CN113866072B - 一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法，包括：步骤1、从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到多个子样本，子样本藻类活体细胞数服从泊松分布，近似为方差等于均值的正态分布；对于所述藻液样品，随机抽样得到的子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF均值是一致的，子样本可变荧光Fv值也服从正态分布；步骤2：选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；步骤3、针对纯种藻液，根据子样本可变荧光Fv值的分布参数求解样品中活体藻细胞密度。本发明根据均匀样品随机抽样的子样本细胞数与可变荧光量分布形状一致的特点，利用大量子样本可变荧光量的分布形状直接求出样品中藻类活体细胞数。
Description
技术领域
本发明涉及资源与环境、海洋领域，尤其是一种基于可变荧光统计学分布的压载水藻类活体细胞数分析方法。
背景技术
海洋船舶压载水是世界上最大的非本土物种转移载体之一。这种大规模的海洋生物的移动引发的生物入侵事件频发，破坏了沿海生态系统，导致了生态和经济方面的巨大损失。为减少压载水排放造成的外来物种入侵，国际海事组织2004年通过了《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》，其中的D-2条例规定了船舶的压载水排放中活生物体密度的上限，该公约要求船舶排放的压载水中含有的生物密度必须符合：最小尺寸在10μm至50μm之间的活生物体少于10个每毫升。已有研究表明，10μm-50μm之间的浮游生物的优势物种为浮游藻类，浮游藻类是海洋中的初级生产者，如果浮游藻类密度很低其他生物也会因为缺少营养而死亡，因此浮游藻类密度是压载水水质控制的理想参数，活体藻细胞密度的检测对控制压载水达标排至关重要。
当前，对于压载水中活体浮游藻类的检测，通常有两种类型的方法即“精细型”分析方法和“指示性”分析方法。“精细型”分析方法包含：显微镜分析法、流式细胞仪等，这类方法可直接精确测量样品中生物体的数量，但是通常比较耗时，且需要专业的技术人员以及昂贵的设备。其中显微镜分析法比较准确，是目前国内压载水活体藻细胞数检测的常用的标准方法，但是很费时且需要进行复杂的前处理。流式细胞仪应用于活体浮游藻类检测时，由于只能测量固定荧光不能测量可变荧光，而死亡细胞也可以发出固定荧光，所以测量出来的活体细胞数总是比实际活体细胞数要高。“指示性”方法依靠各种指标来评估样品中活生物体数量，因不需要复杂前处理，可实现原位快速测量，实际应用更加广泛，包括检测细胞能量的ATP方法，检测酶活性的FDA方法(satake脉冲计数)以及依赖于浮游植物的光合作用的叶绿素荧光法。但是这些方法只能在设定特殊的临界情况下或者通过曲线定标校准方式估算活体生物量，测量结果往往不够精准。
其中，叶绿素荧光法依赖于浮游植物的光合作用，几乎不需要样品处理，适用于快速估算浮游植物生物量，已被证明是适用于压载水合规性检测的工具。叶绿素荧光法是通过光诱导藻类释放的叶绿素荧光动力学信号强度来检测活体细胞数。已有研究提出，由叶绿素荧光诱导动力学曲线得到的可变荧光Fv(Fv＝Fm–F0，Fm为饱和光下的最大荧光，F0是初始荧光)与藻类活体细胞数具有良好的相关性，在复杂的背景荧光环境干扰下，Fv可以不受背景荧光的干扰，精准定量活体细胞数。这是因为Fv仅由活细胞贡献，而死亡的藻细胞失去贡献可变荧光的能力从而只贡献F0和Fm。
当前，可变荧光法是利用可变荧光强度与活体细胞数的线性关系来反演藻类活体细胞数，测量结果准确性取决于单细胞可变荧光量(Single Cell VariableFluorescence，SCVF)。然而已有研究表明不同藻细胞的SCVF具体取决于细胞中叶绿素的含量以及细胞大小，10μm–50μm的细胞体积变化高达125倍，细胞的叶绿素含量可能由于光适应而变化5倍，由于养分限制而变化5倍，由此可见，藻细胞SCVF受藻种、藻的尺寸、生长周期影响显著，这是可变荧光法估算藻类活体细胞数的主要误差来源。因此可变荧光法准确定量测量藻类活体细胞数的前提是对每个样品SCVF进行标定，这给实际压载水中藻类活体细胞数检测带来很大挑战。Kroon B等人提出，进行线性校准以确定可变荧光Fv与参考类型的活体浮游植物细胞数量之间的关系，由于浮游植物细胞的叶绿素含量通常与细胞的体积成正比，基于这种关系，通过体积比较(细胞体积通过显微镜确定)，可以确定与参考类型细胞大小不同细胞的细胞数与可变荧光量的线性关系，从而由可变荧光量计算活体细胞数。这就需要在每次测量前使用显微镜测量样品中细胞大小来进行线性校准，过程繁琐。
