatac aagctgaaca agcgctccat 120
acttgcacgc tctctatata cacagttaaa ttacatatcc atagtctaac ctctaacagt 180
taatcttctg gtaagcctcc cagccagcct tctggtatcg cttggcctcc tcgataggat 240
ctcggttctg gccgtacaga cctcggccga caattatgat atccgttccg gtagacatga 300
catcctcaac agttcggtac tgctgtccga gagcgtctcc cttgtcgtca agacccaccc 360
cgggggtcag aataagccag tcctcagagt cgcccttagg tcggttctgg gcaacgaagc 420
caaccacaaa ctcggggtcg gatcgggcaa gctcaatggt ctgcttggag tactcgccag 480
tggccagaga gcccttgcaa gacagctcgg ccagcatgag cagacctctg gccagcttct 540
cgttgggaga ggggaccagg aactccttgt actgggagtt ctcgtagtca gagacgtcct 600
ccttcttctg ttcagagaca gtttcctcgg caccagctcg caggccagca atgattccgg 660
ttccgggtac accgtgggcg ttggtgatat cggaccactc ggcgattcgg tagacaccgt 720
tcttgtactg gtgcttgaca gtgttgccaa tatctgcgaa ctttctgtcc tcgaacagga 780
agaaaccgtg cttaagagca agttccttga gggggagcac agtgctggcg taggtgaagt 840
cgtcaatgat gtcgatatgg gtcttgatca tgcacacata aggtccgacc ttatcggcaa 900
gctcaatgag ctccttggtg gtggtaacat ccagagaagc acacaggttg gttttcttgg 960
ctgccacgag cttgagcact cgagcggcaa aggcggactt gtggacgtta gctcgagctt 1020
cgtaggaggg cattttggtg gtgaagagga gactgaaata aatttagtct gcagaacttt 1080
ttatcggaac cttatctggg gcagtgaagt atatgttatg gtaatagtta cgagttagtt 1140
gaacttatag atagactgga ctatacggct atcggtccaa attagaaaga acgtcaatgg 1200
ctctctgggc g 1211
<210> 4
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgtggcct ctgctctgat ggtcgagcag aagggctctg aggccgctgc ctcttctccc 60
gacgtgctgc gagcctgggc tacccagtac cacatgcctt ccgagtcctc tgacgccgct 120
cgacccgctc tgaagcacgc ctacaagcct ccagcctccg acgccaaggg catcaccatg 180
gctctgacca tcatcggaac ctggaccgcc gtgttcctgc acgccatctt ccagattcga 240
ctgcccacct ctatggacca gctgcactgg ctgcccgtgt ctgaggccac cgctcagctg 300
ctcggcggat cttcttctct gctgcacatt gccgccgtct ttatcgtgct tgagttcctg 360
tacaccggcc tgttcatcac cactcacgac gccatgcacg gcaccattgc tctgcgacac 420
cgacagctga acgacctgct gggcaacatc tgcatctccc tgtacgcctg gttcgactac 480
tctatgctgc accgaaagca ctgggagcac cacaaccaca ccggcgaggt cggcaaggac 540
cccgacttcc acaagggcaa ccccggactg gtgccctggt tcgcctcttt catgtcctct 600
tacatgtctc tgtggcagtt cgcccgactg gcctggtggg ccgtcgtcat gcagatgctg 660
ggcgctccca tggccaacct gctggtgttc atggccgctg ctcccatcct gtccgccttc 720
cgactgttct acttcggcac ctacctgcct cacaagcccg agcctggacc tgccgccgga 780
tctcaggtga tggcctggtt ccgagccaag acctctgagg cttctgacgt gatgtctttc 840
ctgacctgct accacttcga cctgcattgg gagcatcaca gatggccctt cgctccctgg 900
tggcagctcc ctcactgccg acgactgtct ggccgaggac tggtccccgc tctggctggc 960
ggaggcggat ctggcggcgg tggctccggt ggcggaggtt ctggcggtgg cggtagcgga 1020
ggtggcggct ccggcggtgg tggatgcggc tctctgcgag agtgcgagct gtacgtgcag 1080
aagcacaaca ttcaggccct gctgaaggac tctatcgtgc agctgtgcac tgcccgacct 1140
gagcgaccta tggccttcct gcgagaatac ttcgagcgac tggaaaagga agaggccaag 1200
taa 1203
<210> 5
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtctaagc tgcagtctat ctctgtgaag gcccgacgag tcgagctggc ccgagacatc 60
acccgaccta aggtgtgcct gcacgcccag agatgttctc tggtgcgact gcgagtggct 120
gctccccaga ccgaagaggc cctgggcacc gtgcaggccg ctggcgctgg cgacgagcac 180
tctgccgacg tggccctgca gcagctggac cgagccattg ccgagcgacg agcccgacga 240
aagcgagagc agctgtctta ccaggctgcc gctatcgccg cctctatcgg cgtgtctgga 300
atcgccatct tcgccaccta cctgcgattc gccatgcaca tgaccgtcgg cggagctgtg 360
ccctggggcg aagtggctgg caccctgctg ctggtggtcg gaggcgccct cggcatggaa 420
atgtacgccc gatacgccca caaggccatc tggcacgagt cgcccctcgg ctggctgctg 480
