CN113840621A

CN113840621A - 疫苗接种及抗体生成平台

Info

Publication number: CN113840621A
Application number: CN201980070476.3A
Authority: CN
Inventors: 尼娜·帕帕瓦西利乌; 哈米德雷萨·哈希米; 吉安娜·特里列; 艾瑞克·斯特宾斯; 奥布里·米勒; 安德里亚斯·鲍曼
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2021-12-24
Also published as: JP2023159175A; US20210401956A1; AU2019363713A1; WO2021214043A1; EP3811969A1; WO2020084072A1; EP4138885A1; CA3117433A1; JP7379480B2; CN117899209A; AU2021260042A1; JP2023522698A; US20230165953A1; EP3870216A1; JP2022512794A; CA3171978A1

Abstract

本发明基于用于疫苗接种和/或抗体生成的平台。本发明基于在锥体虫的变异体表面糖蛋白(VSG)的包被上展示小分子免疫原性化合物，当用作疫苗或用于抗体生成的免疫接种中时，其引起高效的免疫应答。本文公开的抗原颗粒可用于产生抗体或可以直接用作用于治疗各种医学病症的疫苗。最优选地本发明涉及对依赖性物质具有特异性的基于VSG的疫苗，其用于治疗在药物滥用期间的成瘾或避免不利事件。其他应用包括涉及用于治疗或预防癌症、传染性疾病、传染性神经系统变性疾病、非传染性疾病(例如某些神经系统变性疾病、过敏)以及任何病症的所公开的化合物和组合物的方法和用途、或需要由疫苗接种或抗体使用产生的免疫应答的工业用途。

Description

疫苗接种及抗体生成平台

技术领域

本发明基于疫苗接种和/或抗体生成的平台。本发明基于在锥体虫的变异体表面糖蛋白(VSG)的包覆上展示小分子免疫原性化合物，当用作疫苗或在免疫中用于产生抗体时，其导致高效的免疫应答。本文公开的抗原颗粒可用于产生抗体或可直接用作治疗各种医学病症的疫苗。最优选本发明涉及对依赖性物质具有特异性的基于VSG的疫苗，其用于治疗在药物滥用期间的成瘾或避免不利事件。其他应用包括涉及所公开的化合物和组合物的方法和用途，其用于治疗或预防癌症、传染性疾病、传染性神经系统变性疾病、非传染性疾病(例如某些神经系统变性疾病、过敏)以及任何需要由疫苗接种或抗体使用产生的免疫应答的病症或工业用途。

描述

药物的滥用和成瘾给个人及其家庭以及社会整体的医疗、社会和经济健康带来了重大问题。特别是在美国，处方阿片样止痛药如

和

的滥用已经达到了流行的程度，并且现在是严肃关注的公共健康危机。在其他地区(例如亚洲、非洲和中东)，曲马多的滥用正在迅速上升(UNODC World Drug Report 2017)。这些药物的相对可获得性、感知安全性以及医疗处方者对这些药物的过度处方影响了社会每个方面。

成瘾性的途径通常来自医学认可的疼痛管理施用；然而，对于相当一部分人口(估计为10％至15％)，这会很快导致成瘾，然后导致非法使用处方阿片样物质。特别令人关注的是青少年普遍流行非法使用这些药物，和迅速增加的急诊(在2009年达到120万；2010年DAWN报导)，以及由滥用造成的致命的用药过量(由用药过量造成的死亡在2017年估计为72000例，首次超过了由乳腺癌造成的死亡，并且看不到尽头)。目前，治疗方案仅限于康复治疗/脱瘾诊所中有监督的、经调节的控制戒断(例如，使用美沙酮或叔丁啡)。

洛克菲勒大学开发的用于治疗海洛因成瘾的美沙酮维持对嗜瘾疾病仍是最有效和最广泛使用的药物治疗(Dole等人，1966；Kreek，2000)。但是治疗通常需要数年并且保持率很差，首先增加了对附加选项和/或防止滥用的兴趣。

已出现的用于成瘾的一种方法是产生针对特定药物靶标的中和抗体的疫苗(Shen等人，2012)，其是针对可卡因探索最为广泛的(Fox等人，1996；Shen和Kosten，2011)以及对海洛因衍生物最近的(Pravetoni及其同事，2012、2017和2018)一种选择。免疫疗法治疗阿片样物质使用障碍(或至少防止用药过量)的想法基于以下概念：如果与载体蛋白缀合的药物可以引起长期的免疫应答，其中产生针对药物化学结构的抗体，则在使用者施用时循环抗体可以与药物结合，防止药物到达大脑的作用位点。

虽然理论上可以实现，实际上，这种方法存在关键问题：普遍缺乏产生针对小分子的中和抗体的有效方法。因此，产生针对小分子例如可卡因、尼古丁或氧可酮的常用方法(例如分子与载体蛋白如KLH和破伤风类毒素的缀合)不是特别有效(Kantak等人，2003)。已进入临床试验阶段的可卡因疫苗的开发结果是一个很好的例子(Martell等人，2009)。在2b临床试验阶段，缀合的可卡因作为半抗原引起免疫应答的能力因个体而异，并且仅38％的接种疫苗获得了有用的IgG水平，并且它们仅充分地阻断可卡因2个月。而且，在产生免疫应答的人中，产生的抗体的水平显示出相当大的可变性(Martell等人，2009)。

与阿片样物质更相关的Pravetoni及其同事进行的研究(2012、2017、2018)表明了针对氧可酮的主动免疫的有效性：在氧可酮与牛血清白蛋白或KLH缀合并注射到大鼠体内后，该研究表明了通过低剂量氧可酮的抗体结合和中和来防止到达大脑，其中伴随着在痛觉缺失的大鼠模型中氧可酮的药代动力学和效力的改变。该研究提供了当抗体结合氧可酮时它们可以将其从血液中除去的原理的证据。

同时，这些研究强调了以下问题：即，尽管产生针对滥用药物的中和抗体是可行的，并且当实现时，具有主要治疗结果，但是用于产生针对作为滥用药物的这些小分子的mAb(单克隆抗体)的方法是无效的。

J.Immunol.Methods.2010年10月31日；362(1-2)：190-4描述了使用VSG221(也称为VSG 427-2)作为用于展示针对抗体生成的异源肽表位(其序列被遗传插入VSG)的蛋白质平台。

本发明的目的是提供疫苗和抗体生成平台，其允许生成靶向小分子化合物/靶标的疫苗和/或抗体。本发明的另一个目的是为疾病提供治疗方案，其将从疫苗接种或其他免疫疗法中获益。本发明的最终目的是提供通过用于工业应用的疫苗接种所生成的抗体或其他免疫产品。

发明内容

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，但应理解的是，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建另外的实施方案。不同描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应理解为支持和包括了将两个或多于两个明确描述的实施方案组合或将一个或多于一个明确描述的实施方案与任何数量的公开/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的说明书中公开了本申请中所有描述的要素的任何排列和组合。

通过经工程化的变异体表面糖蛋白(eVSG)包覆的抗原颗粒在第一方面解决了该问题，其中eVSG包含免疫原性化合物。

在本发明的上下文中，术语“抗原的”应指当在疫苗接种或免疫过程中用作免疫原时，诱导特异性免疫应答的本发明的颗粒的特征。

术语“变异体表面糖蛋白”，缩写为“VSG”，其指约60kDa的蛋白质家族，其密集地包裹属于锥体虫属的原生动物寄生虫的细胞表面。该寄生虫具有抗原性不同的VSG的大细胞库(约1500个完整和部分(假基因))，其通过RNA聚合酶I(招募到核糖体型启动子)与其他ES相关的基因(ESAG)一起从多顺反子中的血流表达位点(BES、ES)表达，转铁蛋白受体(Tfr：ESAG6、ESAG7)是其他ES相关的基因中的一个。每次只表达一种VSG基因，因为在细胞中约15个ES中只有一个是有活性的。VSG表达通过由沉默的基本拷贝基因的双链断裂所诱导的同源重组从阵列(同源性导向的)进入到位于末端的活性表达位点来“转化(switched)”。VSG标注、蛋白质序列和基因序列来源于公共数据库，例如www.ensemble.org。在Cross GA等人，Mol.Biochem.Parasitol.2014年6月；195(1)：59-73.Doi：10.1016/j.molbiopara.2014.06.004中公开了布氏锥体虫(Lister 427菌株)的VSG集合。在本发明的上下文中，优选的VSG为布氏锥体虫VSG，更优选为VSG1、VSG2、VSG3或ILTat1.24。根据本发明的VSG是优选的，其特征在于N末端3维地位于VSG内，当VSG存在于VSG包被内时，例如位于锥体虫细胞上时，N末端位于VSG内充分接近可靠近的包被外表面的位置，使得添加接头序列(优选长度不超过100个氨基酸，优选不超过50个氨基酸，最优选不超过20个氨基酸)允许修饰VSG蛋白的延伸或未延伸的N末端。优选N末端插入VSG序列的任意序列将在起始甲硫氨酸(M)之前被正确插入。在其他实施方案中，插入紧邻信号肽切割位点的下游。优选在本发明的上下文中使用的VSG序列是包含根据在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中显示的任一个氨基酸序列的VSG。

术语“工程化的VSG”或“eVSG”应指与所述VSG的野生型序列相比包含人工修饰的任意VSG蛋白。优选地，eVSG是非天然存在的序列。可以通过翻译后修饰、化学修饰、VSG编码序列的基因工程以及技术人员已知的用于蛋白修饰的任何其他手段将VSG修饰为eVSG。根据本发明的VSG既可以作为膜定位蛋白质提供，也可以作为可溶性VSG提供。

如本文使用的术语“免疫原性化合物”或者“免疫原”包括任何类型的化合物或结构，其能够在宿主中引起免疫应答。优选但非必须地，根据本发明的免疫原性化合物包含氨基酸序列或小分子化合物。本发明所述的上下文中，小分子应为分子量明显低于例如复合大分子或蛋白质的任何化合物，因此优选分子量小于50kDa，优选小于20kDa或10kDa的小分子。

在本发明的上下文中，免疫原性化合物是小分子、核酸或肽。

在其他实施方案中，免疫原性化合物被认为是小分子、核酸、糖类、脂质或肽，或这些或其他化学实体的任意组合)。

本发明的抗原颗粒的优选实施方案包括免疫原性化合物任选地通过接头与VSG的N末端共价连接。该免疫原性化合物可以通过技术人员已知的任何手段，包括任何化学反应，优选点击化学、交联或使用生物实体如酶、连接酶、蛋白-蛋白相互作用等与VSG连接。在本发明的上下文中，术语“点击化学”应指适于通过将包含反应基团的小单元连接在一起而快速且可靠地产生共价键的化学反应(参见H.C.Kolb，M.G.Finn and K.B.Sharpless，2001)。根据本发明，这种方法的任何变体可以用于将免疫原性化合物与VSG连接。

通常VSG与免疫原性化合物的连接可以包括使用任何连接手段或接头，其在本公开发明的上下文中是指通过其使得VSG和免疫原性化合物连接或联接以形成eVSG的手段。用于连接VSG和免疫原性化合物的一种或多于一种接头或连接手段可以是连接两者的任意结构上合适的手段。示例性的接头包括使用可用于形成肽的一种或多于一种氨基酸，在一些实施方案中所述肽具有经修饰的肽骨架、小化学支架、生物素-链霉亲和素、有机或无机纳米颗粒、多核苷酸序列、肽-核酸、有机聚合物或免疫球蛋白Fc结构域。用于连接的手段可以包括共价键和/或非共价键。一种或多于一种接头可以包含提供各种功能或性能的各种序列或其他结构特征。例如，一种或多于一种接头可以含有允许eVSG衍生的结构要素。

