CN113832084A

CN113832084A - 一种生产聚羟基脂肪酸酯的溶藻弧菌及其应用

Info

Publication number: CN113832084A
Application number: CN202111365882.8A
Authority: CN
Inventors: 李正军; 李弘飞
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN113832084B

Abstract

本发明提供了溶藻弧菌及其在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用，所述溶藻弧菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，其菌株号为LHF01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22977。本发明所述菌株能够利用糖类原料或甘油为碳源快速生长并积累聚‑3‑羟基丁酸酯；并能够利用甘油和丙酸为混合碳源快速生长并积累聚(3‑羟基丁酸酯‑co‑3‑羟基戊酸酯)。经过发酵条件的优化，本发明所提供的溶藻弧菌制备聚羟基脂肪酸酯的产量在弧菌属中处于最高水平。

Description

一种生产聚羟基脂肪酸酯的溶藻弧菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物学和发酵工程领域，涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的溶藻弧菌及其应用。

背景技术

塑料几乎影响了我们日常生活的所有领域，从交通、电子、医疗、纺织到包装等。传统的石油来源塑料材料极大的提高了人们的生活质量。然而，这些塑料不可降解，它们的积累造成了严重的环境问题和生态系统的破坏。此外，化石燃料资源日渐枯竭，以及经济社会发展对绿色、低碳和可持续的新需求，使得利用生物可降解、生物可再生的可降解绿色塑料代替传统石化塑料的想法在公众中越来越受欢迎。聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，简称PHA)、聚丁二酸丁二醇酯和聚乳酸等是目前较为可能的传统石化塑料的替代品。

聚羟基脂肪酸酯是由羟基脂肪酸单体聚合得到的一种高分子材料，一般是作为细胞内储存碳和能量的物质，由微生物在营养不平衡的条件下合成。聚羟基脂肪酸酯不仅具有与传统石油基塑料相似的材料学性能，同时还具有生物可降解性、生物相容性和生物可再生性，因此被认为是最具潜力的可降解绿色塑料之一，在医药、农业、化工等领域有着广阔的应用前景，引起了科学界和工业界的广泛兴趣。聚-3-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate，简称PHB)是最早发现、研究最多、结构最简单的聚羟基脂肪酸酯，是3-羟基丁酸单体的均聚物。在此基础上，引入不同的单体单元，可以得到结构多变、性能可调的共聚酯材料。例如，3-羟基丁酸和3-羟基戊酸两种单体的共聚酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，简称PHBV]，克服了聚-3-羟基丁酸酯均聚物结晶度高、难以加工的不利特性。

作为一种环境友好的绿色生物塑料，聚羟基脂肪酸酯具有许多优良特性，但是由于其相对较高的生产成本，目前仅有很小规模的试生产，尚未实现大规模工业化生产和商业应用开发。聚羟基脂肪酸酯的生产成本主要集中在原料、发酵过程和分离提取等方面。使用可再生且廉价的废弃生物质资源，有望降低其生产成本。甘油是生物柴油生产过程中的副产物，将其用作微生物发酵的碳源，有望更好的促进生物柴油产业的发展。与其他碳水化合物相比，甘油中的碳原子处于高度还原状态，用于合成聚羟基脂肪酸酯，可能更有优势。

弧菌广泛分布于河口、海湾和沿海水域的水环境中，细胞一般弯曲成尖弧形或直杆状，鞭毛细长。有的弧菌对鱼类和贝类具有致病性，例如溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌等。部分弧菌通过食用贝类或海水等进入人体后会引发多一些感染疾病，例如腹泻和肠胃炎等，可用庆大霉素等抗菌药物治疗。需钠弧菌在最适宜环境下10分钟就能繁殖一代，比目前应用最广泛的模式微生物大肠杆菌快一倍。解决好弧菌的基因编辑系统和生物安全性等问题，其在科研和工业领域能有非常广阔的应用前景。