cacaagtctc atcacacccc tcgaaccgga cctttcgagg ccaacgacct gttcgccatc 540
atcaacggac tgcccgccat gctgctgtgt accttcggct tctggctgcc caacgtgctg 600
ggagccgcct gcttcggagc cggcctgggc atcaccctgt acggcatggc ctacatgttc 660
gtccacgacg gcctggtgca ccgacgattc cccaccggac ctatcgctgg actgccctac 720
atgaagcgac tgaccgtggc tcaccagctg caccactctg gcaagtacgg cggagcccct 780
tggggcatgt tcctgggacc tcaagagctg cagcacatcc ccggtgccgc cgaagaggtc 840
gagcgactgg tgctggaact ggactggtct aagcgaggcg gcggaggctc tggcggaggc 900
ggatctggcg gcggtggttc cggtggtggc ggctccggtg gcggcggttc aggcggaggt 960
ggctgcggcc tggaacagta cgccaaccag ctggccgacc agatcatcaa ggaagccacc 1020
gagggctgct aa 1032
<210> 6
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggtggcg gctccggtgg cggcggttca ggcggaggtg gctgcggcct ggaacagtac 60
gccaaccagc tggccgacca gatcatcaag gaagccaccg agggctgcta a 111
<210> 7
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcggtggcg gtagcggagg tggcggctcc ggcggtggtg gatgcggctc tctgcgagag 60
tgcgagctgt acgtgcagaa gcacaacatt caggccctgc tgaaggactc tatcgtgcag 120
ctgtgcactg cccgacctga gcgacctatg gccttcctgc gagaatactt cgagcgactg 180
gaaaaggaag aggccaagta a 201

Claims (10)

1.一种酵母的工程菌株，用于产虾青素，其特征在于，所述工程菌株为通过产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC和基因载体形成的工程菌株ULHpDA*20，所述基因载体包括pYLXP'2载体和prDNALoxp载体，所述虾青素包括3S-3S’-虾青素。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株ULHpDA*20的保藏编号为CCTCC NO：M 20211046，所述工程菌株ULHpDA*20的菌种名称为解脂耶氏酵母。
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述基因载体包括在所述工程菌株YlBC发挥作用的强启动子TEF和终止子XPR2。
4.一种工程菌株的构建方法，所述工程菌株为权利要求1至3中任一项所述的工程菌株，其特征在于，所述构建方法包括：
基于基因载体，构建虾青素的多拷贝的表达载体，所述基因载体包括pYLXP'2载体和prDNALoxp载体；
将产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌株YlBC进行活化处理；
将活化处理后的所述工程菌株YlBC和所述多拷贝的表达载体转化后培养，得到转化子；
将所述转化子进行发酵培养，筛选得到所述工程菌株ULHpDA*20。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述基于基因载体，构建虾青素的多拷贝的表达载体，包括：
基于所述pYLXP'2载体，构建虾青素的单拷贝pYLXP'2载体；
对所述单拷贝pYLXP'2载体进行双酶切，得到pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体和HpcrtW-RIDD基因表达模块；
将所述pYLXP'2::HpcrtZ-RIAD载体和所述HpcrtW-RIDD基因表达模块进行酶连接处理，得到中间载体pYLXP'2::HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD；
对所述中间载体pYLXP'2::HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD进行多次双酶切和酶连接，得到多拷贝的中间载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*n；
对所述多拷贝的中间载体pYLXP'2::[HpcrtW-RIDD::HpcrtZ-RIAD]*n进行双酶切，得到HpcrtZ-RIAD::HpcrtW-RIDD基因多拷贝表达模块；
基于所述prDNALoxp载体，得到prDNALoxp线性化载体；
将所述prDNALoxp线性化载体和所述HpcrtZ-RIAD::HpcrtW-RIDD基因多拷贝表达模块进行酶连接处理，得到所述虾青素的多拷贝的表达载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述基于所述pYLXP'2载体，构建虾青素的单拷贝pYLXP’2载体，包括：
将所述pYLXP'2载体进行双酶切，得到具有粘性末端的pYLXP'2线性化载体；
通过凝胶回收试验盒对所述pYLXP'2线性化载体进行片段回收，得到pYLXP'2载体片段；
将所述pYLXP'2载体片段和目的基因片段组装，得到所述虾青素的单拷贝pYLXP’2载体。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述将活化处理后的所述工程菌株YlBC和所述多拷贝的表达载体转化后培养，得到转化子，包括：
将所述活化处理后的所述工程菌株YlBC的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到待转化解脂耶氏酵母的YlBC底盘菌株；
将所述YlBC底盘菌株与所述多拷贝的表达载体转化后培养，得到转化子。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述将所述转化子进行发酵培养，筛选得到所述工程菌株ULHpDA*20，包括：
从所述转化子中，选择发酵产生虾青素含量最高的所述转化子作为所述工程菌株ULHpDA*20。
9.一种工程菌株的应用，所述工程菌株为权利要求1至3中任一项所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株应用在虾青素的制备中。
10.一种虾青素的提取方法，其特征在于，所述提取方法基于权利要求1至3中任一项所述的工程菌株实现，所述提取方法包括：
将工程菌株ULHpDA*20投入培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、漩涡震荡、过滤，得到虾青素提取液；
将所述虾青素提取液进行高效液相色谱检测分离，得到虾青素。
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