CN113876703A - 一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨髓间充质干细胞注射液，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞2‑8×106个、异海松酸0.2‑0.5g、赤芝多糖5‑10mg、iRGD 0.5‑0.9μg、复合氨基酸5‑10g、柠檬酸钠0.3‑0.7 g、氯化钠1.2‑1.8g、余量为去离子水。本发明提供的注射液，通过在注射液中添加异海松酸、赤芝多糖、iRGD等成分有效保持注射液中骨髓间充质干细胞的活性，提高细胞的成活率。本发明还提供一种上述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，操作简便易于实现，便于注射液的商业化生产。本发明还提供了上述骨髓间充质干细胞注射液在治疗骨质疏松药物中的应用，本发明的注射液提高了移植前骨髓间充质干细胞的活性，保证移植后有足够活性和分化能力的细胞发挥作用，有效缓解骨质疏松的症状。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSCs具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为骨、软骨、脂肪等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术最有希望的种子细胞之一。
骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）是来源于骨髓的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞易于分离培养且免疫排斥弱，具有较强的自我更新以及多向分化潜能。被广泛应用于干细胞移植治疗等组织工程学。
目前普遍认为造成骨质疏松症的原因是骨组织中骨形成明显减少、骨吸收过程相对增强。而骨髓间充质干细胞的数量减少及分化能力的减弱，导致了分化为成骨细胞及骨细胞减少，使得骨组织中骨形成明显减少，进而造成骨质疏松。通过体外注射骨髓间充质干细胞，提高骨髓间充质干细胞的数量，进而提高骨组织中骨形成能力是改善骨质疏松的有效途径之一。然而移植的外源性骨髓间充质干细胞在体外保存过程中因各种保存不当易造成外源损伤，细胞存活率较低，注射液中的DMSO等辅料一方面会影响骨髓间充质干细胞的活性；另一方面，在注射至人体内后安全性无法保证，最终造成干细胞注射至体内后生物活性差，极大地阻碍了其临床应用，因此改善骨髓间充质干细胞注射液的成分，提高骨髓间充质干细胞移植效率，是改善骨髓间充质干细胞的临床应用效果需要解决的问题之一。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种骨髓间充质干细胞注射液，成分安全简单，能有效提高骨髓间充质干细胞的活性。
本发明的目的之二在于提供一种骨髓间充质干细胞注射液的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种骨髓间充质干细胞注射液的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种骨髓间充质干细胞注射液，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞2-8×106个、异海松酸0.2-0.5g、赤芝多糖5-10mg、iRGD 0.5-0.9μg、复合氨基酸5-10g、柠檬酸钠0.3-0.7 g、氯化钠1.2-1.8g、余量为去离子水。
进一步地，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞5×106个、异海松酸0.3g、赤芝多糖7mg、iRGD 0.7μg、复合氨基酸8g、柠檬酸钠0.5 g、氯化钠1.5g、余量为去离子水。
进一步地，所述骨髓间充质干细胞为传代培养的P3-P8代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞。
进一步地，所述复方氨基酸为L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸中的至少3种的混合。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，包括以下步骤：
（1）取氯化钠加入至去离子水中，待完全溶解后加入异海松酸、赤芝多糖、iRGD、柠檬酸钠、复合氨基酸混合均匀后过滤除菌，得到混合溶液；
（2）将骨髓间充质干细胞加入上述步骤（1）的混合溶液中重悬，即得骨髓间充质干细胞注射液。
进一步地，所述骨髓间充质干细胞悬液保存在0~6℃。
进一步地，采用孔径0.22μm的过滤器过滤除菌
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述骨髓间充质干细胞注射液在治疗骨质疏松药物中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种骨髓间充质干细胞注射液，通过在注射液中添加异海松酸、赤芝多糖、iRGD等成分有效保持注射液中骨髓间充质干细胞的活性，其中异海松酸可以调节细胞膜上的离子通道，保持细胞内外渗透压的平衡，同时，异海松酸还有助于骨髓间充质干细胞成骨分化。赤芝多糖具有较好的保水性，避免细胞在保存和复苏过程中因失水而失去活性。iRGD可以显著提升细胞在体外保存过程中细胞的生存能力，保持细胞的分化性能，和异海松酸、赤芝多糖一起发挥作用使细胞保持活性，提高细胞的成活率，在应用时细胞能较好的发挥分化能力，改善骨质疏松症状。
