CN113875496B - 一种蛹虫草菌株的复壮方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蛹虫草菌株的复壮方法，涉及微生物技术领域。所述复壮方法包括以下步骤：将退化的蛹虫草菌株接种于添加了大米和木腐菌菌渣的MM培养基中，在25～27℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基；将覆盖菌丝的所述MM培养基在23～24℃、每日光照时长为10～14h的条件下，继续培养25～35天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。通过采用添加有大米和木腐菌菌渣的MM培养基来培养退化的蛹虫草菌株，实现了蛹虫草菌株的复壮，使退化的蛹虫草菌株产子实体和虫草素的能力显著提高，从而减少了蛹虫草菌株培养的经济损失，该复壮方法操作简单，且为木腐菌菌渣提供了新用途，使该复壮方法绿色环保、成本低。

Description

一种蛹虫草菌株的复壮方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种蛹虫草菌株的复壮方法。

背景技术

我国幅员辽阔，自然资源丰富，气候条件多样，因此食用菌栽培品种亦丰富多样。目前已商业化规模栽培的品种有30多种，栽培规模达20万吨以上的就有13种。而食用菌按其栽培所需的原材料可分为草腐菌和木腐菌。其中，木腐菌栽培的主要原料为阔叶树的木屑和棉籽壳。以木腐菌中的真姬菇为例，真姬菇又名玉蕈、斑玉蕈，外形美观，质地脆嫩，味道鲜美，具有海蟹味有人称之为蟹味菇、海鲜菇。中国自1986年3月从日本引进真姬菇栽培，主要有灰色和白色两个品系，现在福建、上海、山东、辽宁、山西、河北、河南等省均有栽培。仅2019年国内工厂化真姬菇共有3家企业日产能超过100吨，如此巨大的产能，也带来巨大的菌渣，菌渣如何绿色环保的处理，一直是困扰木腐食用菌企业的一个问题。

蛹虫草是一种珍贵的食药用真菌，具有抗疲劳、抗衰老、增强免疫和性功能等作用，能补肺益肾壮阳，有扶虚损、益精气、止血、化痰、镇静和免疫等多种功能。但蛹虫草作为丝状真菌的一种，在人工培养基上经多次继代后必然会遇到菌种的衰退或退化问题，使菌种的优良性状在一定程度上衰退或丧失。蛹虫草菌株的退化主要表现在：产子实体的能力下降。因此，蛹虫草菌株的退化现象，使生产蒙受巨大损失，也为菌种保藏工作带来很大的困难。

目前关于丝状真菌复壮的方法有很多。1、组织分离：将退化的丝状真菌出菇(如蘑菇类或蛹虫草)，选择子实体外观健壮的，在无菌条件下重新进行组织分离；2、菌丝纯化与尖端菌丝分离：挑取健壮的菌丝尖端部分，进行培养，以期获得复壮的菌株；3、有性孢子分离筛选：选择形态好，生长好的子实体，采用孢子收集器收集有性孢子，进行多孢或单孢分离培养，获得的单核菌丝还要与可亲和的单核菌丝杂交后形成双核菌丝，再进行出菇实验，才能确定获得复壮的菌株；4、添加抗生素，对菌株菌株进行复壮。前3种方法都费时耗力，而且不能保证得到复壮的菌株，而最后一种方法，虽然简单，但要添加各种不同的抗生素，而现在，抗生素的使用已经得到严格的控制，因此也不能得到很好的推广和应用。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种蛹虫草菌株的复壮方法，旨在提供一种利用废弃菌渣、操作简单的蛹虫草菌株的复壮方法。

为实现上述目的，本发明提出一种蛹虫草菌株的复壮方法，所述复壮方法包括以下步骤：

将退化的蛹虫草菌株接种于添加了大米和木腐菌菌渣的MM培养基中，在25～27℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基；

将覆盖菌丝的所述MM培养基在23～24℃、每日光照时长为10～14h的条件下，继续培养25～35天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

可选地，所述木腐菌菌渣包括真姬菇菌渣或杏鲍菇菌渣。

可选地，所述木腐菌菌渣为真姬菇菌渣，所述真姬菇菌渣由栽培料A培养真姬菇后得到的，其中，所述栽培料A包括以下质量分数的组分：

玉米芯40～50％、杂木屑20～30％、米糠10～15％、麸皮15～20％和玉米粉3～6％。

可选地，所述真姬菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为2.5～5g：40mL，所述大米的质量与所述MM培养基的体积之比为20～22.5g：40mL。

