CN113861145A - 一种愈创木内酯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种愈创木内酯类化合物及其制备方法和应用，涉及化合物提取技术领域，一种愈创木内酯类化合物，其具有如下结构：
。本发明通过提取、Diaion HP‑20柱层析、硅胶柱色谱、Sephadex LH‑20葡聚糖凝胶柱层析及制备高效液相色谱等色谱方法，对毛华菊氯仿部位的化学成分进行分离纯化，制得2个愈创木内酯衍生物，即化合物1和化合物2，其结构新颖，对于HepG2细胞株具有较强的体外抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及化合物提取技术领域，具体是一种愈创木内酯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
毛华菊为菊科菊属植物，生长于河南、湖北、安徽等地海拔340 ～1500米低山山坡及丘陵地，其花入药或代茶饮，具有清热解毒的功效。毛华菊是参与菊花起源的重要近缘种，菊花作为我国传统的一味中药材，具有散风清热、平肝明目、清热解毒的作用，其主要的药效成分为黄酮、挥发油和苯丙素类化合物等，现代药理研究表明，菊花具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和保护肝脏等功效。
但是现有市场上关于菊花起源的重要近缘种毛华菊的化学成分及药理活性特别是抗肿瘤活性鲜有文献报道，为了对毛华菊的化学成分进一步研究，寻找结构新颖的具有抗肿瘤活性的天然产物。因此，本领域技术人员提供了一种愈创木内酯类化合物及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种愈创木内酯类化合物及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种愈创木内酯类化合物，其具有如下结构：
MTT实验表明该化合物对肝癌细胞HepG2的增殖具有较强的抑制作用，具有显著的抗肿瘤活性。
作为本发明进一步的方案：一种愈创木内酯类化合物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：取毛华菊干燥全草，粉碎，95%乙醇室温下渗漉提取，合并提取液，减压浓缩得总浸膏；
S2：加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，正丁醇部位；
S3：氯仿部位上Diaion HP-20大孔树脂柱，依次用0%、20%、40%、60%、80%、90%、100%甲醇-水体系洗脱，将以上各洗脱液置旋转蒸发仪上浓缩；
S4：经80%甲醇洗脱部分进行正相硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱检测合并，得到21个组分，记作Fr.1～Fr.21；
S5：将上述Fr.10经葡聚糖凝胶LH-20柱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇洗脱，得到2个组分，Fr.a-1和Fr.a-2；
S6：将上述Fr.a-1经制备高效液相色谱，得到化合物1、化合物2。
所述步骤S4中石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0、10:1、5:1、3:1、2:1、 1:1、1:3、0:1。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤S4中石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:3、0:1。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤S5中石油醚-二氯甲烷-甲醇的体积比为4:5:1。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤S6制备高效液相色谱中甲醇-四氢呋喃-水的体积比为5:5:90，流速为17.0mL/min。
一种愈创木内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物可用于肝癌的治疗。该化合物对肝癌细胞HepG2的增殖具有较强的抑制作用，体外具有显著的抗肿瘤活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了一种愈创木内酯类化合物及其制备方法和应用，本发明通过提取、Diaion HP-20柱层析、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析及制备高效液相色谱等色谱方法，对毛华菊氯仿部位的化学成分进行分离纯化，制得2个愈创木内酯衍生物，即化合物1和化合物2，其结构新颖，对于HepG2细胞株具有较强的体外抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为化合物1对HepG2细胞增值的抑制作用；
图2为化合物2对HepG2细胞增值的抑制作用 ；
图3为阳性对照顺铂对HepG2细胞增值的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明附图及实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，
实施例1
仪器与材料：