在本发明的抗原颗粒的一个优选实施方案中，抗原颗粒包含接头，其为野生型VSGN末端序列的N末端延伸，并且优选包含5个至30个，优选10个至20个，更优选约15个氨基酸。在此使用接头以使VSG的N末端更易于修饰，例如当在组装的VSG包被的情况下提供VSG时使用酶。优选通过基因工程化VSG编码基因将接头序列导入VSG。优选将接头紧邻C末端(如果存在的话)导入信号肽序列，该信号肽序列允许VSG蛋白的细胞表面靶向。信号肽通常在输出后被切割。因此，如本文使用的术语“信号肽”指氨基末端氨基酸残基，当其与目标多肽连接时，允许从细胞中输出目标多肽和切割信号肽。根据本发明优选的接头为G4S接头，然而，可以在本发明的上下文中使用基本上不干涉VSG折叠的任意其他蛋白接头。根据本公开发明的内容，G4S接头可以包含连续G4S的多重性，例如优选的接头为G4S接头，其可以具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)。

在本发明另外或代替的实施方案中，VSG可以包含任何种类的转肽酶受体序列。这种序列优选以以下方式与VSG序列的N末端连接，即包被表面可被转肽酶接近。如果eVSG序列包含N末端接头，则转肽酶受体序列位于接头的N末端。示例性的转肽酶受体序列为二丙氨酸(AA-)或二甘氨酸(GG-)，或可用于转肽酶介导的连接的任意其他序列。

因此，在本发明的一些实施方案中，免疫原性化合物与VSG优选通过使用转肽酶进行连接。

如本文使用的术语“转肽酶(sortase)”指具有转肽酶活性的蛋白质，即能够进行通过转酰胺基作用将蛋白质的C末端与蛋白质的N末端缀合的转肽反应的酶。该术语包括全长转肽酶蛋白质，例如全长天然存在的转肽酶蛋白质、具有转肽酶活性的这种转肽酶蛋白质的片段、这种转肽酶蛋白质或其片段的经修饰的(例如突变的)变体或衍生物、以及并非衍生白天然存在的转肽酶蛋白质但显示出转肽酶活性的蛋白质。本领域技术人员将能够容易地确定给定的蛋白质或蛋白质片段是否表现出转肽酶活性，例如通过在允许转肽的条件下使蛋白质或蛋白质片段与合适的转肽酶底物接触并确定是否形成了各自的转肽反应产物。

对于本领域技术人员来说合适的转肽酶将是明显的，但不限于转肽酶A、转肽酶B、转肽酶C和转肽酶D型的转肽酶。例如在Dramsi S，Trieu-Cuot P，Bierne H，Sortingsortases：a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positivebacteria.Res.Microbiol.156(3)：289-97，2005；Comfort D，Clubb RT中描述了合适的转肽酶。比较的基因组分析确定了革兰氏阳性菌中不同的分选途径(Infect Immun.，72(5)：2710-22，2004；Chen I，Dorr B M，和Liu D R.，A general strategy for the evolutionof bond-forming enzymes using yeast display.Proc Natl Acad.Sci.USA.2011年7月12日；108(28)：11399；和Pallen，M.J.；Lam，A.C.；Antonio，M.；Dunbar，K.TRENDS inMicrobiology，2001，9(3)，97-101；其整体内容通过引用并入本文)。任何已知的转肽酶可以在本文提供的进化策略中用作启动酶，并且本发明不限于此方面。例如，本发明包括与来自任意菌种或菌株的转肽酶A有关的实施方案。本领域技术人员将意识到，可以在本发明的一些实施方案中使用任意转肽酶和任意转肽酶识别基序，包括但不限于Ploegh等人在2010年2月1日提交的国际专利申请PCT/US2010/000274，在2010年8月5日公布的WO 2010/087994；Ploegh等人在2011年4月20日提交的国际专利申请PCT/US2011/033303，在2011年10月27日公布的WO 2011/133704；Liu等人在2012年6月21日提交的美国临时专利申请61/662606；和Liu等人在2013年9月20日提交的美国临时专利申请61/880515中描述的转肽酶和转肽酶识别基序；其整体内容通过引用并入本文。实施方案不限于此方面。

如本文使用的术语“转肽酶底物”指可以用于转肽酶介导的转肽反应中的分子或实体。通常，转肽酶利用两种底物——包含C末端转肽酶识别基序的底物，和包含N末端转肽酶识别基序的第二底物，并且转肽反应导致底物均通过共价键连接。在本发明的上下文中，“C末端转肽酶识别基序”还称为“分选(sortagging)供体序列”，而术语“N末端转肽酶识别基序”称为“分选受体序列”。在优选的实施方案中，C末端和N末端识别基序包含在不同的氨基酸序列中，例如一个在VSG的N末端，另一个与免疫原连接，使得在分选供体位点的末端存在游离羧基。本文描述了一些转肽酶识别基序，并且另外合适的转肽酶识别基序是本领域技术人员已知的。例如，金黄色葡萄球菌的转肽酶A识别和利用了C末端LPXT(G/A)基序，优选(SEQ ID NO：12和13)，(其中X为任意氨基酸，并且甘氨酸不是游离羧化物)以及N末端聚甘氨酸低聚糖甘氨酸(G_1-5)-表明甘氨酸化合物数量的指数-优选G₃或G₅，转肽反应中的基序。对于本领域技术人员来说另外的转肽酶识别基序将是明显的，并且本发明不限于此方面。除了肽转肽酶识别基序之外，转肽酶底物可以包含另外的部分或实体。例如，转肽酶底物可以包含LPXTG/A基序，其N末端与任何试剂(例如肽或蛋白质、小分子、连接剂、脂质、糖类或可检测的标记)缀合。类似地，转肽酶底物可以包含低聚糖甘氨酸(G_1-5)基序，优选G₃或G₅，其C末端与任何试剂例如肽或蛋白质、小分子、连接剂、脂质、糖类或可检测的标记缀合。因此，转肽酶底物不限于蛋白质或肽，但包括与转肽酶识别基序缀合的任意部分或实体。

在上下文中指供体或受体序列的术语“分选”有时候也称为“转肽酶供体序列”或“转肽酶受体序列”。

在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性化合物通过分选供体序列如-(G)₃SLPSTGG(SEQ ID NO：14)和分选受体序列(例如AA--或GG-)通过由转肽酶转肽反应介导的共价连接形成与VSG的连接。优选地，由分选供体序列和分选受体序列组成的连接包含序列-(G)₃SLPSTAA-(SEQ ID NO：15)，或其分选功能变体，如上文详述的。转肽酶修饰的VSG的实例可以来自Pinger J.等人，Nat.Commun.2017年10月10日；8(1)：828.doi：10.1038/s41467-017-00959-w。

本发明优选的eVSG从N末端至C末端具有以下(共价)结构：免疫原性化合物、分选供体序列、分选受体序列、接头、VSG蛋白序列。

本发明的另一个优选的eVSG从N末端至C末端具有以下(共价)结构：免疫原性化合物，然后是肽接头序列(或没有)，然后是转肽酶供体序列，然后是转肽酶受体序列，然后是肽接头序列(或没有)，并且以VSG蛋白序列结束。其他经工程化的VSG可以改变这些要素的顺序和/或组成或以其他方式使它们共价连接至VSG蛋白(例如化学或酶促交联至表面暴露的氨基酸或通过蛋白连接的多种形式)。

本发明的抗原颗粒可以用于各种目的，大部分具有医疗性质。此外，可以调整本发明用于工业性质的目的，例如生成作为特异性化学反应的副产物的清除剂的抗体，以及其他应用。本文所述发明的一个优点是通过出人意料地发现本发明的eVSG允许抗原呈递，特别是在其N末端的抗原呈递，广泛的应用是可能的。在本发明的一个另外的出人意料的实施方案中，用于生成本发明的抗原颗粒的免疫原性化合物是小分子药物，例如治疗性化合物和/或依赖性物质。因此本发明基于创造性的想法，使用锥体虫VSG包被来呈递用于生成抗体的小分子。本发明首次开发了允许密集呈递小分子以使得可以通过抗原颗粒诱导强免疫反应的系统。术语“依赖性物质”应指当被对象使用时，诱导其生理或心理成瘾，以继续或重复使用所述依赖性物质的任意化合物或物质。已知的使人成瘾的传统物质包括但不限于安非他命、吗啡、可卡因及其相关衍生物、酒精和尼古丁。

因此，在该特定实施方案中，免疫原性化合物优选为依赖性物质，所述依赖性物质选自(但仅在特定实施方案中限定为)：(i)Δ-9-四氢大麻酚(THC)或合成大麻素，例如传统大麻素、非传统大麻素、混合大麻素、氨基烷基吲哚和类花生酸；例如9-THC HU-210、(C8)CP47497、JWH-018、AM-2201(氟化JWH-018)、UR-144、XLR-11(氟化UR-144)、APICA、STS-135(氟化APICA)、AB-PINACA、PB-22、5F-PB-22(氟化PB-22)；或(ii)甲基苯丙胺及其衍生物例如3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA)Ecstasy/Molly；或(iii)合成卡西酮，例如α-吡咯烷基苯基戊酮(α-PVP)；或(iv)阿片样物质，包括海洛因、合成阿片样物质例如芬太尼、卡芬太尼和其他阿片样止痛药例如氧可酮

氢可酮

可待因、吗啡、二氢脱氧吗啡(Krokodil)；或(v)类固醇(合成代谢物质)或是尼古丁。

根据本发明的阿片生物碱类和衍生物选自阿片生物碱类：菲类例如可待因；吗啡；蒂巴因；东罂粟碱或混合的阿片生物碱，包括阿片全碱；吗啡酯例如二乙酰吗啡(二乙酸吗啡；海洛因)；尼可吗啡(二烟酸吗啡)；二丙酰基吗啡(二丙酸吗啡)；双醋氢吗啡；乙酰丙酰吗啡；dmaDesomorphine；甲地索啡；联苯酰吗啡；吗啡醚例如二氢可待因；乙基吗啡；异可待因。

还包括了半合成生物碱衍生物例如丁丙诺啡；依托芬；氢可酮；氢吗啡酮；氧可酮；羟吗啡酮。

在一些特定实施方案中，本发明的免疫原性化合物优选不为肽、蛋白质或其蛋白质片段。该实施方案优选在本发明适于小分子化合物的条件下实现。

在本发明的其他实施方案中，作为免疫原的小分子化合物可以通过将化合物化学连接至肽分选序列来与本发明的VSG连接。为此，用作本发明的免疫原性化合物的小分子化合物被修饰以共价连接至肽分选序列。连接小分子与肽的方法为例如在M.D.Raleigh等人的J.Pharmacol.Exp.Ther.368：282-291，201中所示的芬太尼。

还包括了合成阿片样物质，例如苯胺哌啶(anilidopiperidines)，如芬太尼；α-甲基芬太尼；阿芬太尼；舒芬太尼；瑞芬太尼；卡芬太尼；羟甲芬太尼；以及苯基哌啶如哌替啶(美吡利啶)；凯托米酮；MPPP；烯丙罗定；普洛丁；PEPAP；甲哌替啶。

