CN113845586A - 一种液相合成乙酰基六肽-8的方法 - Google Patents

一种液相合成乙酰基六肽-8的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种液相合成乙酰基六肽‑8的方法，本发明首先采用液相合成三个二肽单体：Ac‑Glu(O‑tBu)‑Glu(O‑tBu)‑OH、H‑Met‑Gln(Trt)–OH和H‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑NH2，然后再顺序合成四肽和六肽的策略合成乙酰基六肽‑8。本发明方案扩大了合成规模，减少了有机溶剂的使用，降低了乙酰基六肽‑8的生产成本，有利于乙酰基六肽‑8在化妆品行业的推广应用。

Description

一种液相合成乙酰基六肽-8的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种乙酰基六肽-8的制备方法。
技术背景
乙酰基六肽-8，别称阿基瑞林，英文名Argireline。乙酰基六肽-8参与竞争 SNAP-25在融泡复合体的位点，从而影响复合体的形成；当融泡复合体稍有不稳定，囊泡不能有效释放神经递质，从而致使肌肉收缩减弱，防止皱纹的形成。所以它可以遏制神经传导素乙酰胆碱的释放，减弱肌肉的收缩，从而减少动态纹表情纹，减少皱纹产生，增加弹力蛋白的活性，维持表皮更新能力使肌肤光滑紧致，挑战逆转肌龄，展示肌肤年轻光彩。
乙酰基六肽-8是一种仿生肽，为模仿SNAP-25蛋白的N端并由六个氨基酸组成的寡肽。他的多肽结构来源于人体自身的SNAP-25（突触小体相关蛋白）端的一个片段，并进行了一些化学修饰，其具体的序列为：Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，CAS号：616204-22-9，分子式：C34H60N14O12S，分子量：888.91。结构中含有六个氨基酸残基，为化学合成获得的一种短肽产品。
专利CN103694316B公开了一种阿基瑞林的固相制备方法，采用氨基树脂为固相载体，利用Fmoc化学策略制备得到阿基瑞林（乙酰基六肽-8），此方法的合成受到固相合成规模的限制，难以规模化放大生产，不利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。
乙酰基六肽-8，作为当前应用最广的祛皱明星功效活性成分，市场需求量逐年增加，现有的固相合成工艺，需要消耗大量的有机溶剂，从而导致生产成本居高不下，而且给生产企业带来较大的环保压力，所以开发适合规模化生产乙酰基六肽-8的制备工艺尤为重要。本申请的技术方案采用液相法合成乙酰基六肽-8，扩大了合成规模，减少了有机溶剂的使用，降低了乙酰基六肽-8的生产成本，有利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。
发明内容
为解决合成过程中存在的以上问题，本发明提供了一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，本发明提供的技术方案如下：
一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Ac-Glu(O-tBu)-OSu和H-Glu(O-tBu)-OH为原料,在碱性条件下合成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH，然后制备成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu;
(b)采用Z-Met-OSu和H-Gln(Trt)-OH为原料,在碱性条件下合成Z-Met-Gln(Trt)–OH,然后脱掉保护基Z,得到H-Met-Gln(Trt) –OH;
(c)采用Z-Arg(Pbf)-OH和H-Arg(Pbf)-NH2为原料，在偶联剂存在下反应得到Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2，然后脱掉保护基Z,得到H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2;
(d)采用Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu和H-Met-Gln(Trt) –OH在碱性条件下合成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt) –OH；
(e)Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)–OH和H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2在偶联剂存在下反应得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)–Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2；
(f)Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2脱掉侧链保护基团，经纯化，冻干得到乙酰基六肽-8精肽。
优选的，步骤(a)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Glu(O-tBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Ac-Glu (O-tBu)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到二肽Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH。
优选的，步骤(a)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu的具体操作步骤为：
将Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH和HOSu溶解于溶剂C中，低温搅拌下加入DCC/溶剂C的溶液，TLC监测终点，经过滤、浓缩、析晶、重结晶得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu。
优选的，步骤(b)中，制备Z-Met-Gln(Trt) –OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Gln(Trt)-OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Z-Met-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到二肽Z-Met-Gln(Trt) –OH。
优选的，步骤(c)中，制备Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的具体操作步骤为：将H-Arg(Pbf)-NH2溶解在溶剂C中，低温浴下加入Z-Arg(Pbf)-OH/偶联剂/溶剂C的混合溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,TLC监测反应终点；经浓缩、析晶、重结晶，得到二肽Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2。
优选的，步骤(d)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt) –OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Met-Gln(Trt) –OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到四肽Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)–Met-Gln(Trt) –OH。
优选的，步骤(e)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2的具体操作步骤为：将H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2溶解在溶剂C中，低温浴下加入Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-OH/偶联剂/溶剂C的混合溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,TLC监测反应终点；经浓缩、析晶、重结晶，得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2。