AV-400 MHz超导核磁共振仪（德国Bruker公司）；SolariX 7.0T高分辨傅里叶变换质谱仪（德国Bruker公司）；Nicolet iS50R傅里叶变换红外光谱仪（美国ThermoScientific公司）；2535制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；制备高效液相色谱色谱柱XBridgeTM Prep C18柱（250 mm×19 mm，5μm）（美国Waters公司）；1260分析型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；分析型高效液相色谱柱XBridgeTM Prep C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）（美国Waters公司）；Milli-Q Integral 5型纯水仪（德国Merck Millipore公司）；R-210型旋转蒸发仪（瑞士Büchi公司生产）；miVac Quattro真空离心浓缩仪（英国GeneVac公司）；氘代试剂：CDCl3（美国CIL公司）；色谱纯甲醇（美国Thermo FisherScientific公司）；色谱纯四氢呋喃（上海星可高纯溶剂有限公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（瑞典GE公司）；Diaion HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱公司）；200 ～ 300目硅胶（青岛海洋化工厂）；氯仿和甲醇等均为国产分析纯试剂（湖北欣申试化工科技有限公司）。
毛华菊于2017年7月采自于湖北省英山县李家寨，由湖北第二师范学院化学与生命科学学院戴月副教授鉴定为菊科菊属植物毛华菊。
本发明提供的一种愈创木内酯类化合物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：取毛华菊干燥全草4000g，粉碎，95%乙醇20L室温下渗漉提取，合并提取液，减压浓缩得总浸膏1000g；
S2：加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位85g、氯仿部位134g、乙酸乙酯部位82g，正丁醇部位158g；
S3：氯仿部位上Diaion HP-20大孔树脂柱，依次用0%、20%、40%、60%、80%、90%、100%甲醇-水体系洗脱，将以上各洗脱液置旋转蒸发仪上浓缩；
S4：经80%甲醇洗脱部分（25.33g）进行正相硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，其中，石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:3、0:1，薄层色谱（TLC）检测合并，得到21个组分，记作Fr.1～Fr.21；
S5：将上述Fr.10（1.004g）经葡聚糖凝胶LH-20柱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇洗脱，石油醚-二氯甲烷-甲醇的体积比为4:5:1，得到2个组分，Fr.a-1和Fr.a-2；
S6：将上述Fr.a-1（314.1mg）经制备高效液相色谱，其中，甲醇-四氢呋喃-水的体积比为5:5:90，流速为17.0mL/min，得到化合物1（3.2 mg，tR = 76.0 min）、化合物2（9.8mg，tR = 60.0 min）。
化合物1、化合物2的结构为：
实施例2
化合物1、化合物2的结构鉴定：
化合物1：白色针状晶体，易溶于氯仿。IR（KBr，cm-1）vmax:2922，1764，1748，1693，1616，1228，1153，1031，959；HR-ESI-MS显示分子式为C17H20O5（calcd.forC17H20NaO5[M+Na]+327.12029，found327.12017），不饱和度为8。13CNMR和DEPT谱显示，该化合物结构中含有17个碳信号，包括3个CH3、2个CH2、7个CH和5个C（参见表1）。IR光谱中显示出γ-内酯（1764cm-1）、α，β-不饱和羰基（1693cm-1）和双键（1616cm-1）的特征信号。1HNMR谱中显示的两个二重峰信号[δH6.35（1H，d，J=3.4Hz）]和[δH5.84（1H，d，J=3.4Hz）]是α-亚甲基-γ-倍半萜内酯环外亚甲基氢的特征吸收峰。1HNMR谱还显示有一个二重峰甲基氢[δH0.95（3H，d，J=7.6Hz）]、一个乙烯基甲基氢[δH2.32（3H，brs）]和一个烯氢[δH6.08（1H，brs）]信号。1H-1HCOSY谱中相关信号显示[δH2.77（1H，dd，J=7.2，4.0Hz，H-1），δH3.16-3.20（1H，m，H-5），δH4.37（1H，dd，J=10.8，9.2Hz，H-6），δH3.08-3.14（1H，m，H-7），δH5.14（1H，td，J=10.0，4.4Hz，H-8），δH1.72（1H，ddd，J=14.0，9.6，2.4Hz，H-9α），δH2.57-2.65（1H，m，H-10），δH0.95（3H，d，J=7.6Hz，H-14）]偶合体系。HMBC图谱中显示下列远程相关信号：[δH6.35（H-13）]和[δC135.4（C-11），49.0（C-7），169.0（C-12）]；[δH1.72（H-9α）]和[δC16.7（C-14），71.7（C-8）]；[δH2.27（H-9β）]和[δC49.0（C-7），71.7（C-8），53.3（C-1）；30.7（C-10）]；[δH3.16-3.20（H-5）]和[δC78.3（C-6），178.3（C-4）]。