被包括的二苯基丙胺衍生物包括丙氧芬；右旋丙氧芬；右旋吗酰胺；苯晴米特；氰苯双哌酰胺；美沙酮；地匹哌酮：左醋美沙朵(LAAM)；地芬诺辛；苯乙哌啶；洛派丁胺。

还包括：苯并吗吩酚衍生物如地佐辛、镇痛新、苯唑星；东罂粟碱衍生物如丁丙诺啡、二氢埃托啡、依托芬；吗啡喃衍生物如布托啡诺；纳布啡；左啡诺；左美沙芬；消旋甲啡烷；其他如利非他明；薄荷醇(κ-阿片类激动剂)；美普他酚；帽柱木碱；替利定；曲马多；他喷他多；伊卢多啉(Eluxadoline)；AP-237；7-羟基帽柱木碱。

在一些实施方案中，本发明的抗原颗粒在其表面上可以包含两种或多于两种不同的eVSG。因此抗原颗粒可以用于在其表面包被上展示两种或多于两种不同的(或3种、4种、5种、6种等)免疫原性化合物。例如不同的免疫原性化合物可以包含一个抗原的不同的免疫原性表位或可以包含不同抗原的不同表位。

在本发明的一些另外或代替的实施方案中，抗原颗粒包括为生物细胞、囊泡、纳米颗粒或珠的颗粒。优选选择能够被VSG蛋白包覆的颗粒。最优选颗粒是生物细胞，例如微生物，优选原生动物生物体，更优选锥体虫，更优选布氏锥体虫。在一些实施方案中，锥体虫是糖磷脂酰肌醇磷脂酶C(GPI-PLC)-阴性锥体虫。使用GPI-PLC-阴性锥体虫菌株的优点是在细胞失活后，VSG包被不是分散的，而是保持完整。因此，在其他另外或代替的实施方案中，生物细胞是无生命的，优选非传染性生物细胞，例如失活的生物细胞，优选UV交联的细胞。

在本发明的一些其他实施方案中，eVSG包含(优选在遗传上)插入VSG序列中作为一种或多于一种氨基酸序列的免疫原。优选插入的免疫原性序列是异种序列，并且最优选插入到VSG序列中而不引起野生型VSG序列中的缺失。在一些实施方案中，插入位于VSG的表面环，例如VSG中两个二级结构基序之间的区域，并且优选其中所述表面环位于VSG内的3维位置处，其是当在VSG包被中包含或组装VSG时呈递的表面，优选其是表面可接近的，并且可以呈递至免疫系统。

在本发明的一些实施方案中，包含在抗原颗粒中的免疫原性化合物是疾病相关的抗原，例如肽抗原，并且疾病优选地选自增生性病症、传染性疾病、炎症性病症、免疫缺陷病症或自身免疫性病症；或疾病是非传染性疾病。最优选免疫原性化合物是与传染性疾病或增生性病症有关的抗原；优选抗原与疾病有关。

在一些其他的实施方案中，颗粒是生物细胞并且eVSG在所述生物细胞内完全或部分表达。因此，生物细胞包含用于表达根据本发明的VSG的基因结构。在本上下文中，优选部分表达是包含内部肽免疫原的VSG的表达，或是包含接头序列的VSG的内部表达，VSG任选包含分选受体位点和用于细胞表面表达的N末端信号肽，其中分选受体位点在信号肽序列和接头序列之间。

在本发明的上下文中，优选的抗原颗粒是活着的或失活的具有完整VSG包被的锥体虫细胞，其中VSG包被包含一种或多于一种免疫原性工程化VSG(ieVSG)，优选高百分比的ieVSG(20％或高于20％、40％或高于40％、50％或高于50％、60％或高于60％、70％或高于70％、80％或高于80％，优选级递增)，其中ieVSG包含N末端连接至免疫原性化合物的eVSG蛋白。优选通过转肽酶介导的反应提供连接。

进一步提供了包含本发明的eVSG的核酸构建体，其适于引入到锥体虫的VSG表达部位。优选用于引入锥体虫的核酸构建体具有图3A至3C中任一个所示的结构。通常，本发明的核酸以此顺序包含以下要素：VSG的共转座区(CTR)，例如约1156bp前述布氏锥体虫(Lister 427株)基因组的血流表达位点-1(BES1)中的VSG2可读框，紧接着根据本发明的eVSG的编码区，和端粒种子序列，例如约150bp至250bp，优选200bp的端粒种子序列。构建体还可以包含抗性基因，例如杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素，优选在eVSG编码区之后。用于将这种构建体整合到锥体虫基因组的方法示于Pinger等人2017年的(NatureCommunications)中，其第7页和第8页的方法通过引用并入此文。

在另一方面，本发明涉及产生如上文所述的抗原颗粒的方法。

然后另一个方面涉及免疫原性工程化的VSG(ieVSG)蛋白，其在N末端至C末端方向上包含：

(a)免疫原性化合物，

(aa)任选的接头序列(例如G₃S)，

(b)分选供体序列(例如LPXTG/A)，

(c)分选受体序列(例如AA或GG)，

(d)接头序列(例如(G₄S)₃)，

(e)全长或基本上全长的VSG蛋白，例如上文所述的布氏锥体虫的VSG蛋白。

优选根据本发明的ieVSG，其中(a)至(e)中的任意一个、任意组合或全部选自根据上述的抗原颗粒的相应的(a)至(e)。

本发明的另一个方面提供了系统，其包含作为系统组分的前ieVSG蛋白和包含分选供体序列的化合物，其中前ieVSG蛋白在N末端至C末端方向上包含：

(a′)任选的信号肽，

(b′)分选受体序列(例如AA或GG)，

(c′)接头序列(例如(G4S)3)，

(d′)全长或基本上全长的VSG蛋白，例如上文所述的布氏锥体虫的VSG蛋白。

在一些实施方案中，本发明的系统还包含作为额外组分的转肽酶，或用于生成转肽酶的工具。

根据本发明的“前ieVSG”是具有用于添加免疫原性化合物的游离N末端受体位点的eVSG。例如，前ieVSG在锥体虫细胞的包被上表达，并在VSG包被的外面(例如表面上可接近的)包含游离转肽酶受体序列。在转肽酶反应中使用转肽酶，前ieVSG可以与免疫原性化合物融合，所述免疫原性化合物与转肽酶供体序列连接。

在一些实施方案中，以用于表达前ieVSG蛋白的核酸序列，例如在生物细胞中表达前ieVSG的核酸序列来提供前ieVSG蛋白。用于在锥体虫中表达VSG基因的合适的表达系统在本领域中是已知的，并且在实施例部分示例说明。在本发明中的其他表达系统可以包括各种原核生物和真核生物(例如，酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)以及体外表达系统。

本发明的系统还包括作为附加组分的用于将分选供体序列共价连接至用作免疫原的化合物的工具。

根据本发明的系统的其他组分是生物细胞，优选是锥体虫细胞，例如布氏锥体虫细胞，更优选GPI-PLC-阴性布氏锥体虫细胞。

根据本发明的抗原颗粒、ieVSG或系统在优选的实施方案中包括衍生自布氏锥体虫基因组的VSG，优选VSG1、VSG2、VSG3或ILTat1.24。

然后本发明的其他方面涉及药物组合物，其包含根据本发明的抗原颗粒和药学上可接受的载体和/或赋形剂。制造药物组合物以用于向治疗对象施用，以预防或管理疾病或病症。

药物组合物优选配制为疫苗组合物，因此，组合物适合于在需要这种治疗的对象中进行疫苗接种。

例如，本发明的药物组合物可以包含0.1重量％至100重量％的活性成分，例如约0.5重量％、1重量％、2重量、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、8％重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％，优选约1重量％至约20重量％、约10重量％至50重量％或约40重量％至90重量％。本发明组合物的活性成分优选为本发明的抗原颗粒。

如本文使用的，语言“药学上可接受的”赋形剂、稳定剂或载体旨在包括任何或所有溶剂、增溶剂、填料、稳定剂、黏合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控释载体、稀释剂、乳化剂、湿润剂、分散介质、包衣、抗菌剂或抗真菌剂、等渗剂和延缓吸收剂等，其与药物施用相容。将这种介质和试剂用于药物活性物质中在本领域是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充剂也可以掺入组合物中。

本发明的(或用于本发明的)组合物通常配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括口服施用、肠胃外施用例如鞘内施用、动脉内施用、静脉内施用、皮内施用、皮下施用、经口施用、腹膜内施用、经皮(局部)施用和经黏膜施用。

用于肠胃外施用、鞘内施用或皮下施用并且包含本发明的(或用于本发明的)组合物(例如本发明的抗原颗粒)的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如用于注射的水、生理盐水、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠来调节。肠胃外制剂可以封闭在由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。

适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、

EL(原来为Cremophor EL^TM；BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，可注射的组合物应一般是无菌的并且在一定程度上是流动的使其以易于注射。其应一般是在制造和储存的条件下稳定的，并且应在防微生物，例如细菌和真菌的污染作用的条件下保存。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用包被(例如卵磷脂)、在分散的情况下保持需要的粒径和使用表面活性剂来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等可以防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

口服组合物，其包含本发明的(或用于本发明)组合物(例如本发明的抗原颗粒)，通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以封闭在明胶胶囊中或压成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以并入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。还可以使用用作漱口水的液体载剂来制备口服组合物，其中液体载剂中的化合物被口服施用并被灌入和咳出或吞咽。药学上相容的黏合剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分被包括。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：黏合剂例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉钠(P血ogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Stertes；助流剂如二氧化硅胶体；甜味剂如蔗糖或糊精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。

而且，可以经直肠施用本发明的(或用于本发明的)组合物(例如本发明的抗原颗粒)。直肠组合物可以是任何直肠可接受的剂型，包括但不限于霜剂、凝胶剂、乳剂、灌肠剂、混悬剂、栓剂和片剂。一种优选的剂型为栓剂，其具有设计为引入人身体的直肠孔的形状和尺寸。栓剂通常在体温下软化、融化或分解。栓剂赋形剂包括但不限于可可脂(可可油)、甘油明胶、氢化植物油、不同分子量的聚乙二醇类的混合物和聚乙二醇的脂肪酸酯。

为了通过吸入施用，本发明的(或用于本发明的)化合物(例如本发明的抗原颗粒)一般以来自压力容器或分配器的气溶胶喷雾的形式递送，所述压力容器或分配器含有合适的推进剂，例如气体例如二氧化碳、或喷雾剂。

全身施用还可以通过经黏膜或经皮的手段。为了经黏膜或经皮施用，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经黏膜施用的洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂实现经黏膜施用。为了经黏膜施用，可以将药物组合物配制为本领域通常已知的软膏剂、药膏、凝胶剂或霜剂。

在特定实施方案中，将药物组合物配制为持久释放或控制释放本发明的(或用于本发明的)化合物。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说将变得明显。该材料还可以在商业上获得(包括靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体)，还可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。

用于包含本发明抗原颗粒的药物组合物的示例性单位剂型为片剂、胶囊剂(例如散剂、颗粒剂、微片剂或微丸剂)混悬剂或作为一次性使用的预装注射器。在特定实施方案中，提供试剂盒以用于制备单剂量施用单位。试剂盒可以含有具有干燥活性成分的第一容器和具有含水制剂的第二容器。替代地，试剂盒可以含有单室或多室预装注射器。