可选地，所述木腐菌菌渣为杏鲍菇菌渣，所述杏鲍菇菌渣由栽培料B培养杏鲍菇后得到的，其中，所述栽培料B包括以下质量分数的组分：

棉籽壳55～65％、杂木屑15～25％、麦麸8～12％、玉米粉6～10％、磷酸二氢钾0.1～0.3％、石膏1～2％和石灰石0.5～1％。

可选地，所述杏鲍菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为3～6g：40mL，所述大米的质量与所述MM培养基的体积之比为19～22g：40mL。

可选地，所述MM培养基的组分包括磷酸二氢钾、硫酸镁和葡萄糖。

可选地，所述MM培养基中，所述磷酸二氢钾的质量分数为0.3％，所述硫酸镁的质量分数为MgSO₄，所述葡萄糖的质量分数为2％。

本发明提供的蛹虫草菌株的复壮方法，通过采用添加有大米和木腐菌菌渣的MM培养基来培养退化的蛹虫草菌株，实现了蛹虫草菌株的复壮，使退化的蛹虫草菌株产子实体和虫草素的能力显著提高，从而减少了蛹虫草菌株培养的经济损失，该复壮方法操作简单，且为木腐菌菌渣提供了新用途，使该复壮方法绿色环保、成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为蛹虫草菌株CM01-1的形态示意图；

图2为退化的蛹虫草菌株经本发明实施例1-3以及对比例1-3培养后的形态示意图；

图3为退化的蛹虫草菌株经本发明对比例4和对比例5培养后的形态示意图；

图4为退化的蛹虫草菌株经本发明实施例1-3以及对比例1-3培养后的菌丝中的虫草素含量测试结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种蛹虫草菌株的复壮方法，旨在提供一种利用废弃菌渣、且操作简单的蛹虫草菌株的复壮方法。在一实施例中，所述复壮方法包括以下步骤：

步骤S10、将退化的蛹虫草菌株接种于添加了大米和木腐菌菌渣的MM培养基中，在25～27℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基；

其中，所述MM培养基的组分包括磷酸二氢钾、硫酸镁和葡萄糖。综合考虑成本和培养效果，在一优选实施例中，所述MM培养基中，所述磷酸二氢钾的质量分数为0.3％，所述硫酸镁的质量分数为MgSO₄，所述葡萄糖的质量分数为2％。

为了使蛹虫草菌株的培养效果较好，可以理解的是，是将退化的蛹虫草菌株置于通风的条件下培养。具体实施时，可以将培养蛹虫草菌株的平板用打孔器打孔。经研究发现，将木腐菌菌渣用于培养退化的蛹虫草菌株，均能起到一定的复壮作用，这可能是因为木腐菌菌渣中的木屑等固体成分的颗粒较大，能影响培养基的物理结构，使其通气效果较好，同时木腐菌菌渣里面的营养成分也能对复壮起一定作用。本发明不限制所述木腐菌菌渣的具体种类，在本实施例中，所述木腐菌菌渣包括真姬菇或杏鲍菇。

在一实施例中，所述木腐菌菌渣为真姬菇菌渣，且所述真姬菇菌渣是由栽培料A培养真姬菇后得到的，其中，所述栽培料A包括以下质量分数的组分：玉米芯40～50％、杂木屑20～30％、米糠10～15％、麸皮15～20％和玉米粉3～6％。

进一步地，所述真姬菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为2.5～5g：40mL，所述大米的质量与所述MM培养基的体积之比为20～22.5g：40mL，所述大米和真姬菇菌株在此添加量下，对退化的蛹虫草菌株的复壮效果较好。更优地，所述真姬菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为3.75g：40mL。