这些相关信号表明化合物1为愈创木烷型的倍半萜骨架。[δH6.08（H-3）]和[δC52.4（C-5），207.9（C-2）]之间得远程相关信号表明该化合物为具有3-烯-2-酮结构的愈创木内酯。化合物1的结构中有一个乙酰基片段[δH2.14（s，3H）；δC21.2，169.6]，在HMBC谱中，[δH5.14（H-8）]与乙酰基羰基碳[δC169.6（C-16）]有相关信号，且C-8出现在低场区（δC=71.7），推测C-8与乙酰基通过氧原子相连成酯。这样，化合物1的平面结构确定为8-乙酰氧基-愈创木-3，11（13）-二烯-2-酮-12，6-内酯。化合物1的相对构型可以通过NOESY谱进行确认。在化合物1的NOESY谱中，H3-14与H-6和H-8有相关信号，H-7与H-5、H-5和H-1、H-1和H-10有相关信号，因此H3-14和H-6、H-8在同一侧，H-7、H-1、H-5和H-10在另一侧。由于在天然愈创木内酯类化合物中，H-7为α构型，因此H-1、H-5和H-10为α构型，H-6和H-8为β构型。因此，化合物1确认为8α-乙酰氧基-愈创木-3，11（13）-二烯-1α，5α，6β，7α，10α氢-2-酮-12，6α-内酯，化合物1的绝对构型是通过X-ray单晶衍射来确定的，最终，化合物1被鉴定为（1S，5R，6R，7R，8S，10S）-8-乙酰氧基-愈创木-3，11（13）-二烯-2-酮-12，6-内酯。经Scifinder检索，化合物1的氢谱全谱、碳谱以及绝对构型为本文首次报道。
化合物1的X-射线单晶衍射数据：在正己烷-二氯甲烷（10:1）中获得晶体，从中选取一外形大小为0.4mm×0.14mm×0.1mm的单晶用于X-射线衍射实验，在XtaLABAFC12（RINC）:Kappasingle衍射仪上采用CuKα射线（λ=1.54184Å）在3.709°≤θ≤73.510°范围内进行扫描，在100.00（10）K下共收集到15615个反射点，其中3006个为独立可观察反射[I≥2σ（I）]，R（int）=0.0241，R（sigma）=0.0147。化合物1属正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数：a=6.51852（4）Å，b=9.71526（5）Å，c=23.84303（13）Å，α=90°，β=90°，γ=90°，V=1509.957（14）Å3；Z=4，Dcalcd=1.339g/cm3，μ（CuKα）=0.811mm-1，F（000）=648.0。晶体结构采用Olex2软件，SHELXT程序包解析，用最小二乘法对结构参数进行校正，最终的偏离因子为Rf=0.0263，wR=0.0682，其最大与最小的电子密度峰的高度分别为0.19，-0.15e/Å-3，flack参数为0.02（4）。
化合物2：白色针状晶体，易溶于氯仿。IR（KBr，cm-1）vmax:2937，1775，1736，1699，1618，1245，1028，1006，962；HR-ESI-MS显示分子式为C17H22O5（calcd.forC17H22NaO5[M+Na]+329.13594，found329.13577），不饱和度为7。通过对比发现，化合物2和化合物1结构类似，后者仅比前者多了两个氢原子，不饱和度减少了1；化合物2比化合物1多了一个甲基氢[δH1.35（d，J=7.2Hz，3H）]和一个次甲基氢[δH2.13-2.18（m，1H）]信号，少了两个烯氢信号[δH6.35（d，J=3.4Hz，1H），5.84（d，J=3.4Hz，1H）]，这两个烯氢二重峰信号是α-亚甲基-γ-倍半萜内酯环外亚甲基氢的特征吸收峰；另外，化合物2比化合物1多了一个甲基碳（δC16.0）和一个次甲基碳（δC54.7）信号，少了两个烯碳（δC124.9，135.4）信号，其中一个烯碳（δC135.4）为季碳信号。通过以上分析，推断化合物2为化合物1的11、13位碳氢化的代谢产物，HMBC谱中显示H3-13同C-7/C-11/C-12相关可以进一步证实这个推断。这样，化合物2的平面结构确定为8-乙酰氧基-愈创木-3-烯-2-酮-12，6-内酯。化合物2的相对构型可以通过NOESY谱进行确认。天然愈创木内酯类化合物中，H-7为α构型，在NOESY谱中，H-7和H3-13有相关信号，H-11和H-8，H-8和H-6、H3-14有相关信号，因此H-11、H-8、H-6和H3-14在同一侧，均为β构型；H-10和H-1，H-1和H-5有相关信号，因此H-10、H-1和H-5在同一侧，均为α-构型。因此，化合物2确认为8α-乙酰氧基-愈创木-3-烯-1α，5α，6β，7α，8β，10α，11β氢-2-酮-12，6α-内酯。化合物2的绝对构型是通过X-ray单晶衍射来确定的，最终，化合物2被鉴定为（1S，5R，6R，7R，8S，10S，11S）-8-乙酰氧基-愈创木-3-烯-2-酮-12，6-内酯，经Scifinder检索，为一个新的愈创木型倍半萜内酯类化合物。NMR数据详见下表1。
表1 CDCl3中化合物1和2的1H-NMR (400 MHz) 和13C-NMR (100 MHz) 数据