如上所述，优选的药物组合物是疫苗组合物。如本文使用的，术语“疫苗组合物”是指免疫原性组合物，当向对象施用时，其引起针对抗原的保护性免疫，这种情况下，抗原由免疫原性化合物代表。根据本发明制备的抗体还可以用作治疗剂或被动免疫。

此外，疫苗组合物可以包含一种或多于一种佐剂。如本文使用的，术语“佐剂”是指如下化合物，当在制剂中与特异性抗原颗粒结合使用时，该化合物将增强或改变或修饰所产生的免疫应答。免疫应答的修饰可以包括强化或扩展抗体和细胞免疫应答的特异性。免疫应答的修饰还可以表示减少或抑制特定抗原特异性免疫应答。

已知的佐剂的实例包括完全弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)(含有杀灭的结核杆菌的免疫应答非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和/或氢氧化铝佐剂。其他已知的佐剂包括巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卡介苗(BCG)、氢氧化铝、胞壁酰二肽(MDP)化合物例如thur-MDP和nor-MDP、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、RIBI的佐剂(Ribi ImmunoChemResearch，Inc.，Hamilton Mont.)，其含有从2％角鲨烯/Tween 80乳液中的细菌中提取的三种组分、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁支架(CWS)。MF-59、

主要组织相容性复合体(MHC)抗原是其他已知的佐剂。

在一些实施方案中，疫苗组合物可以包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或多于九种抗原颗粒，每种都包含衍生自一种或多于一种抗原的不同的免疫原性化合物。

本文提供的本发明的物质、组合物和系统优选用于预防、管理和/或治疗医学病症。因此，本发明涉及本文公开的物质、组合物或系统用于制造预防、管理和/或治疗医学病症的药剂的用途。此外，本发明涉及用于预防、管理和/或治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的对象施用有效量的本发明的物质、组合物或系统。

根据本发明，可以预防、管理或治疗的医学病症在优选的实施方案中是依赖性物质的成瘾。在该实施方案中，抗原颗粒的免疫原性化合物是依赖性物质。不希望受理论束缚，预期本发明的抗原颗粒提供了一种改进的疫苗接种策略，导致对象产生强免疫应答，从而在对象在回复成瘾行为期间使用这种物质的情况下，对象中响应抗原颗粒而产生的抗体将作为“海绵”来中和依赖性物质。因此，本发明的疫苗接种策略减少了依赖性物质的正向感觉并帮助对象克服成瘾。

根据本发明，可以预防、管理或治疗的医学病症在其他优选的实施方案中是由致瘾物质引起的不利或致命事件。药物掺杂物是与滥用药物制剂一起使用的物质，但经常导致对象的严重的药物过量和不罕见的严重不良作用甚至死亡。在该实施方案中，本发明的抗原颗粒包括免疫原性化合物，其诱导针对常见掺杂物的免疫应答以保护滥用者免于用药过量。优选在这种治疗中，还向对象施用本发明的抗原颗粒，所述抗原颗粒对使对象成瘾的滥用药物具有特异性。

本发明的医疗用途可以包括控制、管理或改善药物过量，包括过量使用纯化合物或掺杂物。在这个方面，医疗用途还包括在优选的实施方案中预防在对象中过量使用，所述对象疑似暴露于这种纯化合物或掺杂物的过量使用的风险中。这可能包括根据本发明针对疑似患有药物成瘾的对象中依赖性药物的疫苗接种，以及可能的复发使用。

在其他实施方案中，本发明涉及作为传染性疾病的医学病症，并且其中抗原颗粒的免疫原性化合物为衍生自引起传染性疾病的传染性生物体的免疫原性化合物或序列。在优选的方面，疾病是疟疾。已知的和优选的疟疾抗原是技术人员已知的。例如，免疫原是衍生自疟原虫表面的化合物。

本发明的其他实施方案涉及癌症，其中抗原颗粒的免疫原性化合物是与癌症的癌症细胞有关的或对癌症的癌症细胞具有特异性的化合物。

本发明的其他实施方案涉及用于施用化学治疗剂的“缓释库”(SRD)的产生。SRD是抗体或疫苗接种的任意产物，其与特异性化学治疗性化合物结合，并出于有用目的(例如减少毒性、延长半衰期、代替组织嗜性等)改变治疗的药代动力学或其他性质。实例是抗癌化学治疗剂(铂、阿霉素等)和由免疫接种产生的抗体或免疫反应，其允许捕获和“缓释”用于治疗或其他有用目的的化学治疗剂。其他实例包括用于传染性疾病或过敏的化疗药物，免疫学SRD为其提供了有用的方法。用于在工业应用中使用的化合物的SRD也将是本发明的实施方案。

本发明另外的实施方案涉及神经系统变性疾病和抗体或针对特异性蛋白的疫苗接种的任意产物的方面。实例包括：阿尔茨海默氏病(淀粉样β(Ab)肽，Tau)、帕金森氏病(α-突触核蛋白)、多重蛋白病(Tau蛋白病，微管相关的)、亨廷顿氏舞蹈病(含有或不含有串联谷氨酰胺重复序列的亨廷顿蛋白)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(超氧化物歧化酶)、海绵状脑病(朊病毒蛋白)、家族性多发性多神经病变(转甲状腺素蛋白，野生型和突变型)、小肽例如与偏头痛相关的那些肽和认为有用的任何可能的肽或小分子靶，包括但不限于工业的、农业的研究或诊断目的。

一般来说，抗体或广义的免疫应答已经显示或可以合理地预期潜在地显示出在医学、诊断或工业环境中的有用性的任何事物都有资格作为本发明的实施方案。

本发明的抗原颗粒的医疗用途通常涉及向需要预防、管理和/或治疗医学病症的对象施用抗原颗粒，例如以如上所述的疫苗组合物的形式施用。

本发明的另一个方面涉及用于生产抗体的方法，所述抗体能够与免疫原性化合物结合，所述方法包括提供根据本发明的抗原颗粒的步骤，其中抗原颗粒的免疫原性化合物是免疫原性化合物或其免疫原性部分，待生成的抗体能够结合免疫原性化合物或其免疫原性部分；使人或具有抗原颗粒的产生抗体的非人动物发生免疫；从产生针对所述免疫原的抗体的免疫的人或动物免疫细胞中分离，和任选地，从所述细胞中分离由此产生的抗体。

在本文公开的发明的上下文中，非人动物优选选自小鼠、兔子、骆驼、山羊、大鼠、狗、猫、猴子、仓鼠或其他哺乳动物。

其他方面涉及向需要提高对免疫原性化合物具有特异性的免疫应答的对象接种疫苗的方法，所述方法包括向对象施用有效量的根据本发明的抗原颗粒，其足以在对象中诱导针对免疫原性化合物的免疫应答，其中包含在抗原颗粒中的免疫原性化合物与对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物相同或为对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物的免疫原性部分。优选用于预防、管理或治疗医学病症的方法，并且其中免疫原性化合物与医学病症有关。

如本文使用的，术语“本发明的”、“根据本发明的”、“根据本发明”等，旨在指本方面所述的和/或本文要求保护的所有方面和实施方案。

如本文使用的，术语“包括”构建为包括“包含”和“由……组成”，其意思都是特定的，并且因此根据本发明各自公开了实施方案。其中本文使用的“和/或”用作两个具体说明的特征或组分中每一个的具体公开，其含有或不含有另一个。例如，“A和/或B”用作(i)A、(ii)B和(iii)A和B中每一个的具体公开，正如每一个在本文中单独陈述一样。在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解的准确度区间，以确定所讨论的特征的技术效果。术语通常表示与指示数值偏离20％、15％、10％，和例如5％。如普通技术人员所将预期的，给定技术效果的数值的这种具体偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果一般会比人工或工程化技术效果有更大的这种偏差。如普通技术人员所将预期的，给定技术效果的数值的这种具体偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果一般会比人工或工程化技术效果有更大的这种偏差。当名词前不使用数量词时，包括该名词的复数形式，除非另有特别说明。

应当理解，根据本文包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或环境、以及本发明的变化的内容或其另外的特征(例如进一步的方面和实施方案)，将在本领域普通技术人员的能力范围内。

除非上下文另有说明，否则以上所述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并相同地适用于所述的所有方面和实施方案。

本文引用的所有参考、专利和公开均通过引用整体并入。

根据上述，预期本发明还涉及以下详细列明的实施方案：

条款1：用经工程化的变异体表面糖蛋白(eVSG)包覆的抗原颗粒，其中eVSG包含免疫原性化合物。

条款2：根据条款1所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是小分子、核酸或肽。

条款3：根据条款1所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物任选地通过接头与VSG的N末端共价连接。

条款4：根据条款3所述的抗原颗粒，其中接头为野生型VSG N末端的N末端延伸，并且优选包含5个至30个，优选10个至20个，更优选约15个氨基酸。

条款5：根据条款4所述的抗原颗粒，其中接头是G4S接头，例如具有接头序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)的接头。

条款6：根据条款1至5中任一项所述的抗原颗粒，其中接头还包含N末端连接至接头序列的分选受体序列，例如AA-。

条款7：根据条款1至6中任一项所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物通过由转肽酶介导的共价连接经由分选供体序列，例如(G)3SLPSTGG和分选受体序列形成了与VSG的连接。

条款8：根据条款7所述的抗原颗粒，其中由分选供体序列和分选受体序列构成的连接包含序列-(G)3SLPSTGAA-或其分选功能性变体。

条款9：根据条款1至8中任一项所述的抗原颗粒，其中eVSG从N末端至C末端具有以下(共价)结构：免疫原性化合物、分选供体序列、分选受体序列、接头、VSG蛋白序列。

条款10：根据条款1至9中任一项所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是小分子药物，例如治疗性化合物和/或依赖性物质。

条款11：根据条款10所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是依赖性物质，其选自(i)Δ-9-四氢大麻酚(THC)或合成大麻素，例如传统大麻素、非传统大麻素、混合大麻素、氨基烷基吲哚和类花生酸；例如Δ-9-THC HU-210、(C8)CP 47497、JWH-018、AM-2201(氟化JWH-018)、UR--144、XLR-11(氟化UR-144)、APICA、STS-135(氟化APICA)、AB-PINACA、PB-22、5F-PB-22(氟化PB-22)；或(ii)甲基苯丙胺及其衍生物例如3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA)Ecstasy/Molly；或(iii)合成卡西酮，例如α-吡咯烷基苯基戊酮(α-PVP)；或(iv)阿片样物质，包括海洛因、合成阿片样物质如芬太尼和其他阿片样止痛药例如氧可酮

氢可酮

可待因、吗啡、二氢脱氧吗啡(Krokodil)；或(v)类固醇(合成代谢物质)或是尼古丁[说明书中更详细]。

条款12：根据条款1至11中任一项所述的抗原颗粒，其中颗粒是生物细胞、囊泡、纳米颗粒或珠。

条款13：根据条款12所述的抗原颗粒，其中生物细胞是微生物体，优选原生动物生物体，更优选锥体虫。

条款14：根据条款13所述的抗原颗粒，其中锥体虫是磷脂酶C(或PLC)阴性锥体虫。

条款15：根据条款12至14中任一项所述的抗原颗粒，其中生物细胞是无生命的生物细胞，优选非传染性的生物细胞，例如失活生物细胞，优选UV交联的细胞。

条款16：根据前述条款中任一项所述的抗原颗粒，其中eVSG包含作为插入VSG序列的免疫氨基酸序列的免疫原。

条款17：根据条款16所述的抗原颗粒，其中插入位于VSG的表面环，例如VSG中两个二级结构基序之间的区域，并且优选其中所述曲面位于VSG内的3维位置处，其是当VSG包含在VSG包被中时呈递的表面。