本发明不限制所述真姬菇菌渣的具体获得方法，可以为使用所述栽培料A对真姬菇按常规方式培养后，收取真姬菇，所获得的真姬菇菌渣。在本实施例中，所述真姬菇菌渣由以下方式获得：按栽培料A的配方称重，然后加水至含水量65％，搅拌均匀，采用850ml聚丙烯塑料瓶，装瓶，再在121℃，灭菌100min；冷却后进行接种，接种后移入养菌室，温度22～23℃，相对湿度60～70％，CO₂浓度2000～4000mg/kg，暗光培养；70d后进行搔菌处理，搔去栽培瓶表层的老菌丝，并加入15ml自来水；转入出菇房，温度13～15℃，1～10天湿度98％，11～12d，湿度100％，CO₂浓度1000～2000mg/kg；料面形成针状原基；原基进一步分化为子实体，当菌盖呈半球形尚未开伞时即可采收；栽培瓶随传送带送至挖瓶室，挖瓶机将废料挖出，所述废料即为真姬菇菌渣。

在另一实施例中，所述木腐菌菌渣为杏鲍菇菌渣，所述杏鲍菇菌渣由栽培料B培养杏鲍菇后得到的，其中，所述栽培料B包括以下质量分数的组分：棉籽壳55～65％、杂木屑15～25％，麦麸8～12％，玉米粉6～10％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，石膏1～2％，石灰石0.5～1％。较优地，所述栽培料B为以下质量分数的组分：棉籽壳60％、杂木屑20％、麦麸10％、玉米粉8％、磷酸二氢钾0.2％、石膏1％和石灰石0.8％。

进一步地，所述杏鲍菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为3～6g：40mL，所述大米的质量与所述MM培养基的体积之比为19～22g：40mL。所述大米和杏鲍菇菌渣在此添加量下，对退化的蛹虫草菌株的复壮效果更好。

本发明不限制所述杏鲍菇菌渣的具体获得方法，可以为使用所述栽培料B对杏鲍菇按常规方式培养后，收取杏鲍菇，所获得的杏鲍菇菌渣。在本实施例中，所述杏鲍菇菌渣由以下方式获得：按栽培料B的配方称重，加水至含水量65％，搅拌均匀，采用17cm×33cm聚丙烯塑料袋，装袋，121℃，灭菌2h；冷却后进行接种，接种后移入养菌室，温度25℃，相对湿度70％，CO₂浓度2000～4000mg/kg，暗光培养；菌丝40d左右即可长满菌袋，刮去表面老菌丝进行搔菌处理；催蕾期间温度控制在10～15℃，湿度90～95％，增加散射光，加强通风；催蕾后3～6天即可长出原基，原基分化至1～2cm小菇蕾时，及时开袋，并进行疏蕾，每袋保留3～4个幼菇；出菇期间温度15～18℃，湿度85～90％，光照500～1000lx，加强通风；当菌盖即将平展，孢子尚未弹射，及时采收，然后收集聚丙烯塑料袋中的废料，即为杏鲍菇菌渣。

一般来说，在蚕蛹上获得的一代菌株，经传代5次左右时，菌株已经出现退化角变现象，因此，在本实施例中，将传代5次的蛹虫草菌株作为退化的蛹虫草菌株。本发明不限制所述退化的蛹虫草菌株的具体来源，可以为常规传代培养获得的。在本实施例中，所述退化的蛹虫草菌株由以下步骤获得：

步骤S11、蚕蛹出菇，-80度冰箱冻存的甘油菌株，利用SDB培养基获得的新鲜芽生孢子悬浮液，浓度调至108，用无菌注射器吸取200μL注射进蚕蛹体内(选用鲜活的蚕蛹，并用75％酒精浸泡1min杀菌)。然后将蚕蛹放置于底层铺有吸水纸(无菌水浸湿，无明水)的一次性方盒中(紫外照射1h杀菌)，25℃避光培养25d后转移至生态培养箱中，23℃光周期12:12(光：暗)培养50天，将蚕蛹上获得的子实体，转接到PDA培养基上，即可得到一代菌株，并命名为CM01-1，其形态如图1所示。

其中，所述SDB培养基购自碧迪医疗器械(上海)有限公司，其配方为：动物组织胃蛋白酶消化物5.0g/L，胰酶消化酪蛋白胨5.0g/L，葡萄糖20.0g/L。

步骤S12、在PDA培养基上25℃避光培养三周，用直径1cm的打孔器打孔后，在PDA上传代，连续传代5次，命名为CM01-5，此时菌株已经出现退化角变现象，即为退化的蛹虫草菌株。

其中，步骤S11和步骤S12中的PDA培养基，购自碧迪医疗器械(上海)有限公司，其配方为：马铃薯淀粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂粉15.0g/L