天然水体浮游植物的复杂性给对压载水中的藻类活体细胞数定量带来了很大的挑战。受浮游藻类种类、尺寸、生长周期等因素影响，藻类单细胞可变荧光量存在明显差异，导致直接利用可变荧光强度求藻类活体细胞数存在巨大误差。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法，有效解决了藻细胞SCVF高度变化性对细胞计数的影响，能够在无需定标的情况下，准确检测不同种类、尺寸、生长周期藻类活体细胞数，为发展现场快速的压载水藻类活体细胞计数技术设备提供新途径。
本发明的方法应用于纯种藻液样品，可适用于各种不同藻类的纯种藻液样品，不同藻类导致的单个细胞荧光量的差异不对计数结果造成影响；
本发明的技术方案为：一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法，包括如下步骤：
步骤1、从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到多个子样本，所述子样本藻类活体细胞数服从泊松分布，近似为方差等于均值的正态分布；对于所述纯种均匀藻液样品，随机抽样得到的子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF均值是一致的，得到随机抽样子样本可变荧光Fv值也服从正态分布；
步骤2：选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；
步骤3、针对纯种藻液，根据子样本可变荧光Fv值的分布参数求解样品中活体藻细胞密度。
所述步骤1中，从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到的子样本中的藻类活体细胞数服从泊松分布，推理得到子样本藻类活体细胞数服从一个方差等于均值的正态分布。
所述步骤2中，选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；具体包括：
为了构建子样本可变荧光Fv值分布情况与样品活体藻细胞密度的关系，对子样本可变荧光Fv值进行统计分布，以子样本可变荧光Fv值的均值su作为区间中心，选择区间增量系数a确定中心区间范围(su-asu，su+asu)、区间大小2asu，统计得到子样本Fv值出现在中心区间的频率B，作为分布参数；其中，s为子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF；
使用子样本可变荧光Fv值分布的概率密度函数求积分，计算可变荧光Fv值出现在中心区间的概率，该概率值等于子样本可变荧光Fv值的中心区间频率B：
根据正态分布的性质对公式化简，并替换积分变量得到下式：
子样本可变荧光Fv值的中心区间频率等于子样本可变荧光Fv值的中心区间的概率，将B值带入上式，解出子样本活体藻细胞数均值u，子样本体积记为v mL，那么样品中的藻细胞密度为u/v cells/mL。
有益效果：
1、从均匀藻液样品中随机抽样得到的子样本中的藻类活体细胞数服从泊松分布，近似认为子样本藻类活体细胞数服从一个方差等于均值的正态分布；
2、子样本可变荧光Fv值等于子样本藻类活体细胞数乘以子样本单细胞可变荧光量(SCVF)均值，根据前提条件：均匀样品随机抽样得到的子样本中SCVF均值是一致的，则随机抽样子样本可变荧光Fv值也服从正态分布；
3、且一组数据统一乘上一个常数值，只影响它的数值大小，但是不影响它的分布形状，则子样本Fv值的分布形状与子样本细胞数的分布形状一致；
4、由于子样本细胞数服从方差等于均值的正态分布，所以子样本细胞数均值与其细胞数或可变荧光Fv值的分布形状一一对应，因此，可以通过子样本可变荧光Fv值的分布形状直接求出样品中藻类活体细胞数，且计算结果不受藻类SCVF大小的影响。
5、本发明的实验结果证明在浮游藻类单细胞可变荧光量变化高达44倍的情况下，可变荧光统计学分析方法计算出的活体藻细胞密度与显微镜检的活体藻细胞密度一致，两者线性拟合的相关系数均大于等于0.9478，有效解决了藻类单细胞可变荧光量大小对细胞计数结果的影响。
附图说明
图1不同细胞密度时子样本细胞数以及子样本Fv值分布形状；a：30cells/ml条件下子样本细胞数分布形状；b：60cells/ml条件下子样本细胞数分布形状；c：90cells/ml条件下子样本细胞数分布形状；d：30cells/ml、SCVF＝0.001子样本Fv分布形状；e：60cells/ml、SCVF＝0.001子样本Fv分布形状；f：90cells/ml、SCVF＝0.001子样本Fv分布形状；g：30cells/ml、SCVF＝0.01子样本Fv分布形状；h：60cells/ml、SCVF＝0.01子样本Fv分布形状；i：90cells/ml、SCVF＝0.01子样本Fv分布形状；
图2随机抽样子样本Fv分布图；
图3子样本Fv均值随海洋小球藻活体藻细胞密度变化图；
图4海洋小球藻镜检密度与统计分析法计算密度对比图；