条款18：根据前述条款中任一项所述的抗原颗粒，其中免疫原是与抗原相关的疾病，例如肽抗原，其中所述疾病选自增生性疾病、传染性疾病、炎症性病症和免疫缺陷病症或自身免疫性病症。

条款19：根据前述条款中任一项所述的抗原颗粒，其中颗粒是生物细胞，其中eVSG在生物细胞中完全表达或部分表达。

条款20：根据条款19所述的抗原颗粒，其中部分表达是包含内部肽免疫原的VSG的表达，或是包含接头序列的VSG的内部表达，VSG任选包含分选受体部位和用于细胞表面表达的N末端信号肽，其中分选受体在信号肽序列和接头序列之间。

条款21：免疫原性工程化的VSG(ieVSG)蛋白，其在N末端至C末端方向上包含：

(a)免疫原性化合物，

(b)分选供体序列，

(c)分选受体序列，

(d)接头序列，

(e)全长或基本上全长的VSG蛋白，例如布氏锥体虫的VSG蛋白；

任选其中ieVSG是可溶性蛋白。

条款22：根据条款21所述的ieVSG，其中(a)至(e)中的任意一个、任意组合或全部选自相应的根据条款1至20中任一项所述的抗原颗粒的(a)至(e)。

条款23：包含组分前ieVSG蛋白和包含分选供体序列的化合物的系统，其中前ieVSG蛋白在N末端至C末端方向上包含：

·(a′)任选的信号肽，

·(b′)分选受体序列，

·(c′)接头序列，

·(d′)全长或基本上全长的VSG蛋白，例如布氏锥体虫的VSG蛋白。

条款24：根据条款23所述的系统，其还包括转肽酶，或用于生成转肽酶的工具。

条款25：根据条款23或24所述的系统，其中以用于表达前ieVSG蛋白的核酸序列，例如在生物细胞中表达前ieVSG的核酸序列来提供前ieVSG蛋白。

条款26：根据条款23至25中任一项所述的系统，其还包括用于将分选供体序列共价连接至用作免疫原的化合物的工具。

条款27：根据条款23至26中任一项所述的系统，其还包括生物细胞，优选是锥体虫细胞，例如布氏锥体虫细胞，更优选PLC阴性布氏锥体虫细胞。

条款28：根据前述条款中任一项所述的抗原颗粒、ieVSG或系统，其中VSG是衍生自布氏锥体虫基因组的VSG，优选VSG1、VSG2、VSG3或ILTat1.24。

条款29：根据条款1至20中任一项所述的抗原颗粒，其用于预防、管理和/或治疗医学病症。

条款30：根据条款29所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症是对依赖性物质的成瘾，其中抗原颗粒的免疫原是依赖性物质。

条款31：根据条款29所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症为传染性疾病，并且其中抗原颗粒的免疫原为衍生自引起传染性疾病的传染性生物体的免疫原性化合物或序列。

条款32：根据条款31所述之用途的抗原颗粒，其中传染性疾病是疟疾，并且其中免疫原是衍生自疟原虫的化合物。

条款33：根据条款29所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症为癌症，并且其中抗原颗粒的免疫原是与癌症的癌症细胞有关的或对癌症的癌症细胞具有特异性的化合物。

条款34：根据条款29至34中任一项所述之用途的抗原颗粒，其中将抗原颗粒施用至需要预防、管理和/或治疗医学病症的对象，例如以疫苗化合物的形式施用。

条款35：用于生成抗体的方法，所述抗体能够与免疫原性化合物结合，所述方法包括提供根据根据条款1至20中任一项所述的抗原颗粒的步骤，其中抗原颗粒的免疫原性化合物是免疫原性化合物或其免疫原性部分，待生成的抗体能够结合免疫原性化合物或其免疫原性部分；使具有抗原颗粒的产生抗体的非人动物发生免疫；从产生针对所述免疫原的抗体的免疫的动物免疫细胞中分离，和任选地，从所述细胞中分离由此生成的抗体。

条款36：根据条款35所述的抗原颗粒，其中产生抗体的非人动物选自小鼠、兔、骆驼、山羊、大鼠、狗、猫、猴、仓鼠或其他哺乳动物。

条款37：根据条款23至27中任一项所述的系统用于生成抗体，优选根据条款35或26所述的方法所得到的抗体的用途。

条款38：对需要提高对免疫原性化合物具有特异性的免疫应答的对象接种疫苗的方法，所述方法包括向对象施用有效量的根据条款1至20中任一项所述的抗原颗粒，其足以在对象中诱导针对免疫原性化合物的免疫应答，其中包含在抗原颗粒中的免疫原性化合物与对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物相同或为对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物的免疫原性部分。

条款39：根据条款38所述的方法，其中所述方法是用于预防、管理或治疗医学病症的方法，并且其中免疫原性化合物与医学病症有关。

根据上述，预期本发明还涉及以下详细列明的B实施方案：

条款B1：一种用经工程化的变异体表面糖蛋白(eVSG)包覆的抗原颗粒，其中eVSG包含与免疫原性化合物连接的VSG，其中免疫原性化合物是小分子化合物，所述小分子化合物通过接头与VSG的N末端共价连接。

条款B2：根据条款B1所述的抗原颗粒，其中eVSG从N末端至C末端具有以下(共价)结构：免疫原性化合物、分选供体序列、分选受体序列、任选的接头和VSG蛋白序列。

条款B3：根据条款B1或B2所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是小分子药物，例如治疗性化合物和/或依赖性物质。

条款B4：根据条款B1至B3中任一项所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是依赖性物质，其选自(i)Δ-9-四氢大麻酚(THC)或合成大麻素，例如传统大麻素、非传统大麻素、混合大麻素、氨基烷基吲哚和类花生酸；例如Δ-9-THC HU-210、(C8)CP 47497、JWH-018、AM-2201(氟化JWH-018)、UR-144、XLR-11(氟化UR--144)、APICA、STS-135(氟化APICA)、AB-PINACA、PB-22、5F-PB-22(氟化PB-22)；或(ii)甲基苯丙胺及其衍生物例如3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA)Ecstasy/Molly；或(iii)合成卡西酮，例如α-吡咯烷基苯基戊酮(α-PVP)；或(iv)阿片样物质，包括海洛因、合成阿片样物质如芬太尼和其他阿片样止痛药例如氧可酮

氢可酮

条款B5：根据条款B1至B4中任一项所述的抗原颗粒，其中颗粒是生物细胞、囊泡、纳米颗粒或珠。

条款B6：根据条款B5所述的抗原颗粒，其中生物细胞是微生物体，优选原生动物生物体，更优选锥体虫。

条款B7：根据条款B5至B6中任一项所述的抗原颗粒，其中生物细胞是失活生物细胞，优选UV交联的生物细胞。

条款B8：根据前述条款B中任一项所述的抗原颗粒，其中VSG是衍生自布氏锥体虫基因组的VSG，例如VSG1、VSG2、VSG3或ILTat1.24。

条款B9：免疫原性工程化的VSG(ieVSG)蛋白，其在N末端至C末端方向上包含：

(a)免疫原性化合物，

(b)分选供体序列，

(c)分选受体序列，

(d)接头序列，

(e)全长或基本上全长的VSG蛋白。

条款B10：包含组分(i)前ieVSG蛋白和(ii)包含分选供体序列的化合物的系统或试剂盒，其中前ieVSG蛋白在N末端至C末端方向上包含：

(a′)任选的信号肽，

(b′)分选受体序列，

(c′)接头序列，

(d′)全长或基本上全长的VSG蛋白。

条款B11：根据条款B9所述的系统或试剂盒，其还包括转肽酶，或用于生成转肽酶的工具。

条款B12：根据条款B10或B11所述的系统或试剂盒，其中以用于表达前ieVSG蛋白的核酸序列，例如在生物细胞中表达前ieVSG的核酸序列来提供前ieVSG蛋白。

条款B13：根据条款B10至B12中任一项所述的系统或试剂盒，其还包含用于将分选供体序列共价连接至用作免疫原的化合物的工具。

条款B14：一种抗原颗粒，其用于预防、管理和/或治疗医学病症，其中抗原颗粒是条款B1至B8中任一项所述的抗原颗粒。

条款B15：根据条款B14所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症是对依赖性物质的成瘾，其中抗原颗粒的免疫原是依赖性物质。

条款B16：根据条款B14所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症为传染性疾病或癌症，并且其中抗原颗粒的免疫原为分别衍生自引起传染性疾病的传染性生物体或癌症的免疫原性化合物或序列(表位)。

条款B17：根据条款B14至B16中任一项所述之用途的抗原颗粒，其中将抗原颗粒施用至需要预防、管理和/或治疗医学病症的对象，例如以疫苗化合物的形式施用。

条款B18：用于生成抗体的方法，所述抗体能够与免疫原性化合物结合，所述方法包括提供根据条款B1至B8中任一项所述的抗原颗粒的步骤，其中抗原颗粒的免疫原性化合物是免疫原性化合物或其免疫原性部分，待生成的抗体能够或旨在结合免疫原性化合物或其免疫原性部分；使具有抗原颗粒的产生抗体的非人动物发生免疫；从产生针对所述免疫原的抗体的免疫的动物免疫细胞中分离，和任选地，从所述细胞中分离由此产生的抗体。

条款B19：对需要提高免疫应答的对象接种疫苗的方法，其中免疫应答对免疫化合物具有特异性，所述方法包括向对象施用有效量的根据条款B1至B8中任一项所述的抗原颗粒，所述抗原颗粒足以在对象中诱导针对免疫原性化合物的免疫应答，其中包含在抗原颗粒中的免疫原性化合物与对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物相同或为对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物的免疫原性部分。

条款B20：根据条款B19所述的方法，其中所述方法用于预防、管理或治疗医学病症，并且其中免疫原性化合物与医学病症有关。

附图和序列的简要说明

附图显示：

图1：显示了用于VSG工程化的质粒图。pHH-VSG3.G4S-Hyg和pHH-ILTat1.24-G4S-Hyg质粒的序列分别作为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7提供。(A)pHH-VSG3.G4S-Hyg质粒尺寸：7204bp.VSG2-CTR(VSG2共转座区)：429-878；VSG3.G4S(S317A)：879-2453；VSG23’-UTR(VSG23’-未翻译区)：2454-2533；肌动蛋白5’-UTR(肌动蛋白5’-未翻译区)：2727-2834；Hygro(潮霉素抗性基因)：2854-3879；醛缩酶3’-UTR(醛缩酶3’-未翻译区)：3885-4033；端粒种子序列：4715-4915；Ori(复制的细菌来源)：5385-5973；AmpR(氨苄青霉素抗性基因，β-内酰胺酶)：6144-7004(反向互补序列)；AmpR启动子(氨苄青霉素抗性基因启动子，β-内酰胺酶启动子)：7005-7109(反向互补序列)；(B)pHH-ILTat1.24-G4S-Hyg质粒尺寸：7219bp.VSG2-CTR(VSG2共转座区)：429-878；ILTat1.24-G4S：879-2468；VSG23’-UTR(VSG23’-未翻译区)：2469-2548；肌动蛋白5’-UTR(肌动蛋白5’-未翻译区)：2742-2849；Hygro(潮霉素抗性基因)：2869-3894；醛缩酶3’-UTR(醛缩酶3’-未翻译区)：3900-4048；端粒种子序列：4730-4930；Ori(复制的细菌来源)：5400-5988；AmpR(氨苄青霉素抗性基因，β-内酰胺酶)：6159-7019(反向互补序列)；AmpR启动子(氨苄青霉素抗性基因启动子，β-内酰胺酶启动子)：7020-7124(反向互补序列)。