2、本发明还提供一种上述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，操作简便易于实现，便于注射液的商业化生产。
3、本发明还提供了上述骨髓间充质干细胞注射液在治疗骨质疏松药物中的应用，本发明的注射液提高了移植前骨髓间充质干细胞的活性，保证移植后有足够活性和分化能力的细胞发挥作用，有效缓解骨质疏松的症状。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种骨髓间充质干细胞注射液，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞5×106个、异海松酸0.3g、赤芝多糖7mg、iRGD 0.7μg、复合氨基酸8g、柠檬酸钠0.5g、氯化钠1.5g、余量为去离子水；骨髓间充质干细胞为传代培养的P5代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞；复方氨基酸为L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸三种氨基酸以1:0.5:0.8:1质量比组成。
上述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，包括以下步骤：
（1）取氯化钠加入至去离子水中，待完全溶解后加入异海松酸、赤芝多糖、iRGD、柠檬酸钠、复合氨基酸混合均匀后采用孔径0.22μm的过滤器过滤除菌，得到混合溶液；
（2）将骨髓间充质干细胞加入上述步骤（1）的混合溶液中重悬，即得骨髓间充质干细胞注射液，将其保存在4℃中备用。
实施例2
一种骨髓间充质干细胞注射液，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞2×106个、异海松酸0.2g、赤芝多糖5mg、iRGD 0.5μg、复合氨基酸5g、柠檬酸钠0.3g、氯化钠1.2g、余量为去离子水；骨髓间充质干细胞为传代培养的P3代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞；复方氨基酸为L-色氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸以0.3:0.5:0.2:0.8:0.5:1质量比组成。
上述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法同实施例1。
实施例3
一种骨髓间充质干细胞注射液，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞8×106个、异海松酸0.5g、赤芝多糖10mg、iRGD 0.9μg、复合氨基酸10g、柠檬酸钠0.7 g、氯化钠1.8g、余量为去离子水；骨髓间充质干细胞为传代培养的P8代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞；复方氨基酸为L-精氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸以2:1:2的质量比混合。
上述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法同实施例1。
对比例1
对比例1提供一种骨髓间充质干细胞注射液，和实施例1的区别为：省去异海松酸，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种骨髓间充质干细胞注射液，和实施例1的区别为：省去赤芝多糖，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种骨髓间充质干细胞注射液，和实施例1的区别为：将赤芝多糖替换为黄芪多糖，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种骨髓间充质干细胞注射液，和实施例1的区别为：将赤芝多糖替换为灵芝多糖，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种骨髓间充质干细胞注射液，和实施例1的区别为：省去iRGD，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种骨髓间充质干细胞注射液，和实施例1的区别为：将 iRGD替换为谷胱甘肽，其余均和实施例1相同。
将实施例1至3，对比例1至6中的样品在保存6h、12h、24h时进行取样，采用0.4%台盼蓝染色法，用Countstar全自动细胞计数仪进行计数，统计细胞活率，结果如表1所示。
表1
| 样品 | 6h细胞活率 | 12h细胞活率 | 24h细胞活率 |
| 实施例1 | 98.75% | 96.87% | 93.05% |
| 实施例2 | 97.69% | 95.49% | 92.61% |
| 实施例3 | 98.02% | 96.25% | 92.94% |
| 对比例1 | 83.32% | 74.08% | 60.12% |
| 对比例2 | 85.41% | 78.57% | 63.73% |
| 对比例3 | 93.82% | 88.67% | 84.72% |
| 对比例4 | 94.35% | 89.79% | 85.35% |
| 对比例5 | 92.67% | 87.25% | 83.49% |
| 对比例6 | 93.35% | 88.19% | 82.98% |