优选的，步骤（f）中,脱掉侧链保护基团试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和TIS中的一种或几种；更为优选的裂解试剂配比为：TFA/苯甲硫醚/水/TIS=87/5/3/5。
优选的，步骤(b)和步骤(c)中，保护基Z的脱保护试剂为H2/10%钯-碳催化剂或甲酸/10%钯-碳催化剂。
优选的，本发明上述步骤中，所述的碱A溶解在溶剂B中配成的碱性溶液，可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾等水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；同时也可以是三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺等有机碱的有机溶液。
所述的溶剂C可以是四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液；所述的偶联剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/ DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本申请的技术方案采用液相2+2+2策略合成乙酰基六肽-8，扩大了合成规模，减少了有机溶剂的使用，降低了乙酰基六肽-8的生产成本，有利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
tBu：叔丁基；
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；
Trt：三苯甲基；
DCM：二氯甲烷；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
DIPEA ：N,N-二异丙基乙胺；
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺；
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；
TFA：三氟乙酸；
TIS：三异丙基硅烷；
Su：琥珀酰亚胺基。
实施例1：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH的合成
准确称取H-Glu(O-tBu)-OH4.06Kg(20mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Ac-Glu(OtBu)-OSu 6.84kg(20mol)/25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.1%的二肽单体Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH7.02kg,收率81.6%。
实施例2：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu的合成
准确称取Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH 7.00kg(16.28mol)和HOSu2.30kg(20mol)于100L反应釜中，加入四氢呋喃25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入DCC4.66kg (20mol)/25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经过滤、减压浓缩、析晶、重结晶，25L四氢呋喃复溶待用。
实施例3：Z-Met-Gln(Trt) –OH的合成
准确称取H-Gln(Trt)-OH7.77Kg(20mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Z-Met-OSu 7.61kg(20mol)/25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体Z-Met-Gln(Trt) –OH11.05kg,收率82.2%。
实施例4：H-Met-Gln(Trt)–OH的合成
准确称取Z-Met-Gln(Trt)–OH11.00Kg(16.4mol)于100L反应釜中，加入30升甲醇溶解，加入1.10kg 10%钯-碳催化剂/10L甲醇，然后加入6.56kg甲酸/10L甲醇,搅拌反应，TLC监测终点；经过滤、浓缩、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体H-Met-Gln(Trt)–OH8.21kg,收率96.1%。
实施例5：Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的合成
准确称取H-Arg(Pbf)-NH29.50Kg(20mol)于100L反应釜中，加入四氢呋喃25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Z-Arg(Pbf)-OH·CHA13.20kg(20mol)、DIC 2.28kg(20mol)、HOBT2.70kg(20mol)、25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH215.71kg,收率81.2%。
实施例6：H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的合成
准确称取Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH215.70kg(16.23mol)于100L反应釜中，加入30升甲醇溶解，加入1.60kg 10%钯-碳催化剂/10L甲醇，然后加入6.56kg甲酸/10L甲醇,搅拌反应，TLC监测终点；经过滤、浓缩、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH213.06kg,收率96.4%。
实施例7：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)–OH的合成
准确称取H-Met-Gln(Trt)–OH8.20Kg(15.76mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入实施例2所得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度98.1%的四肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-OH11.78kg,收率80.2%。
实施例8：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的合成
准确称取H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH213.05Kg(15.64mol)于100L反应釜中，加入四氢呋喃30L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入：
（1）Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-OH 11.77kg (12.64mol)，
（2）DIC1.71kg(15mol)，
（3）HOBT2.03kg(15mol)，
（4）25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、析晶、重结晶、干燥，得纯度95.1%的六肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH217.80kg,收率80.6%。
实施例9：Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2的制备
将实施例8得到的17.80kg六肽：
Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2，加入到冷冻的50L裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20=87 /5/3/5)中，室温下搅拌反应4h；反应结束，料液中加入500L冷冻甲叔醚，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽11.05kg,粗肽收率98.6%，纯度93.6%。
实施例10：乙酰基六肽-8精肽的制备
将实施例9所得粗肽溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤后，用内径为200mm C18制备柱，经纯化、转盐，冻干后得乙酰基六肽-8精肽9.15kg，纯度99.91%，收率82.8%。