图2：显示晶体学研究有助于确定VSG N末端对转肽酶的可及性，使用5个实施例(除VSG13外均被公布)进行说明。“N”指示了每个蛋白的游离N末端的位置。直线表明表面暴露的残基的大致估计的一般位置(VSG包被的“顶部”，其对转肽酶来说是可接近的)。虽然许多VSG可以通过基于转肽酶的缀合被工程化为接受标记(并且如下文所述，发明人已经对VSG2、VSG3和ILTat1.24实现了如此操作)，但并非所有的都可以(例如VSG13中的N末端被埋得更深，可能无法充分接近)。结构生物学对VSG进行了非常有用的预筛选，以揭示报告了VSG的选择的许多表面要素和其他结构特征(例如，在VSG3上发现了O-连接糖，这使发明人利用特定的丝氨酸至丙氨酸突变体S317A，以将其从表面上除去)。

图3：显示了将可分选(sortaggable)的VSG敲入布氏锥体虫的基因组的基因敲入策略。图3A至图3C显示了基因克隆策略，其从内源VSG(代替野生型VSG2)的活性表达位点中表达工程化的VSG2、VSG3和ILTat1.24。

图4：显示了可分选的VSG蛋白的氨基酸序列。A.可分选的VSG3.G4S(S317A)蛋白的氨基酸序列。强调了信号肽。成熟的、可分选的VSG3衍生自野生型VSG3(S317A)的更多抗原突变体。VSG3-G4S将用二丙氨酸(粗斜体)启动。该二肽将是转肽酶A反应的受体(并且将接受N末端连接至肽序列LPSTGG的任何部分)。N末端的延伸(通过添加(G₄S)₃肽接头，粗体)对转肽酶A接近二丙氨酸的能力至关重要。B.可分选的VSG2蛋白(VSG2-1DK)的氨基酸序列。强调了信号肽。成熟的、可分选的VSG2-1DK将用二丙氨酸(粗斜体)启动。该二肽将是转肽酶A反应的受体(并且将接受N末端连接至肽序列LPSTGG的任何部分)。N末端的延伸(通过添加由两侧有聚甘氨酸的TEV蛋白酶切割位点组成的接头肽，粗体)对转肽酶A接近二丙氨酸的能力至关重要。C.可分选的ILTat1.24蛋白(ILTat1.24-G4S)的氨基酸序列。强调了信号肽。成熟的、可分选的ILTat1.24-G4S将用四甘氨酸(以粗斜体显示)启动。该四甘氨酸将是转肽酶A反应的受体(并且将接受N末端连接至肽序列LPSTGG的任何部分)。VSG N末端的延伸(通过添加((G4S)2肽接头，粗体)对转肽酶A接近四甘氨酸的能力至关重要。

图5：显示了野生型布氏锥体虫在死亡时脱落其VSG包被。A.显示细胞死亡时GPI-PLC被激活的过程动画。B.显示了GPI锚切割位点的位置。GPI锚的切割将VSG从包被释放(脱落)，并且缺少包被的锥体虫通过渗透压裂解(并且最终失去其免疫原性质)。

图6：显示了分选锥体虫的VSG包被的大致方法的说明。A.通过糖磷脂酰肌醇(GPI)锚嵌入锥体虫的膜中的VSG蛋白同型二聚体的可视化。底部：整个锥体虫。顶部：一个VSG蛋白同型二聚体上的放大。B.分选反应的说明：经修饰的VSG蛋白(具有N末端二丙氨酸)和连接至转肽酶供体序列LPSTGG的小分子(椭圆形)通过转肽酶反应进行共价连接。

图7：显示检测分选效率的方法。A.顶部图像：通过直接荧光技术(6-FAM)检测的VSG2-1DK(左边)和VSG3-G4S(S317A)(右边)的分选。布氏锥体虫的荧光显微图像在顶部显示(左边：分选的VSG2-1DK，右边：分选的VSG3-G4S)。底部图像：还通过流式细胞术分析使用FACSCalibur分析6-FAM分选的VSG。B.通过使用针对小分子部分(4-羟基-3-硝基苯乙酰基，这里缩写为NP)的单克隆抗体，然后用别藻蓝蛋白(APC)缀合的小鼠单克隆IgG抗体(B1-8克隆，Abcam)进行染色经由锥体虫的FACS分析检测的VGS2-1DK和VSG3-G4S(S317A)的分选。C.衍生的芬太尼半抗原是化学合成的并与含有C末端转肽酶A供体序列的肽的N末端缀合(芬太尼-GGGSLPSTGG，其中芬太尼缀合的化合物可替换地表示为“Fen-”或“-Fen”)。带有芬太尼半抗原的肽与使用上述转肽酶A的三种不同转基因VSG(VSG2、VSG3和ILTat1.24)缀合。芬太尼半抗原的化学合成过程由M.D.Raleigh等人在J.Pharmacol.Exp.Ther.368：282-291，2019中进行描述，并且其在此已适合于转肽酶介导的缀合。D.在转肽酶A介导的芬太尼半抗原与VSG缀合之后，使用试剂盒(Abcam，ab102884)将针对芬太尼的小鼠单克隆抗体(由M.Pravetoni，University of Minnesota提供)与FITC进行缀合，并用于对分选的VSG进行染色，然后使用FACS-Calibur进行流式细胞仪分析。将未标记的VSG用于背景染色的对照。图下方：显示了数据集的模式和中位数。在芬太尼和FAM的缀合中，ILTat1.24的表现优于VSG2和VSG3。而且，VSG3的分选效率高于VSG2的分选效率。

图8：显示了抗体对小分子4-羟基-3-硝基苯乙酰基(NP)的应答的比较：用NP标记的布氏锥体虫进行的免疫与用“黄金标准”半抗原-载体缀合物(即明矾佐剂中NP缀合的鸡免疫球蛋白(NP-CGG))进行的免疫。每组5只6周至8周大的雌性C57BL/6J小鼠在第0天、第3天和第30天用完整的VSG3(S317A)或VSG3-NP包被(即紫外照射的完整布氏锥体虫细胞，其表达可分选的VSG3(S317A)，用NP半抗原标记或不标记，不含佐剂)或用明矾佐剂中的NP-CGG进行启动。这些小鼠在第70天接收可溶性VSG3(S317A)-NP(在PBS中，不含佐剂)增强剂(或用不含佐剂的PBS中可溶性的NP-CGG增强，作为对照组)。A.用完整锥体虫上的VSG-NP启动免疫，然后用可溶性VSG3(S317A)-NP进行增强，这显示了清晰的IgG记忆应答，导致对小分子半抗原NP产生大量IgG滴度。在增强之前和增强之后测量滴度并显示血清稀释度为1∶800。连续稀释抗NP半抗原单克隆IgG(B1-8克隆，Abcam)(至四分之一)以覆盖10μg/ml至0.6ng/ml的浓度范围。用缀合的锥体虫包被进行的免疫会导致对NP的高IgG滴度(平均约500μg/ml)。此外，事实上可溶性VSG3-NP(在PBS中，不含佐剂)诱导二次IgG应答极大地表明了用NP缀合的VSG包被进行的免疫可以诱导记忆B细胞应答。虽然对明矾中NP-CGG产生的平均滴度稍高，但是用可溶性NP-CGG(在PBS中，无佐剂)进行的增强不包括稳健的二次应答，这表明在明矾中用NP-CGG进行启动之后缺少记忆B细胞应答。B.在完整锥体虫包被上使用VSG-NP进行免疫，然后用可溶性VSG3(S317A)NP进行增强，这导致了高亲和的IgG(如NP2/NP30 IgG滴度比所定义的)。VSG3-NP组中NP2-BSA/NP30-BSA IgG比的增加表明亲和力成熟，其为记忆B细胞(记忆)应答的标志。在明矾中用“黄金标准”半抗原-载体缀合物(NP-CGG)进行的免疫没有增加抗NP IgG抗体的亲和力。C.用在完整锥体虫包被上的VSG-NP进行免疫，然后用可溶性VSG3(S317A)-NP进行增强，这也产生了抗VSG3(抗载体)抗体，但是这些抗体与抗血清的量相当(以μg/ml计)，所述抗血清是对NP半抗原产生的(如抗VSG3小鼠单克隆IgG(11D6克隆)所定量的)。另外的数据表明VSG2和VSG3载体之间缺少免疫交叉反应性。

图9：显示了由Fen标记的布氏锥体虫引起的抗体对芬太尼的应答实现高滴度和记忆(回忆)。显示了针对芬太尼半抗原和VSG3载体蛋白的血清IgG的ELISA测量。A.如上所述合成带有N末端芬太尼半抗原的四甘氨酸肽(Feh-G4)。Fen-G4肽与作为异源载体蛋白的BSA缀合，并以10μg/ml用于涂覆96孔ELISA板。每组6只6周至8周大的雌性C57BL/6J小鼠在第0天和第30天通过皮下注射用完整的VSG3(S317A)或VSG3(S317A)-Fent包被(即紫外照射的完整布氏锥体虫细胞，其表达可分选的VSG3(S317A)，用Fen-半抗原标记或不标记，不含佐剂)启动。然后，这些小鼠在第60天接收可溶性VSG3(S317A)-Fent(在PBS中，不含佐剂)增强剂。测试的血清样本包括免疫前(第4天)、免疫前2天(第58天)和免疫后8天(第68天)用可溶性VSG3(S317A)-芬太尼蛋白进行1次增强。使用抗小鼠HRP缀合物(1∶3000)检测血清中的抗芬太尼IgG，然后添加ABTS底物和在pH 4.2的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液中制备的H₂O₂。45分钟后使用酶标仪(Tecan，Infinite M1000Pro)在A405nm测量样本的吸收。B.连续稀释针对Fen-半抗原的小鼠单克隆抗体以绘制校正曲线，从而定量血清样本中IgG的浓度。显示了每组6只小鼠的平均值±标准偏差。(C)类似地，用FPLC纯化的VSG3(S317A)蛋白以5μg/孔涂覆96孔板，以测量针对VSG3(S317A)载体蛋白的血清IgG。在45分钟后通过GraphPad Prism计算曲线下面积(AUC)。圆圈、三角形和正方形分别表示第4天、第58天和第68天的血清。用缀合的锥体虫包被进行的免疫会导致对芬太尼的高IgG滴度(平均约150μg/ml)。此外，事实上可溶性VSG3(S317A)-Fen(在PBS中，不含佐剂)诱导二次IgG应答强烈地表明了用Fen-缀合的VSG包被进行的免疫可以诱导记忆B细胞应答。