在弧菌合成聚羟基脂肪酸酯方面，人们的知识和理解还非常有限，目前只有研究报道了少数几个弧菌属的菌株具有聚羟基脂肪酸酯合成能力，但是普遍产量不高，与常用的聚羟基脂肪酸酯生产菌株例如罗氏真养菌和盐单胞菌等相比还有非常大的差距。关于溶藻弧菌生产聚羟基脂肪酸酯的情况，更是几乎没有文献有详细的研究报道。2019年，在Bioprocess and Biosystems Engineering上发表的Polyhydroxybutyrate productionin halophilic marine bacteria Vibrio proteolyticus isolated from the Koreanpeninsula报道了一株解蛋白弧菌以果糖为碳源发酵，细胞干重和聚羟基脂肪酸酯含量分别达到了4.94g/L和54.7％。2014年，在Annals of Microbiology上发表的Biocompatiblepolyhydroxybutyrate(PHB)production by marine Vibrio azureus BTKB33 undersubmerged fermentation报道了一株远青弧菌以葡萄糖为碳源发酵，细胞干重和聚羟基脂肪酸酯含量分别达到了1.12g/L和42.69％。2012年，在Marine Biotechnology上发表的Biosynthesis of polyhydroxyalkanaotes by a novel facultatively anaerobicVibrio sp.under marine conditions中报道了一株弧菌以大豆油为碳源时，细胞干重和聚羟基脂肪酸酯含量分别达到2.4g/L和8％。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产聚羟基脂肪酸酯的溶藻弧菌及其应用。

为实现上述目的，第一个方面本发明提供溶藻弧菌，本发明所提供的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，其菌株号为LHF01，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22977。以下简称溶藻弧菌CGMCC No.22977。

第二个方面，本发明提供用于制备聚羟基脂肪酸酯的培养物，所述培养物含有上述的溶藻弧菌CGMCC No.22977。

第三个方面，本发明提供上述的溶藻弧菌CGMCC No.22977或上述的培养物在如下任一中的应用：

P1)生产聚羟基脂肪酸酯；

P2)制备用于生产聚羟基脂肪酸酯的产品。

进一步地，上述的应用中，所述聚羟基脂肪酸酯包括聚-3-羟基丁酸酯和/或聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)。

第四个方面，本发明提供制备聚羟基脂肪酸酯的方法，所述方法包括在微生物培养基中培养上述的溶藻弧菌CGMCC No.22977，收集培养物，得到聚羟基脂肪酸酯。

进一步地，所述的方法包括收集溶藻弧菌CGMCC No.22977菌体的步骤。

进一步地，所述的方法中，所述微生物培养基包括溶质和溶剂，所述溶质及其含量可为M1)或M2)，

所述M1)包括碳源10-20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉1g/L，所述碳源包括甘油、蔗糖、淀粉、可溶性淀粉和葡萄糖中的至少一种；

所述M2)包括所述M1)和丙酸；

所述溶剂为人工海水，所述人工海水由溶质和溶剂组成，所述溶质包括氯化钠10-90g/L，氯化钾0.7g/L，氯化镁2.5g/L，硫酸镁3.3g/L，氯化钙1g/L和碳酸氢钠0.2g/L；所述溶剂可为水。

进一步地，所述的方法中，所述人工海水中的氯化钠可为20-50g/L。

进一步地，所述的方法中，所述M1)中所述碳源及其含量可为甘油20g/L、蔗糖20g/L、淀粉10g/L、可溶性淀粉20g/L或葡萄糖20g/L中的至少一种；

所述M2)中丙酸的含量可为4g/L。

所述人工海水中的氯化钠可为50g/L。

进一步地，上述的方法中，所述培养温度可为25-37℃。

进一步地，上述的方法中，所述培养温度可为37℃。

进一步地，上述的方法中，所述微生物培养基的溶质为所述M1)，所述聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯；或，所述微生物培养基的溶质为所述M2)，所述聚羟基脂肪酸酯为聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)。

本发明中，所述培养物是将所述溶藻弧菌CGMCC No.22977在微生物培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