由表1可以看出在-20℃保存24小时后，实施例1至3中的骨髓间充质干细胞活率较高，均在90%以上，可以满足移植需求。对比例1至6中均有不同程度的下降。
对比例1中省去了异海松酸，保存24h后细胞的存活率仅为60.12%，细胞活率下降显著，说明本发明添加异海松酸有助于注射液中的骨髓间充质干细胞保持活性。
对比例2至4中分别将赤芝多糖省去或者替换为黄芪多糖和灵芝多糖，和省去赤芝多糖相比，添加黄芪多糖和灵芝多糖细胞的活率有一定的提高但是不及实施例1，说明相比其他多糖，赤芝多糖具有较好的保水性，避免细胞在保存和复苏过程中因失水而失去活性，可以更好的保证细胞的活性。
对比例5中省去了iRGD，对比例6中将iRGD替换为谷胱甘肽，细胞活率也不及实施例1，说明iRGD的添加也有助于注射液中的骨髓间充质干细胞保持活性。 综上，本发明的注射液中通过添加异海松酸、赤芝多糖、iRGD等成分保持细胞活性，实现了在24h的保存时间内，骨髓间充质干细胞活率均能满足移植需求。
选取18月龄的SPF级雄性小鼠80只，作为老年骨质疏松症的动物模型。将小鼠进行随机分组，每组10只，共8组，分别注射实施例1，对比例1至6的注射液（注射液均为制备后2h内使用，此时各组注射液中细胞活率相差不大，均能满足动物实验的要求），同时设置仅注射PBS的空白对照组，每天尾静脉注射一次100微升的注射液或PBS，连续60天，整个过程小鼠均在清洁级动物房中饲养，室温保持在20℃，空气湿度为50%。
在连续使用注射液60天后，对小鼠的全身骨密度进行检测。检测过程中将小鼠麻醉，采用DISCOVERY双能X线骨密度仪及其所附带的骨密度测试配套采集和分析软件，对小鼠的全身骨密度及骨矿含量进行检测，每组均取10只小鼠的平均值，结果如表2所示。
表2
| 组别 | 骨密度（g/cm<sup>2</sup>） | 骨矿含量（g） |
| 实施例1 | 0.415±0.024 | 0.379±0.018 |
| 对比例1 | 0.329±0.019 | 0.305±0.016 |
| 对比例2 | 0.346±0.023 | 0.321±0.019 |
| 对比例3 | 0.359±0.019 | 0.339±0.020 |
| 对比例4 | 0.362±0.021 | 0.351±0.021 |
| 对比例5 | 0.335±0.017 | 0.317±0.015 |
| 对比例6 | 0.315±0.018 | 0.309±0.017 |
| 空白对照组 | 0.307±0.022 | 0.274±0.017 |
由表2可以看出：和空白对照组相比，实施例1中的骨密度和骨矿含量提高显著（P＜0.05）。对比例1只6中骨密度和骨钙含量和空白对照组相比有一定的改善，但均不及实施例1。
对比例1中省去了异海松酸，骨密度和骨钙含量和实施例1相比下降明显。说明异海松酸对骨髓间充质干细胞发挥成骨分化有促进作用。对比例2中至4中分别将赤芝多糖省去或者替换为黄芪多糖和灵芝多糖，骨密度和骨钙含量均有不同程度的下降，说明赤芝多糖和其他多糖相比在促进骨髓间充质干细胞的成骨分化上效果更好。对比例5中省去了iRGD，对比例6中将iRGD替换为谷胱甘肽，骨密度和骨钙含量也不及实施例1。由此可知，本发明通过在注射液中添加异海松酸、赤芝多糖、iRGD等成分有效保持注射液中骨髓间充质干细胞的活性和分化能力，提高骨形成，促进骨量的增加，在一定程度上可以改善骨质疏松。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种骨髓间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞2-8×106个、异海松酸0.2-0.5g、赤芝多糖5-10mg、iRGD 0.5-0.9μg、复合氨基酸5-10g、柠檬酸钠0.3-0.7 g、氯化钠1.2-1.8g、余量为去离子水。
2.根据权利要求1所述骨髓间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL注射液中含有：骨髓间充质干细胞5×106个、异海松酸0.3g、赤芝多糖7mg、iRGD 0.7μg、复合氨基酸8g、柠檬酸钠0.5 g、氯化钠1.5g、余量为去离子水。
3.根据权利要求1所述骨髓间充质干细胞注射液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为传代培养的P3-P8代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述骨髓间充质干细胞注射液，其特征在于，所述复方氨基酸为L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸中的至少3种的混合。
5.如权利要求1所述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取氯化钠加入至去离子水中，待完全溶解后加入异海松酸、赤芝多糖、iRGD、柠檬酸钠、复合氨基酸混合均匀后过滤除菌，得到混合溶液；
（2）将骨髓间充质干细胞加入上述步骤（1）的混合溶液中重悬，即得骨髓间充质干细胞注射液。
6.根据权利要求5所述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞悬液保存在0~6℃。
7.根据权利要求5所述骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，采用孔径0.22μm的过滤器过滤除菌。
8.如权利要求1至3所述骨髓间充质干细胞注射液的应用，其特征在于，在治疗骨质疏松药物中的应用。
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