图10：显示用含芬太尼-半抗原的布氏锥体虫进行免疫的小鼠被保护免于中毒。A.镇痛活性。通过使用如Cox和Weinstock(1964)所述的加热板法镇痛分析测试镇痛活性。在未免疫的小鼠、仅用载体(仅VSG3(S317A))进行免疫的小鼠或用半抗原的VSG3(S317A)-Fen进行免疫的小鼠中测试芬太尼在热板法镇痛方面的效果。在所有情况下，对小鼠施用的芬太尼累积浓度为0.1mg/kg(s.c.)。每15分钟至30分钟以增加的剂量皮下施用芬太尼，列出的剂量是接收的累积剂量。在最后一次施用芬太尼后15分钟测量热板法镇痛作用。在最后一次施用芬太尼后15分钟施用纳洛酮(0.1mg/kg，s.c.)。芬太尼的效果表现为应答潜伏期。与基线值相比，芬太尼在未免疫和仅用VSG3免疫的小鼠中以0.1mg/kg的累积剂量施用后增加了应答潜伏期。纳洛酮完全逆转了两组中芬太尼诱导的镇痛作用。与基线相比，用VSG3(S317A)-Fen进行免疫的小鼠未显示应答潜伏期的增加，因此表明这些小鼠没有因作为对照的相同剂量的芬太尼而中毒。显示了每组5只(未免疫的)或6只小鼠的平均值±标准偏差。B.每组每只小鼠测得的斯特劳布举尾反应(STR)。％显示表明斯特劳布举尾反应的小鼠数量，所述反应是通常几乎垂直于身体方向或在动物身上向后卷曲和刻板行走行为的尾部背屈(Bilbey等人，1960)。这种现象首次被描述为小鼠对阿片样物质的应答(Straub，1911)，并被认为由阿片受体系统的激活所介导，因为阿片受体拮抗剂例如纳洛酮阻断了该现象(Aceto等人，1969；Nath等人，1994；Zarrindast等人，2001)。

图11：显示每个不同的VSG包被都会引起独特的B细胞特异性子集(因此，产生独特的B细胞库)。表达VSG2锥体虫包被或在芬太尼疫苗接种实验中使用的VSG3(S317A)变体的锥体虫(更具免疫原性的VSG3形式，其中丝氨酸317突变为丙氨酸)在C57BL/6小鼠中引起了不同的库。A.质粒细胞分离的控制策略。将淋巴细胞从脾脏中分离并在用于浆细胞的LSRII仪器上进行分析。然后使用ARIA II细胞分选仪分离浆细胞(单细胞分类)。使用抗小鼠CD19-BV421抗体和抗小鼠CD138-BV510抗体对细胞染色。在所有染色中包括7AAD以排除死细胞。使用FlowJo v10软件分析数据。如上所述进行Ig基因克隆(Tiller等人，2008)。简而言之，使用随机六聚物引物生成每个单细胞的cDNA。使用半巢式PCR策略扩增Ig重链和相应的Igκ或Igλ轻链基因转录本(Tiller等人，2008年)。对扩增子进行Sanger测序并使用NCBIIgBlast分析。B.由VSG2或VSG3(S317A)包覆的锥体虫引起的V基因库。直方图概括了VH和Vκ基因家族在从浆细胞中分离的Ig基因转录本中的使用，所述浆细胞来自暴露于VSG2或VSG3(S317A)包覆的锥体虫的C57BL/6小鼠(分别有59个和53个不同的Ig转录本)。序列是分别从4个和8个不同的VH基因家族获得的VSG2和VSG3(S317A)序列以及11个Vκ基因家族的序列。在一个柱内不同的灰色阴影显示不同家族成员在相应家族内的分布。VH10家族，然后是VH1家族(最大的VH家族)优选通过大部分浆细胞表达，所述浆细胞从VSG2小鼠中分离，而只有很少表达VH10家族的浆细胞从VSG3(S317A)小鼠中分离。对于VSG3小鼠，大部分浆细胞表达VH1家族。在VSG2小鼠中浆细胞主要表达VK6家族，而在VSG3(S317A)小鼠中，Vk家族的用法更多样(但主要是VK1、VK4和VK5)。这些经分析的序列清楚地表明，两种不同的VSG在浆细胞中引起了不同的VH和Vk家族库。这种特异性允许其使用不同的VSG包被平台设计出最佳疫苗接种策略，满足特异性表位的“需要”。例如，这种方法可以用于扩展很少出现的B细胞，不过，其需要被克隆地扩展以产生针对特异性靶的最佳应答。

序列显示：

实施例

现在将通过实施例的方式并参考本文所述的说明书、附图和表格来说明本发明的某些方面和实施方案。本发明的方法、用途和其他方面的这些实施例仅是说明性的，不应当被认为将本发明的范围限制为仅是这些说明性的实施例。

实施例显示：

实施例1：药物修饰的VSG包被

本发明人已经开发了衍生非洲锥体虫(布氏锥体虫)的致密和均匀表面包被的工具，以用作需要对其产生抗体的(任何)抗原的展示平台。这些工具包括：

(a)用任意其他感兴趣的VSG有效替代经表达的VSG(VSG2)的特异性载体(见下文)。图1包含两种这类质粒载体的图。

(b)感兴趣的VSG的特定集合：这些包含延伸的N末端，其对转肽酶是可接近的(在此，衍生自酿脓链球菌)。通过(i)VSG上的相对位置(结构上测定-图2含有VSG2和VSG3，它们的N末端是可接近的，并且作为比较，还包含VSG13，它的N末端由于空间位阻是不可接近的)测定N末端可及性。也可以通过(ii)启动氨基酸来测定，所述氨基酸对使用的特定转肽酶而言必须是Ala-Ala(或对来自其他生物体的转肽酶来说是Gly-Gly)。

(c)通过替代活性VSG，将满足这些标准的VSG设计为经修饰的布氏锥体虫的Lister 427菌株(见(a)上文-图4包含三种这类VSG的氨基酸序列：VSG3(A)、VSG2(B)和ILTat1.24(C)；值得一提的是，设计为分选目的的VSG3含有去除天然糖基化事件的突变(S317A)，发明人最近已经证明该事件是免疫-抑制的，Pinger等人，Nat.Microbiology，2018)。

(d)布氏锥体虫的Lister 427菌株的修饰包括内源性糖磷脂酰肌醇磷脂酶C(GPI-PLC)的基因缺失，所述酶使VSG从死亡细胞表面“脱落”(这对产生可以用作疫苗展示平台的布氏锥体虫来说很重要，因为除了将GPI-PLC从基因组中除去，寄生虫的任何失活形式(例如紫外照射)也将导致VSG包被和细胞本身的分解(一旦由于GPI-PLC作用使VSG脱落，VSG包被会分解并且细胞会溶解-图5解释了此概念)，所述失活形式对(i)禁止工程化的VSG的转化和丢失，和(ii)去除传染性而言很重要。

本文公开的方法依赖于“抢夺”布氏锥体虫引起中和(和持久的)抗体对其VSG包被产生应答的天然能力，以随意产生抗体。发明人通过不仅用任意肽表位/抗体，还用糖、脂质或小分子来修饰布氏锥体虫VSG包被，然后将经修饰的包被用作疫苗载体来实现这一点。特别是，本发明人使用分拣酶A以与VSG包被的任意部分共价连接，所述VSG包被基因上工程化为携带N末端转肽酶受体序列(图4和图6)。

因此，本发明人使用含有化脓性链球菌衍生的转肽酶A表达结构(pSpSortA-pET28a)的质粒，制备了His标记的转肽酶A，其衍生自大肠杆菌中的酿脓链球菌。将质粒转化到BL21DE3细胞中(Life Technologies C6000-03)。将来自该转化产生的菌落用于接种LB培养基(Sigma-Aldrich，L3022-1KG)的大的培养物，然后使其在37℃下摇晃生长至光学密度(OD600)为0.4至0.8。用1mM IPTG诱导培养物，生长额外3h至4h并通过离心收集。在TBS/咪唑(20mM Tris、150mM NaCl、20mM咪唑)中重悬细胞团块，并使用EmulsiFlex-C5均质机(Avestin)使细胞团块溶解。向溶解产物中加入DNase-A粉末(Sigma D5025)和5mM 2-巯基乙醇(2-ME)，然后通过离心使其澄清以除去颗粒。上清液穿过充满Ni-NTA琼脂糖微球(QIAGEN，30230)的柱子，所述柱子用清洗缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM2-ME)平衡。然后用100ml清洗缓冲液清洗柱子，并用30ml至35ml洗脱缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、200mM咪唑、5mM 2-ME)洗脱。然后合并含有蛋白的样本并在透析缓冲液(20mMTris、300mM NaCl、1mM DTT)中透析。使用离心过滤装置(Amicon Ultra-15，10000NMWL，Merck Millipore)浓缩得到的样本，进行等分并在-80℃下储存以供将来使用。

分选反应如下进行：将HMI-9培养基中含有100uM纯化的转肽酶A和300-600uM可分选的肽的分选溶液的混合物在冰上孵育30分钟至60分钟(可分选的肽包括具有C末端转肽酶供体序列LPSTGG的任何肽，其可以在其N末端处与另一个部分连接；该部分可以是荧光团例如6-FAM、小分子例如4-羟基-3-硝基苯基乙酰基(NP)半抗原或其他为滥用药物的小分子(例如芬太尼等)。然后将表达VSG的GPI-PLC-阴性布氏锥体虫沉淀，在分选混合物中重悬并在4℃下反向旋转孵育60分钟。然后使细胞沉淀，用HMI-9培养基清洗一次，并在最终重悬于HMI-9培养基之前再次沉淀(Hirumi和Hirumi，J.Parasitology，1989)。可以通过直接流式细胞术或荧光显微法(例如用于荧光分子如6-FAM)，或通过使用结合修饰VSG的部分的特异性单克隆抗体来测定分选的效率(图7包括6-FAM、NP半抗原和芬太尼半抗原的实施例)。

为了证实原理性实验，使用这种方法以产生(a)稳健的(与明矾佐剂中的NP-CGG相比)和(b)具有稳定质量的针对小分子半抗原(4-羟基-3-硝基苯乙酰基或NP)的抗体(图8)。

这种方法可以用于其他小分子范围(例如滥用的药物如可卡因、尼古丁、芬太尼、卡芬太尼、曲马多、氯胺酮等，还有化学治疗剂如铂、阿霉素等；和为化学反应工业副产物的小分子)，用于介导过敏反应的毒素(例如黄曲霉毒素和其他)，用于用作传染性疾病的重要表位的特异性肽(例如疟原虫衍生的肽)，用于糖基化的或脂化的肽(例如被认作是针对抗癌疫苗的靶的异常糖基化黏蛋白肽等)。

从抗芬太尼(抗用量过度)疫苗的方面来说，要点在于使用该系统对“处于风险”的人(定义为常规使用者或滥用药物者但未成瘾/化学依赖的人，或离开康复中心、再犯的情况下主动抵抗用药过多的成瘾的人，这通常发生在离开康复所后一两个月内)接种疫苗。已使用本文的方法实现这一点的概念的验证在图9和图10中提供。另外，当这种方法与库分析结合时(图11)，将产生很多亲和力不同的抗芬太尼单克隆抗体(可直接从成对的免疫球蛋白重链和轻链序列中获得，库的测序结果如图11所示)。这种单克隆抗体“海绵”可以直接用于治疗应用(例如抗芬太尼抗体注入与美沙酮维持治疗，以抑制生物利用度和欲望并加速治疗结果；或在ER中注射以与纳洛酮联合使用减弱用药过量的影响，其通过抵抗与阿片类受体结合的芬太尼而快速起作用，但其代谢比芬太尼快，从而导致延迟中毒)。