上述物质包括所述溶藻弧菌CGMCC No.22977和所述溶藻弧菌CGMCC No.22977的代谢物。

本发明中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。

本发明中所述固体培养基可由液体培养基中添加15g/L的琼脂粉制备得到。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

本发明中，所述聚羟基脂肪酸酯包括聚-3-羟基丁酸酯(简称PHB)和/或聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(简称PHBV)。所述聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)为含有3-羟基丁酸和3-羟基戊酸两种单体组分的共聚酯。

本发明具有以下优点：

1、本发明所述菌株能够利用甘油为碳源快速生长并积累聚-3-羟基丁酸酯，优化培养条件后聚酯所占细菌干重的比例高达60.97％，摇瓶中产量高达5.08g/L。

2、本发明所述菌株能够利用糖类原料(例如葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉等)为碳源快速生长并积累聚-3-羟基丁酸酯，优化培养条件后聚酯所占细菌干重的比例最高可达42.52％，摇瓶中产量可达1.89g/L。

3、本发明所述菌株能够直接利用淀粉为碳源快速生长并积累聚(3-羟基丁酸酯)，优化培养条件后聚酯所占细菌干重的比例最高可达23.51％，摇瓶中产量可达1.07g/L。

4、本发明所述菌株能够利用甘油和丙酸(浓度4g/L)为混合碳源快速生长并积累聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)，聚酯所占细菌干重的比例可达16.61％，摇瓶中产量可达1.42g/L，3-羟基戊酸单体含量单体含量高达25.03mol％。

经过发酵条件的优化，本发明所提供的溶藻弧菌CGMCC No.22977制备聚羟基脂肪酸酯的产量在弧菌属中处于最高水平。

保藏说明

菌种名称：溶藻弧菌

拉丁名：Vibrio alginolyticus

菌株编号：LHF01

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101

保藏日期：2021年07月28日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22977

附图说明

图1为本发明实施例2中溶藻弧菌菌株在TYS20培养基中的透射电子显微镜照片。

图2为本发明实施例2中溶藻弧菌菌株在添加甘油为碳源的TYS20培养基中的透射电子显微镜照片。

图3为发明实施例7中溶藻弧菌菌株在添加甘油为碳源的TYS50培养基中的透射电子显微镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。聚羟基脂肪酸酯标准品购于Sigma-Aldrich，货号为403105，产品名称为聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)，其中3-羟基丁酸单体含量为92mol％，3-羟基戊酸单体含量为8mol％。

下述实施例中计算细胞干重的方法如下：

微生物发酵培养结束，得到发酵液，10000rpm离心10min，弃上清，用去离子水重悬菌体进行洗涤，10000rpm离心10min收集菌体，放入50ml离心管中，-20℃冷冻1h，再放入冻干机冻干8-10h，得到干细胞。

下述实施例中细胞干重以每升发酵液中的细胞干重计量。

CDW＝(m₁-m₀)/V，

CDW：细胞干重(cell dry weight)，单位g/L，

m₀：进行冷冻干燥前的空离心管的重量，单位g，

m₁：进行冷冻干燥后的离心管的重量，单位g，

V：冻干时的发酵液取量，单位L。

下述实施例中聚羟基脂肪酸酯定量方法为将冷冻干燥的菌体进行酯化反应，通过气相色谱法计算酯化反应后羟基脂肪酸甲酯单体含量进行换算。酯化反应原理为聚羟基脂肪酸酯在100℃和酸性条件下水解得到羟基脂肪酸单体，与酯化液中的甲醇发生酯化反应生成羟基脂肪酸甲酯，溶于有机试剂(氯仿)中，可用气相色谱进行测定。

酯化反应：称取30-40mg冻干产物置于酯化管中，分别加入2ml氯仿和2ml酯化液(15mL浓硫酸，0.5g苯甲酸，甲醇500ml)，加盖密闭，100℃高温反应4h。冷却至室温，加入1ml去离子水，用漩涡振荡器振荡混匀，静置分层，取氯仿相1μL进行气相色谱分析。另取约20mg的聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)标准品，采用同样的方法进行酯化反应后作为标样。