图5子样本Fv均值随活体藻细胞密度变化图；
图6镜检密度与统计分析法计算密度对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
根据本发明的实施例，提出一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数检测方法，其分析流程主要包括以下三个步骤：
步骤1、从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到多个子样本，所述子样本藻类活体细胞数服从泊松分布；对于所述纯种均匀藻液样品，随机抽样得到的子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF均值是一致的，得到随机抽样子样本可变荧光Fv值也服从正态分布；
步骤2：选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；
步骤3、针对纯种藻液，根据子样本可变荧光Fv值的分布参数求解样品中活体藻细胞密度。
根据本发明的一个实施例，具体的，所述步骤1如下：
首先，子样本藻类活体细胞数服从一个方差等于均值的正态分布。
本发明从均匀纯种藻液样品中随机抽样得到的子样本中的藻类活体细胞数服从泊松分布，近似认为子样本藻类活体细胞数服从一个方差等于均值的正态分布；
如图1所示，为不同细胞密度时子样本细胞数以及子样本可变荧光Fv值分布形状，图1中的a-c为子样本细胞数分布形状；图1中的d-f为SCVF＝0.001子样本可变荧光Fv分布形状；图1中的g-h为SCVF＝0.01子样本可变荧光Fv分布形状。根据图1可知：子样本细胞数分布形状与子样本Fv分布形状一致，且细胞密度不变化时，SCVF不影响子样本Fv分布形状。
本发明中，若纯种藻液样品中的浮游藻类是随机分布的，样本中单个藻细胞出现的概率与样本的体积成正比，且两个及两个以上的藻细胞在一个很小的体积内的概率可以忽略不计，那么从均匀藻液样品中随机抽样得到的子样本中的藻类活体细胞数服从泊松分布。而泊松分布可以用方差等于均值的正态分布来近似，故近似认为子样本藻类活体细胞数服从一个方差等于均值的正态分布。子样本藻类活体细胞数的均值记为u，则在上述模型前提条件下，子样本中藻类活体细胞数服从泊松分布，近似为正态分布N(u，u)。
其次，子样本Fv值服从正态分布，说明如下：
本发明中提出前提条件：均匀样品随机抽样得到的子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量(SCVF)均值是一致的，均匀的纯种藻类必然满足，则随机抽样子样本Fv值也服从正态分布；
由于子样本的可变荧光Fv值等于子样本细胞数乘以子样本SCVF均值，那么在子样本SCVF均值一致的前提下，子样本Fv值必然服从正态分布。子样本中藻细胞的SCVF记为s，则子样本Fv值服从正态分布N(s×u，s2×u)；那么随机抽取子样本可变荧光Fv值分布的概率密度函数f(x)为：
所述步骤2：选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；
步骤3、针对纯种藻液，根据子样本可变荧光Fv值的分布参数求解样品中活体藻细胞密度。具体如下：
为了构建子样本可变荧光Fv值分布情况与样品活体藻细胞密度的关系，对子样本可变荧光Fv值进行统计分布，以子样本可变荧光Fv值的均值su作为区间中心，选择区间增量系数a确定中心区间范围(su-asu，su+asu)、区间大小2asu，统计得到子样本可变荧光Fv值出现在中心区间的频率B，作为分布参数。如图2所示，中心区间频率B就是子样本可变荧光Fv分布图的中心区间的高度。其中区间增量a是一个用于确定中心区间大小的系数，取值范围为0-1，不同的区间增量a有自己的优势密度范围，当样品密度在该密度范围时计算精度比较高，当区间增量a越小，优势密度越高，且可处理的密度上限越高，根据本发明的可选实施例，在后续实验数据处理中，a可定为0.06。
使用子样本可变荧光Fv值分布的概率密度函数求积分，计算可变荧光Fv值出现在中心区间的概率，该值等于子样本可变荧光Fv值的中心区间频率B：
根据正态分布的性质对公式化简，并替换积分变量得到下式：
上式可以看出，表示子样本单细胞可变荧光量(SCVF)均值的参数s在化简过程中被约分，所以由子样本可变荧光Fv分布求解样品中藻类活体细胞数不受样品SCVF影响。子样本Fv值的中心区间频率等于子样本Fv值的中心区间的概率，将B值带入上式，就可以解出子样本活体藻细胞数均值u。子样本体积记为v mL，那么样品中的藻细胞密度为u/vcells/mL。