化合物2的X射线单晶衍射数据：在正己烷-二氯甲烷（10:1）中获得晶体，从中选取一外形大小为0.4mm×0.18mm×0.14mm的单晶用于X-射线衍射实验，在XtaLABAFC12（RINC）:Kappasingle衍射仪上采用CuKα射线（λ=1.54184Å）在6.51°≤2θ≤147.98°范围内进行扫描，在100.00（10）K下共收集到57937个反射点，其中9411个为独立可观察反射[I≥2σ（I）]，R（int）=0.0453，R（sigma）=0.0208。化合物1属单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：a=13.64468（7）Å，b=7.11407（4）Å，c=24.71512（13）Å，α=90°，β=95.7084（5）°，γ=90°，V=2387.18（2）Å3；Z=2，Dcalcd=1.279g/cm3，μ（CuKα）=0.770mm-1，F（000）=984.0。晶体结构采用Olex2软件，SHELXT程序包解析，用最小二乘法对结构参数进行校正，最终的偏离因子为Rf=0.0344，wR=0.0798，其最大与最小的电子密度峰的高度分别为0.20，-0.15e/Å-3，flack参数为-0.01（6）。
实施例3
化合物1、化合物2的生物活性测试：
采用MTT法测试化合物1和2对人肝癌细胞系HepG2增值的影响，并以顺铂作为阳性对照。
具体测试方法为：在10cm培养皿中，培养细胞至对数生长期，用1mL胰蛋白酶消化并离心收集细胞，细胞计数板计数后将细胞稀释成5×104cells/mL，接种至96孔板，每孔100μL，用5%CO2培养箱37℃培养过夜后，每孔加入经培养基稀释至2倍终浓度的待测样品，使药物的终浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μmol•L-1，每个浓度设置4个复孔，继续培养24h后，每孔加入20μLMTT溶液（0.5%MTT），继续培养4h。培养结束后，吸去上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡至结晶物完全溶解，使用酶标仪在490nm处检测吸光值，计算细胞的生长抑制率：
细胞抑制率/%=（1-空白组吸光度值/实验组吸光度值）×100%。
以样品浓度的对数值为横坐标，以细胞存活率为纵坐标，作回归曲线(图1～3)，并采用GraphPadPrism5.0Software计算各样品对细胞生长的半数抑制浓度(IC50)。
评价标准：抗肿瘤药物疗效的评价之一，合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC50＜10μM，或植物粗提物的IC50＜20μg/mL，并且有细胞毒性的剂量依赖关系，且最高抑制效率应达80%以上，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。
测试结果为：参见图1～3，化合物1和2对肝癌细胞HepG2的增殖具有较强的抑制作用，具有剂量依赖关系，其中化合物1对肝癌细胞HepG2的增殖作用强于化合物2，其半数抑制浓度IC50值分别为5.95μmol/L和8.99μmol/L，阳性对照顺铂的IC50值为6.31μmol/L，数据显示化合物1对肝癌细胞HepG2的增殖作用强于阳性对照顺铂。
综上所述，化合物1和2对肝癌细胞HepG2的增殖具有较强的抑制作用，体外具有显著的抗肿瘤活性，用作抗肿瘤药物时可用于肝癌的治疗。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种愈创木内酯类化合物，其特征在于：其具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的一种愈创木内酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：取毛华菊干燥全草，粉碎，95%乙醇室温下渗漉提取，合并提取液，减压浓缩得总浸膏；
S2：加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，正丁醇部位；
S3：氯仿部位上Diaion HP-20大孔树脂柱，依次用0%、20%、40%、60%、80%、90%、100%甲醇-水体系洗脱，将以上各洗脱液置旋转蒸发仪上浓缩；
S4：经80%甲醇洗脱部分进行正相硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱检测合并，得到21个组分，记作Fr.1～Fr.21；
S5：将上述Fr.10经葡聚糖凝胶LH-20柱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇洗脱，得到2个组分，Fr.a-1和Fr.a-2；
S6：将上述Fr.a-1经制备高效液相色谱，得到化合物1、化合物2。
3.根据权利要求2所述的一种愈创木内酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:3、0:1。
4.根据权利要求2所述的一种愈创木内酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中石油醚-二氯甲烷-甲醇的体积比为4:5:1。
5.根据权利要求2所述的一种愈创木内酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤S6制备高效液相色谱中甲醇-四氢呋喃-水的体积比为5:5:90，流速为17.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种愈创木内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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