气相色谱分析：使用HP 6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-5毛细管柱，柱长30m，内径320μm，固定相为25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷；检测器为火焰离子化检测器(Flameionization detector，FID)；用高纯氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气；具体条件如下：

(1)柱温：80℃开始，停留1.5min；30℃/min的速率升温到140℃，停留0min；40℃/min的速率升温到220℃，停留1min。总计时间为6.5min。

(2)柱压：10psi开始，停留1.5min；2.5psi/min的速率升压到20psi，停留0.5min。(psi为压力单位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)

(3)进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30。

(4)检测器：温度为220℃，氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min。

使用安捷伦公司的微量进样器，进样量为1μL，采用内标法对聚合物进行定量分析，根据峰面积定量。气相色谱检测时，冻干细胞样品与聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)标品均采用上述步骤进行酯化反应和气相色谱检测，依据样品和标品的出峰位置，判定菌体中积累的聚羟基脂肪酸酯类型。

聚-3-羟基丁酸酯PHB产量计算：

PHB＝(A_PHB/A_Ben)×[(A'_Ben/A'_PHB)×m₂×0.905]/m₃×CDW

PHB：PHB产量，单位g/L

A_PHB：样品中PHB峰面积

A_Ben：样品中内标峰面积

A'_PHB：标品中PHB峰面积

A'_Ben：标品中内标峰面积

m₂：标品质量，单位g

m₃：样品酯化质量，单位g

聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)PHBV产量计算：

PHBV＝PHB+PHV，

其中：

PHB＝(A_PHB/A_Ben)×[(A'_Ben/A'_PHB)×m₂×0.905]/m₃×CDW

PHV＝(A_PHV/A_Ben)×[(A'_Ben/A'_PHV)×m₂×0.905]/m₃×CDW

PHBV：PHBV产量，单位g/L

PHV：PHV产量，单位g/L

A_PHV：样品中PHV峰面积

A'_PHV：标品中PHV峰面积

聚羟基脂肪酸酯含量定义为其占细胞干重的比值：

PHB％＝PHB/CDW×100％

PHBV％＝PHBV/CDW×100％

聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)PHBV中3-羟基戊酸单体摩尔含量：

3HVmol％＝(PHV/100)/(PHV/100+PHB/86)×100％

下文中，TYS20液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L和酵母粉1g/L；溶剂为人工海水。TYS20液体培养基中的人工海水由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为氯化钠20g/L，氯化钾0.7g/L，氯化镁2.5g/L，硫酸镁3.3g/L，氯化钙1g/L和碳酸氢钠0.2g/L；溶剂为水。TYS20液体培养基的pH为7.5。

下文中，TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L和酵母粉1g/L；溶剂为人工海水。TYS50液体培养基中的人工海水由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为氯化钠50g/L，氯化钾0.7g/L，氯化镁2.5g/L，硫酸镁3.3g/L，氯化钙1g/L和碳酸氢钠0.2g/L；溶剂为水。TYS50液体培养基的pH为7.5。

含有20g/L葡萄糖的TYS20液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和葡萄糖20g/L；溶剂为TYS20液体培养基中的人工海水。

含有20g/L蔗糖的TYS20液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和蔗糖20g/L；溶剂为TYS20液体培养基中的人工海水。

含有20g/L可溶性淀粉的TYS20液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和可溶性淀粉20g/L；溶剂为TYS20液体培养基中的人工海水。

含有10g/L淀粉的TYS20液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和淀粉10g/L；溶剂为TYS20液体培养基中的人工海水。

含有20g/L甘油的TYS20液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和甘油20g/L；溶剂为TYS20液体培养基中的人工海水。

含有20g/L葡萄糖的TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和葡萄糖20g/L；溶剂为TYS50液体培养基中的人工海水。

含有20g/L蔗糖的TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和蔗糖20g/L；溶剂为TYS50液体培养基中的人工海水。

含有20g/L可溶性淀粉的TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和可溶性淀粉20g/L；溶剂为TYS50液体培养基中的人工海水。