将海洋小球藻接种后分别培养9天、12天、18天，进行不同生长周期藻类活体细胞数检测实验；将楯形多甲藻、威式海链藻、海洋小球藻接种后扩大培养一段时间(14-18天)，进行不同种类及细胞尺寸藻类活体细胞数检测实验。将这些藻类的藻液稀释为一系列密度梯度样品，利用显微镜染色镜检的方法得到镜检活体细胞密度，再利用搭建的实验系统测量得到一系列样品的Fv数据集，将数据集带入数学模型求出样品的计算密度，对比样品的镜检密度与计算密度。实验结果如下：
1、不同生长周期藻类活体细胞数检测
由藻液样品的子样本可变荧光Fv数据集求出样品的子样本可变荧光Fv均值，得到样品子样本可变荧光Fv均值与样品镜检活体藻细胞密度的关系，如图3所示。海洋小球藻处于不同的生长周期可变荧光量Fv与活体藻细胞密度的线性关系斜率不同，即SCVF不同。培养12天后SCVF最高，培养18天后SCVF最低，差异可达1.34倍。
通过可变荧光统计分析法得到的计算密度与镜检密度关于直线Y＝X进行线性拟合，如图4所示。得到的R2(R2指的是相关系数)分别为0.98647、0.98309和0.94786。说明该分析方法可行且有效，由于藻类处于不同生长周期造成的SCVF差异，不会影响可变荧光统计分析法计算样品中的活体藻细胞密度。
2、不同种类及细胞尺寸藻类活体细胞数检测
由藻液样品的子样本Fv数据集求出样品的子样本Fv均值，得到样品子样本Fv均值与样品镜检活体藻细胞密度的关系，如图5所示。楯形多甲藻、威式海链藻、海洋小球藻样品的可变荧光量Fv与活体藻细胞密度的线性关系斜率不同，可见三种藻类样品的藻细胞SCVF差异很大，楯形多甲藻的SCVF最高，海洋小球藻的SCVF最低，差异高达44倍。而在显微镜检过程中观察到3种藻类细胞大小差距较大，按照细胞尺寸从大到小排序，分别为：楯形多甲藻(甲藻)长约25um，宽约20um；威式海链藻(硅藻)直径约9um；海洋小球藻(绿藻)直径约3um。
通过可变荧光统计分析法得到的计算密度与镜检密度关于直线Y＝X进行线性拟合，如图6所示。得到的R2分别为0.98542、0.95776和0.97062。说明该分析方法可行且有效，由于藻类种类和细胞大小不同造成的SCVF差异，不会影响可变荧光统计分析法计算样品中的活体藻细胞密度。
实验结果证明在浮游藻类单细胞可变荧光量变化高达44倍的情况下，可变荧光统计学分析方法计算出的活体藻细胞密度与显微镜检的活体藻细胞密度一致，两者线性拟合的相关系数均大于等于0.9478，有效解决了藻类单细胞可变荧光量大小对细胞计数结果的影响。
尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，且应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (2)
1.一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到多个子样本，所述子样本藻类活体细胞数服从泊松分布；对于所述纯种均匀藻液样品，随机抽样得到的子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF均值是一致的，得到随机抽样子样本可变荧光Fv值也服从正态分布；
步骤2：选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；所述步骤2中，选取一个子样本可变荧光Fv值的分布参数，建立子样本可变荧光Fv值分布情况与样品藻细胞密度的关系；具体包括：
为了构建子样本可变荧光Fv值分布情况与样品活体藻细胞密度的关系，对子样本可变荧光Fv值进行统计分布，以子样本可变荧光Fv值的均值su作为区间中心，选择区间增量系数a确定中心区间范围(su-asu，su+asu)、区间大小2asu，统计得到子样本Fv值出现在中心区间的频率B，作为分布参数；其中，s为子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF；
使用子样本可变荧光Fv值分布的概率密度函数求积分，计算可变荧光Fv值出现在中心区间的概率，该概率值等于子样本可变荧光Fv值的中心区间频率B：
根据正态分布的性质对公式化简，并替换积分变量得到下式：
子样本可变荧光Fv值的中心区间频率等于子样本可变荧光Fv值的中心区间的概率，将B值带入上式，解出子样本活体藻细胞数均值u，子样本体积记为vmL，那么样品中的藻细胞密度为u/vcells/mL；
步骤3、针对纯种藻液，根据子样本可变荧光Fv值的分布参数求解样品中活体藻细胞密度。