Claims (10)

1.一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Ac-Glu(O-tBu)-OSu和H-Glu(O-tBu)-OH为原料,在碱性条件下合成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH，然后制备成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu;
(b)采用Z-Met-OSu和H-Gln(Trt)-OH为原料,在碱性条件下合成Z-Met-Gln(Trt) –OH,然后脱掉保护基Z,得到H-Met-Gln(Trt) –OH;
(c)采用Z-Arg(Pbf)-OH和H-Arg(Pbf)-NH2为原料，在偶联剂存在下反应得到Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2，然后脱掉保护基Z,得到H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2;
(d)采用Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu和H-Met-Gln(Trt) –OH在碱性条件下合成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt) –OH；
(e)Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)–OH和H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2在偶联剂存在下反应得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)–Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2；
(f)Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2脱掉侧链保护基团，经纯化，冻干得到乙酰基六肽-8精肽。
2.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Glu(O-tBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Ac-Glu (O-tBu)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到二肽Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH。
3.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu的具体操作步骤为：将Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH和HOSu溶解于溶剂C中，低温搅拌下加入DCC/溶剂C的溶液，TLC监测终点，经过滤、浓缩、析晶、重结晶得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu。
4.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，制备Z-Met-Gln(Trt) –OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Gln(Trt)-OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Z-Met-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到二肽Z-Met-Gln(Trt) –OH。
5.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，制备Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的具体操作步骤为：将H-Arg(Pbf)-NH2溶解在溶剂C中，低温浴下加入Z-Arg(Pbf)-OH/偶联剂/溶剂C的混合溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,TLC监测反应终点；经浓缩、析晶、重结晶，得到二肽Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2。
6.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(d)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt) –OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Met-Gln(Trt) –OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到四肽Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)–Met-Gln(Trt) –OH。
7.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(e)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2的具体操作步骤为：将H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2溶解在溶剂C中，低温浴下加入Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-OH/偶联剂/溶剂C的混合溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,TLC监测反应终点；经浓缩、析晶、重结晶，得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2。
8.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤（f）中,脱掉侧链保护基团试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和TIS中的一种或几种；更为优选的脱保护试剂配比为：TFA/苯甲硫醚/水/TIS=87/5/3/5。
9.根据权利要求1所述一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述步骤(b)和步骤(c)中，保护基Z的脱保护试剂为H2/10%钯-碳催化剂或甲酸/10%钯-碳催化剂。
10.根据权利要求2-9任一项权利要求所述的液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，所述的碱A溶解在溶剂B中配成的碱性溶液，是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；或者是三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺等有机碱的有机溶液；
所述的溶剂C是四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液；
所述的偶联剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/ DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
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