含有10g/L淀粉的TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和淀粉10g/L；溶剂为TYS50液体培养基中的人工海水。

含有20g/L甘油的TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L和甘油20g/L；溶剂为TYS50液体培养基中的人工海水。

含有20g/L甘油和4g/L丙酸的TYS50液体培养基的组成：由溶质和溶剂组成，溶质及其含量为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，甘油20g/L和丙酸4g/L；溶剂为TYS50液体培养基中的人工海水。

TYS20固体培养基：在上述TYS20液体培养基中添加琼脂15g/L。

TYS50固体培养基：在上述TYS50液体培养基中添加琼脂15g/L。

实施例1、溶藻弧菌CGMCC No.22977的分离及鉴定

1.1、溶藻弧菌CGMCC No.22977的分离：

采集天津市滨海新区盐场盐池水样，吸取1mL水样加入到TYS20液体培养基中，37℃、200rpm培养24h。用已灭菌的接种环在TYS20固体培养基划线，倒置培养24h。挑取单克隆，在TYS20固体培养基平板上纯化。确定为纯菌后，转入斜面4℃短期保存，转入50％甘油管，-80℃长期保存。其中一株分离纯化菌株LHF01即为Vibrio alginolyticus LHF01。

1.2、Vibrio alginolyticus LHF01的鉴定：

(1)菌株LHF01培养性状观察

菌株LHF01接种在TYS20固体培养基上37℃培养10h后，形成1.2-1.8mm，边缘光滑，表面凸起、聚集成乳白色的圆形菌落。透射电镜发现，菌株LHF01细胞呈杆状，呈长椭圆形，并略微弯曲。

(2)16S rDNA序列分析

菌株LHF01具有序列表中序列1所示的16S rDNA序列。

序列表中序列1的大小为1541bp，EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)基因序列对比分析表明，LHF01与Vibrio alginolyticus属内菌株的基因序列相似度较高，相似度最高的菌株为Vibrio alginolyticus NBRC 15630(99.80％)。由此确定本发明的菌株为溶藻弧菌Vibrio alginolyticus。

菌株LHF01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2021年07月28日。保藏号为CGMCC No.22977。菌株名称：溶藻弧菌；拉丁名：Vibrioalginolyticus；参椐的生物材料(株)：LHF01。以下简称溶藻弧菌CGMCC No.22977。

实施例2、利用甘油为碳源生产聚羟基脂肪酸酯

2.1、无菌操作制备溶藻弧菌CGMCC No.22977种子液

(1)菌种活化

取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线至TYS20固体培养基平板，37℃培养16h。

(2)种子液的制备

从步骤(1)的平板上挑取单菌落，接种于TYS20液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12h，得到溶藻弧菌CGMCC No.22977种子液。

2.2、实验设两个处理：实验组和对照组。

实验组：将2.1步骤(2)得到的溶藻弧菌CGMCC No.22977种子液，按照5％的接种量(也即种子液1.5mL，培养基28.5mL)，接种于含有20g/L甘油的TYS20液体培养基，使用250mL摇瓶，总装液量为30mL，37℃、200rpm培养24h，制成发酵液。

对照组：将2.1步骤(2)得到的溶藻弧菌CGMCC No.22977种子液，按5％的接种量(也即种子液1.5mL，培养基28.5mL)，接种于TYS20液体培养基，使用250mL摇瓶，总装液量为30mL，37℃、200rpm培养24h，制成发酵液，作为对照。

2.3、取全部发酵液，置于50mL体积的离心管中，10000rpm离心10min，弃上清液后用去离子水重悬菌体进行洗涤，10000rpm离心10min收集菌体，将装有洗涤后菌体沉淀的离心管置于-20℃冷冻1h，再放入冻干机中冻干10h，得到冻干产物，计算细胞干重。

2.4、将冻干后的部分菌体转移至酯化管中，加入2mL酯化液、2mL氯仿，加盖密闭，100℃烘箱中反应4h；冷却至室温后，加入1mL去离子水，充分振荡，静置分层；待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相，进行气相色谱分析；