2.根据权利要求1所述的一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法，其特征在于，所述步骤1中，从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到的子样本中的藻类活体细胞数服从泊松分布，推理得到子样本藻类活体细胞数服从一个方差等于均值的正态分布。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7679743B1 (en) * | 2008-01-31 | 2010-03-16 | Korea Atomic Energy Research Institute | Apparatus for measuring magnitude of deflected probe beam signal generated by laser-induced breakdown and method of measuring size of nanoparticles using frequency distribution curve of magnitude of probe beam deflection signal |
| CN103276045A (zh) * | 2013-05-18 | 2013-09-04 | 中国科学院南京地理与湖泊研究所 | 一种铜绿微囊藻的快速计数方法 |
| CN107543812A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-01-05 | 上海欧陆科仪有限公司 | 压载水活藻快速检测装置及其检测方法 |
| CN110088601A (zh) * | 2016-07-15 | 2019-08-02 | 切尔西科技集团 | 对光敏细胞进行计数 |
| JP2019165687A (ja) * | 2018-03-23 | 2019-10-03 | Ｊｆｅアドバンテック株式会社 | 特定種の植物プランクトンの存在量の算出方法及び算出装置、及び特定種の植物プランクトンによる赤潮発生の予兆検知方法及び予兆検知装置 |
| CN111610175A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-09-01 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种流通式浮游植物种类及细胞密度检测装置和检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102465271B1 (ko) * | 2018-12-13 | 2022-11-11 | 한국전자통신연구원 | 미세조류 측정 형광 센서 및 이의 동작 방법 |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7679743B1 (en) * | 2008-01-31 | 2010-03-16 | Korea Atomic Energy Research Institute | Apparatus for measuring magnitude of deflected probe beam signal generated by laser-induced breakdown and method of measuring size of nanoparticles using frequency distribution curve of magnitude of probe beam deflection signal |
| CN103276045A (zh) * | 2013-05-18 | 2013-09-04 | 中国科学院南京地理与湖泊研究所 | 一种铜绿微囊藻的快速计数方法 |
| CN110088601A (zh) * | 2016-07-15 | 2019-08-02 | 切尔西科技集团 | 对光敏细胞进行计数 |
| CN107543812A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-01-05 | 上海欧陆科仪有限公司 | 压载水活藻快速检测装置及其检测方法 |
| JP2019165687A (ja) * | 2018-03-23 | 2019-10-03 | Ｊｆｅアドバンテック株式会社 | 特定種の植物プランクトンの存在量の算出方法及び算出装置、及び特定種の植物プランクトンによる赤潮発生の予兆検知方法及び予兆検知装置 |
| CN111610175A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-09-01 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种流通式浮游植物种类及细胞密度检测装置和检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 基于叶绿素荧光动力学的压载水活体藻细胞数表征参数选择研究;华卉 等;《光学学报》;第41卷(第6期);第1-8页 * |
Also Published As
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