步骤S20、将覆盖菌丝的所述MM培养基在23～24℃、每日光照时长为10～14h的条件下，继续培养25～35天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

本发明提供的蛹虫草菌株的复壮方法，通过采用添加有大米和木腐菌菌渣的MM培养基来培养退化的蛹虫草菌株，实现了蛹虫草菌株的复壮，使退化的蛹虫草菌株产子实体和虫草素的能力显著提高，从而减少了蛹虫草菌株培养的经济损失，该复壮方法操作简单，且为木腐菌菌渣提供了新用途，使该复壮方法绿色环保、成本低。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1-8以及对比例1-3中培养退化的蛹虫草菌株的培养基中各组分的加入量按下表1所示。

表1原料配方

	大米/g	真姬菇菌渣/g	杏鲍菇菌渣/g	MM培养基/mL
					实施例1	22.5	2.5	0	40
实施例2	21.25	3.75	0	40
					实施例3	20	5	0	40
实施例4	22.5	2.5	0	40
					实施例5	22.5	2.5	0	40
实施例6	22	0	3	40
					实施例7	20.5	0	4.5	40
实施例8	19	0	6	40
					对比例1	25	0	0	40
对比例2	23.75	1.25	0	40
					对比例3	17.5	7.5	0	40

实施例1

(1)根据上表1实施例1对应的配方配制培养基(即，大米的质量与MM培养基的体积之比为22.5g：40mL，真姬菇菌渣的质量与MM培养基的体积之比为2.5g：40mL)，然后将退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)接种于装有上述培养基的培养瓶中，将培养瓶的平板用直径为1cm的打孔器打孔，在25℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基，其中，MM培养基包括以下质量分数的组分：0.3％的磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁和2％葡萄糖，真姬菇菌渣由栽培料A培养真姬菇后得到的，栽培料A包括以下质量分数的组分：玉米芯42％、杂木屑25％、米糠12％、麸皮15％和玉米粉6％。

(2)将覆盖菌丝的培养瓶转移至生态培养箱中，在23℃、每日光照时长为12h的条件下，继续培养30天后，得到复壮后的蛹虫草菌株，其形态如图2所示。

实施例2

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基配方替换为上表1中实施例2对应的培养基配方，其余步骤与实施例1相同，复壮后的蛹虫草菌株的形态如图2所示。

实施例3

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基配方替换为上表1中实施例3对应的培养基配方，其余步骤与实施例1相同，复壮后的蛹虫草菌株的形态如图2所示。

实施例4

(1)根据上表1实施例4对应的配方配制培养基，然后将退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)接种于装有上述培养基的培养瓶中，将培养瓶的平板用直径为1cm的打孔器打孔，在27℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基，其中，MM培养基包括以下质量分数的组分：0.3％的磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁和2％葡萄糖，真姬菇菌渣由栽培料A培养真姬菇后得到的，栽培料A包括以下质量分数的组分：玉米芯50％、杂木屑20％、米糠12％、麸皮15％和玉米粉3％。

(2)将覆盖菌丝的所述MM培养基在23℃、每日光照时长为10h的条件下，继续培养35天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

实施例5

(1)根据上表1实施例5对应的配方配制培养基，然后将退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)接种于装有上述培养基的培养瓶中，将培养瓶的平板用直径为1cm的打孔器打孔，在26℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基，其中，MM培养基包括以下质量分数的组分：0.3％的磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁和2％葡萄糖，真姬菇菌渣由栽培料A培养真姬菇后得到的，栽培料A包括以下质量分数的组分：玉米芯40％、杂木屑30％、米糠10％、麸皮15％和玉米粉5％。

(2)将覆盖菌丝的所述MM培养基在24℃、每日光照时长为14h的条件下，继续培养25天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

实施例6

(1)根据上表1实施例6对应的配方配制培养基，然后将退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)接种于装有上述培养基的培养瓶中，将培养瓶的平板用直径为1cm的打孔器打孔，在25℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基，其中，MM培养基包括以下质量分数的组分：0.3％的磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁和2％葡萄糖，杏鲍菇菌渣由栽培料B培养真姬菇后得到的，栽培料B包括以下质量分数的组分：棉籽壳60％、杂木屑20％、麦麸9％、玉米粉7.8％、磷酸二氢钾0.2％、石膏2％和石灰石1％。