方法：在感染者中锥体虫刺激强力的免疫应答的能力(持久和中和的应答)被充分证明。本发明使这成为可能，至少部分由于发现锥体虫的VSG蛋白能够耐受使用基于细菌转肽酶的系统(此后为“分选”)的外源部分在其表面的高效展示。

特别是，可以在VSG蛋白的暴露的N末端部分添加对转肽酶具有特异性的转肽酶受体序列(对衍生自酿脓链球菌的转肽酶A而言是Ala-Ala，对衍生自金黄色葡萄球菌的转肽酶A而言是Gly-Gly)，当其被转运至锥体虫表面时，其对转肽酶仍是可接近的(见图2和图6)。值得注意的是，用信号肽的蛋氨酸启动VSG，但是一旦成熟，该肽会裂解，因此成熟的VSG序列不用蛋氨酸启动。例如，用Ala-Ala启动VSG2和VSG3(优选VSG变体)，然而，确切的启动氨基酸必须根据经验测定(使用埃德曼降解，发明人已对VSG如此操作)。最后，虽然存在内源性Ala-Ala，但对转肽酶来说是不可接近的(并且需要短的N末端延伸，如图4所示)。然后向肽/目的小分子中添加互补的转肽酶供体序列(试剂序列也取决于使用的转肽酶；对于衍生自酿脓链球菌的转肽酶A，其为LPXTGG)。可以向具有反应性基团的小分子或其他部分添加LPXTGG(在此发明人使用6-FAM，或半抗原4-羟基-3-硝基苯乙酰基，缩写为NP，或Fen-，图7)。

对于芬太尼，转肽酶序列的N末端通过酰胺键连接到位于图7D中的位置处的芬太尼半抗原。虽然大部分可以被衍生，但是保留小分子-肽缀合物(例如NP-GGGSLPSTGG)的抗原性的衍生化必须根据经验确定(例如通过对尼古丁和其他小分子例如NicVax的反复试验来完成)。然后转肽酶使带有NP的肽连接到锥体虫表面上的VSG暴露的N末端(发明人使用抗小分子抗体证实了这一点，图7)。也可能将转肽酶信号序列插入VSG环内(如对2010年Stavropoulos和Papavasiliou的FLAG肽所进行的)。然而，在这种情况下，在VSG环内使用转肽酶供体序列(例如LPXTGG)和在修饰小分子上使用转肽酶受体序列(例如Ala-Ala)以增加特异性是可取的。由于锥体虫表面上VSG的致密包被，小分子在表面上密集展示。一旦将锥体虫注射进哺乳动物宿主内，小分子缀合的VSG包被就暴露于宿主免疫系统，其对暴露的半抗原(例如NP)产生类似于对自然感染中的VSG的强且具有特异性的启动免疫应答(图8)。然后可以用全包被或其制剂(例如可溶性半抗原的VSG，但是其他制剂也是)上的半抗原-VSG缀合物(图8)实现增强，从而实现对此疫苗平台独特的可扩展性。

有趣的是，由不同VSG引起的初次应答不是交叉反应(即针对VSG2产生的抗体与VSG3等不能发生交叉反应。Pinger等人，Nat.Communications，2017)。这表示每个特异性VSG都会引起B细胞特异性的独特的子集(因此，具有独特的库)，其对小分子半抗原的特异性子集的效力可以更大或更小。在本发明的上下文中，针对特定半抗原选择特定VSG，用于引发最佳抗半抗原应答(其中一些VSG平台对某些半抗原更佳，图7)。例如，良好的抗HA(pan-流感)抗体需要IGHV1-69的参与，所述IGHV1-69是一般库中的“稀有”IGH。如果一个人想要使用这种方法来引发多特异性流感抗血清(例如在“pan-flu”疫苗中)，则可以优选使用引发IGHV1-69的VSG。在图11中提供VSG引发不同的B细胞库(该系统可以根据待引发的B细胞的偏好提供一系列不同平台)的直接证据。

生物安全考虑(例如病因)以及阻止天然转换远离半抗原化VSG的需要，指明了衍生化锥体虫包被被灭活(因此不能引起感染)。本发明人已经通过锥体虫的UV交联实现了这一点，所述锥体虫缺少磷脂酰肌醇磷脂酶C(GPI-PLC)，并因此死亡，但是具有完整的VSG包被(GPI-PLC的野生型锥体虫在紫外灭活时会崩解，因为GPI-PLC将每个VSG的GPI连接从膜上切下并脱落包被(如图5所示)。(GPI-PLC-阴性锥虫的)UV交联是通过对来自培养物的细胞造粒，用辐射缓冲液(PBS，补充有55mM葡萄糖)洗涤，并在相同缓冲液中重悬至10⁷个细胞/ml的密度来实现的。然后将1ml该悬浮液等分至6孔组织培养板的每个孔中(Thermoscientific，150239)。使用UVP交联剂对板紫外照射8天，每个周期30s(AnalytikJena)。在照射周期之间旋转平板，以确保对锥体虫进行同等照射。然后将经照射的细胞以15x10⁶个细胞/ml的浓度重悬。可以将200μl该溶液(3 x 10⁶个锥体虫)腹腔内或皮下注射到小鼠中。

总的来说，使用这种失活方案和可分选的VSG，本发明人已经为抗原决定簇的免疫原性展示生成了最佳和灵活的平台，以产生针对小分子半抗原和肽的抗体，其可以扩展至多种多样的抗原实体(例如脂质、核酸等)。关于生成针对小分子(例如NP)的抗体的概念的证明在图9中显示。图9和图10提供了此类抗体可针对芬太尼产生且在产生时可防止中毒的原理证明。图6中显示了小分子6-FAM的整体方法的卡通版本。

图3提供了如何将本发明的工程化VSG整合到布氏锥体虫基因组中的实例。

方法的可推广性：出于本申请的目的，发明人集中于针对芬太尼的主动免疫疗法，所述芬太尼是合成海洛因的掺杂物并且是美国大多数用药过量的原因。这是因为发明人已经有了可用的工具(芬太尼与LPXTGG半抗原化，使得其可以被分选；用于验证可分选性的抗芬太尼抗体)。然而，应清楚这种方法可以容易地适合于产生针对其他药物和药物代谢产物的有效抗体(例如引起肝毒性的对乙酰氨基酚代谢产物，在某些食物过敏中引起过敏性休克的毒素的小分子等)。该方法还可以用于利用衍生自病原体(例如NANP串联重复序列，恶性疟原虫的环子孢子蛋白的主要抗原决定簇)的肽的半抗原化，或利用可用作抗癌疫苗的对癌细胞具有特异性的异常糖基化的肽(例如黏蛋白)的半抗原化(PMID：20403708)。

Claims

1.一种经工程化的变异体表面糖蛋白(eVSG)包覆的抗原颗粒，其中eVSG包含与免疫原性化合物连接的VSG，其中免疫原性化合物是小分子化合物，所述小分子化合物通过接头与VSG的N末端共价连接。

2.根据权利要求1所述的抗原颗粒，其中eVSG从N末端至C末端具有以下共价结构：免疫原性化合物、分选供体序列、分选受体序列、任选的接头、和VSG蛋白序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是小分子药物，例如治疗性化合物和/或依赖性物质。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原颗粒，其中免疫原性化合物是依赖性物质，其选自(i)Δ-9-四氢大麻酚(THC)或合成大麻素，例如传统大麻素、非传统大麻素、混合大麻素、氨基烷基吲哚和类花生酸；例如Δ-9-THC HU-210、(C8)CP 47497、JWH-018、AM-2201(氟化JWH-018)、UR-144、XLR-11(氟化UR-144)、APICA、STS-135(氟化APICA)、AB-PINACA、PB-22、5F-PB-22(氟化PB-22)；或(ii)甲基苯丙胺及其衍生物例如3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA)Ecstasy/Molly；或(iii)合成卡西酮，例如α-吡咯烷基苯基戊酮(α-PVP)；或(iv)阿片样物质，包括海洛因、合成阿片样物质例如芬太尼和其他阿片样止痛药例如氧可酮

氢可酮

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原颗粒，其中颗粒是生物细胞、囊泡、纳米颗粒或珠。

6.根据权利要求5所述的抗原颗粒，其中生物细胞是微生物体，优选原生动物生物体，更优选锥体虫。

7.根据权利要求5至6中任一项所述的抗原颗粒，其中生物细胞是失活生物细胞，优选UV交联的生物细胞。

8.根据前述权利要求中任一项所述的抗原颗粒，其中VSG是衍生自布氏锥体虫基因组的VSG，例如VSG1、VSG2、VSG3或ILTat1.24。

9.一种免疫原性工程化的VSG(ieVSG)蛋白，其在N末端至C末端方向上包含：

(a)免疫原性化合物，

(b)分选供体序列，

(c)分选受体序列，

(d)接头序列，

(e)全长或基本上全长的VSG蛋白。

10.一种系统或试剂盒，其包含组分(i)前ieVSG蛋白和(ii)包含分选供体序列的化合物，其中前ieVSG蛋白在N末端至C末端方向上包含：

(a′)任选的信号肽，

(b′)分选受体序列，

(c′)接头序列，

(d′)全长或基本上全长的VSG蛋白。

11.根据权利要求9所述的系统或试剂盒，其还包含转肽酶，或用于生成转肽酶的工具。

12.根据权利要求10或11所述的系统或试剂盒，其中以用于表达前ieVSG蛋白的核酸序列，例如在生物细胞中表达前ieVSG的核酸序列来提供前ieVSG蛋白。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的系统或试剂盒，其还包含用于将分选供体序列共价连接至用作免疫原的化合物的工具。

14.一种抗原颗粒，其用于预防、管理和/或治疗医学病症，其中抗原颗粒是权利要求1至8中任一项所述的抗原颗粒。

15.根据权利要求14所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症是对依赖性物质的成瘾，其中抗原颗粒的免疫原是依赖性物质。

16.根据权利要求14所述之用途的抗原颗粒，其中医学病症为传染性疾病或癌症，并且其中抗原颗粒的免疫原为分别衍生自引起传染性疾病的传染性生物体或癌症的免疫原性化合物或序列(表位)。

17.根据权利要求14至16中任一项所述之用途的抗原颗粒，其中将抗原颗粒施用至需要预防、管理和/或治疗医学病症的对象，例如以疫苗化合物的形式施用。

18.一种用于生成抗体的方法，所述抗体能够与免疫原性化合物结合，所述方法包括提供根据根据权利要求1至8中任一项所述的抗原颗粒的步骤，其中抗原颗粒的免疫原性化合物是免疫原性化合物或其免疫原性部分，待生成的抗体能够或旨在结合免疫原性化合物或其免疫原性部分；使具有抗原颗粒的产生抗体的非人动物发生免疫；从产生针对所述免疫原的抗体的免疫的动物免疫细胞中分离，和任选地，从所述细胞中分离由此产生的抗体。

19.一种向需要提高免疫应答的对象接种疫苗的方法，其中免疫应答对免疫化合物具有特异性，所述方法包括向对象施用有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的抗原颗粒，所述抗原颗粒足以在对象中诱导针对免疫原性化合物的免疫应答，其中包含在抗原颗粒中的免疫原性化合物与对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物相同或为对增强的免疫应答具有特异性的免疫原性化合物的免疫原性部分。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法用于预防、管理或治疗医学病症，并且其中免疫原性化合物与医学病症有关。