(2)将覆盖菌丝的所述MM培养基在23℃、每日光照时长为12h的条件下，继续培养30天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

实施例7

(1)根据上表1实施例7对应的配方配制培养基，然后将退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)接种于装有上述培养基的培养瓶中，将培养瓶的平板用直径为1cm的打孔器打孔，在25℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基，其中，MM培养基包括以下质量分数的组分：0.3％的磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁和2％葡萄糖，杏鲍菇菌渣由栽培料B培养真姬菇后得到的，栽培料B包括以下质量分数的组分：棉籽壳55％、杂木屑25％、麦麸12％、玉米粉6％、磷酸二氢钾0.3％、石膏1％和石灰石0.7％。

(2)将覆盖菌丝的所述MM培养基在23℃、每日光照时长为12h的条件下，继续培养30天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

实施例8

(1)根据上表1实施例8对应的配方配制培养基，然后将退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)接种于装有上述培养基的培养瓶中，将培养瓶的平板用直径为1cm的打孔器打孔，在25℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基，其中，MM培养基包括以下质量分数的组分：0.3％的磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁和2％葡萄糖，杏鲍菇菌渣由栽培料B培养真姬菇后得到的，栽培料B包括以下质量分数的组分：棉籽壳65％、杂木屑15％、麦麸8％、玉米粉10％、磷酸二氢钾0.1％、石膏1.4％和石灰石0.5％。

(2)将覆盖菌丝的所述MM培养基在23℃、每日光照时长为12h的条件下，继续培养30天后，得到复壮后的蛹虫草菌株。

对比例1

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基组分替换为：25g大米+40mL的MM培养基，其余步骤与实施例1相同，培养后的蛹虫草菌株的形态如图2所示。

对比例2

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基组分替换为：23.75g大米+1.25g真姬菇菌渣+40mL的MM培养基，其余步骤与实施例1相同，培养后的蛹虫草菌株的形态如图2所示。

对比例3

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基组分替换为：17.5g大米+7.5g真姬菇菌渣+40mL的MM培养基，其余步骤与实施例1相同，培养后的蛹虫草菌株的形态如图2所示。

对比例4

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基替换为现有的大米培养基，即，培养基组分为：20g大米+5g豆粕+40mL的MM培养基，其余步骤与实施例1相同，培养后的蛹虫草菌株的形态如图3所示。

对比例5

除了将步骤(1)中培养退化的蛹虫草菌株(即CM01-5)的培养基替换为真姬菇菌渣浸出液培养基，其余步骤与实施例1相同，培养后的蛹虫草菌株的形态如图3所示。

其中，菌渣浸出液培养基的配制为：用7.5g的真姬菇菌渣加100mL的MM培养基，煮沸30min，过滤菌渣，获取菌渣液，用水补齐，然后取40mL的菌渣液25g大米，得到菌渣培养基(真姬菇菌渣与MM培养基的比为3g：40mL)。

对实施例1-3以及对比例1-3培养得到的蛹虫草菌株的菌丝进行虫草素含量测定，测试方法如下所示：

(1)从培养基上取下菌丝样品放入CVCFD5-3冷冻干燥机冻干后磨碎，取0.5g菌丝加水定容至10ml，超声波提取(40KHz、225W)60min，超声萃取3次，补足溶液定容至10ml，13000g离心5min，取上清，经0.22μm的微孔滤膜压滤后备用。

(2)液体培养基发酵液取10ml，13000g离心5min，取上清，经0.22μm的微孔滤膜压滤后备用。

(3)分别精密称取腺苷、虫草素标准品(腺苷标准品购于源叶生物，虫草素标准品购于索莱宝生物)10mg，加水定容至10ml，分别得到1mg/ml的腺苷、虫草素溶液，再分别取不同浓度梯度溶液至10ml容量瓶中加水定容至刻度，通过0.22μm微孔滤膜压滤后，按照色谱条件进行测定。

色谱柱(购于Sunfire公司)为C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇和水(15：85)，流速为1mL/min，检测波长为260nm，柱温为(25±5)℃，进样量为10μL，每个样品进样三次。

(4)分别记录不同浓度的腺苷、虫草素标准品对应的吸收峰面积，以标准品的不同浓度为横坐标，以其对应的吸收峰面积为纵坐标，绘制腺苷、虫草素的标准曲线，得到的腺苷标准曲线的线性方程为y＝3×10⁶X，R²＝0.9992，虫草素标准曲线的线性方程为y＝4×10⁶X，R²＝0.9999。

测试结果如图4所示(图4中，从左至右的实验中，菌渣的添加比例越来越高)，由图4可以看出，退化的蛹虫草菌株经实施例2、3以及对比例3培养后，蛹虫草菌丝中虫草素的含量较高，也即，添加不同比例的真姬菇菌渣，对蛹虫草菌丝虫草素的产生有明显的促进作用，且并不是添加量越高，促进作用就越好，而是在一定范围内，随着菌渣的添加比例的增加，促进作用也随之增加。

图2为退化的蛹虫草菌株经本发明实施例1-3以及对比例1-3培养后的形态示意图(图2中，从左至右的实验中，菌渣的添加比例越来越高)，由图2可以看出，实施例1-3中的蛹虫草菌株的子实体的产量较高，对比例1-3中的蛹虫草菌株的子实体的产量低，也即，并不是菌渣的添加量越多，复壮效果越好。因此，本发明提供的蛹虫草菌株的复壮方法，通过对培养退化的蛹虫草菌株的培养基组分及其配比的设计，使其对蛹虫草菌株的复壮效果好。

图3为退化的蛹虫草菌株经本发明对比例4和对比例5培养后的形态示意图，由图3可以看出，采用现有的大米培养基来对退化的蛹虫草菌株进行培养，不会长出子实体，而采用真姬菇浸出液来进行培养，会在一定程度上长出子实体。结合图2和图3中实施例2和实施例3(对比例5的真姬菇菌渣的添加量在实施例2和实施例3之间)可以看出，真姬菇菌渣中，真姬菇菌渣中的液体成分(即营养成分)会对蛹虫草复壮起一定作用，但主要起作用的还是菌渣中的固体成分，这可能是因为真姬菇菌渣中的木屑等固体成分的颗粒较大，能影响培养基的物理结构，使其通气效果较好，从而使复壮效果好。

进一步地，结合图3和图4可以看出，实施例2对蛹虫草菌株的复壮效果最好，此时，蛹虫草菌株的子实体产量高，且菌丝中的虫草素含量也高。

需要说明的是，实施例4-8的设计原理与实施例1-3相似，因此，其复壮效果也与实施例1-3差不多，均比对比例好，在此不做赘述。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种蛹虫草菌株的复壮方法，其特征在于，包括以下步骤：

将退化的蛹虫草菌株接种于添加了大米和木腐菌菌渣的MM培养基中，在25~27℃下避光培养至菌丝完全覆盖所述MM培养基；

将覆盖菌丝的所述MM培养基在23~24℃、每日光照时长为10~14 h的条件下，继续培养25~35天后，得到复壮后的蛹虫草菌株；

其中，所述MM培养基的组分包括磷酸二氢钾、硫酸镁和葡萄糖，所述MM培养基中，所述磷酸二氢钾的质量分数为0.3%，所述硫酸镁的质量分数为0.15%，所述葡萄糖的质量分数为2%；

所述木腐菌菌渣为真姬菇菌渣或杏鲍菇菌渣；

当所述木腐菌菌渣为真姬菇菌渣时，所述真姬菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为2.5~5g：40mL，所述大米的质量与所述MM培养基的体积之比为20~22.5g：40mL；

当所述木腐菌菌渣为杏鲍菇菌渣时，所述杏鲍菇菌渣的质量与所述MM培养基的体积之比为3~6g：40mL，所述大米的质量与所述MM培养基的体积之比为19~22g：40mL。

2.如权利要求1所述的蛹虫草菌株的复壮方法，其特征在于，所述真姬菇菌渣由栽培料A培养真姬菇后得到的，其中，所述栽培料A包括以下质量分数的组分：

玉米芯40~50%、杂木屑 20~30%、米糠10~15%、麸皮15~20%和玉米粉3~6%。

3.如权利要求1所述的蛹虫草菌株的复壮方法，其特征在于，所述杏鲍菇菌渣由栽培料B培养杏鲍菇后得到的，其中，所述栽培料B包括以下质量分数的组分：

棉籽壳55~65%、杂木屑15~25%、麦麸8~12%、玉米粉6~10%、磷酸二氢钾0.1~0.3%、石膏1~2%和石灰石0.5~1%。

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