通过计算，实验组(甘油为碳源)的细胞干重为8.12g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为1.87g/L，占细胞干重的质量分数为22.96％。

对照组(不添加甘油)，细胞干重为1.42g/L，没有聚羟基脂肪酸酯产生。

同时，利用透射电镜对实施例2中的细菌培养后进行观察，结果分别如图1和图2所示，其中标尺均为1μm。图1对照组中不添加甘油时，细胞内没有观察到大量的白色颗粒。图2实验组中以甘油为碳源时，细菌在细胞内积累了白色聚羟基脂肪酸酯颗粒。

实施例3、利用葡萄糖为碳源生产聚羟基脂肪酸酯

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基替换为含有20g/L葡萄糖的液体TYS20培养基，其它操作均相同。通过计算，葡萄糖为碳源时的细胞干重为1.78g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为0.08g/L，占细胞干重的质量分数为4.74％。

实施例4、利用蔗糖为碳源生产聚羟基脂肪酸酯

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基替换为含有20g/L蔗糖的液体TYS20培养基，其它操作均相同。通过计算，蔗糖为碳源时的细胞干重为4.46g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为1.66g/L，占细胞干重的质量分数为37.14％。

实施例5、利用可溶性淀粉为碳源生产聚羟基脂肪酸酯

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基替换为含有20g/L可溶性淀粉的液体TYS20培养基，其它操作均相同。通过计算，可溶性淀粉为碳源时的细胞干重为7.40g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为0.55g/L，占细胞干重的质量分数为7.44％。

实施例6、利用淀粉为碳源生产聚羟基脂肪酸酯

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基替换为含有10g/L淀粉的液体TYS20培养基，发酵结束后取1ml发酵液，用碘液检测培养液中是否变蓝。培养24h后，发酵液加入碘液后未变蓝，说明淀粉完全被消耗。通过计算，淀粉为碳源时的细胞干重为4.13g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为0.95g/L，占细胞干重的质量分数为23.12％。

实施例7、利用不同氯化钠浓度优化发酵条件

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基中氯化钠的浓度呈梯度改变，即0、10、20、30、40、50、60、70、80、90g/L，对应的培养基分别为TYS0、TYS10、TYS20、TYS30、TYS40、TYS50、TYS60、TYS70、TYS80、TYS90培养基，其它操作均相同。通过计算，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，详细结果如表1所示。

表1不同氯化钠浓度条件下溶藻弧菌生产聚羟基脂肪酸酯

由上述结果可以得知，培养基中氯化钠浓度为50g/L时，溶藻弧菌生产聚羟基脂肪酸酯的产量最高，达到5.08g/L。同时，利用透射电镜对该条件下的细菌细胞进行观察，结果如图3所示，其中标尺均为1μm。图3中以甘油为碳源，培养基中氯化钠浓度为50g/L时，细菌在细胞内积累了大量白色聚羟基脂肪酸酯颗粒。

实施例8、利用不同发酵温度优化发酵条件

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基替换为含有20g/L甘油的TYS50液体培养基，发酵温度分别为25℃、30℃、37℃、42℃，其它操作均相同。通过计算，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，详细结果如表2所示。

表2不同发酵温度条件下溶藻弧菌生产聚羟基脂肪酸酯

由上述结果可以得知，发酵温度为37℃时，溶藻弧菌生产聚羟基脂肪酸酯的产量最高，达到5.08g/L。当温度提高到42℃时，没有检测到聚羟基脂肪酸酯积累。

实施例9、利用不同碳源在最优的氯化钠和温度条件下生产聚羟基脂肪酸酯

具体操作按照本发明实施例2，不同的是，将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基分别替换为含有20g/L葡萄糖的TYS50液体培养基、含有20g/L蔗糖的TYS50液体培养基、含有20g/L可溶性淀粉的TYS50液体培养基、含有10g/L淀粉的TYS50液体培养基，其它操作均相同。通过计算，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，详细结果如表3所示。

表3最优氯化钠和温度条件下利用不同碳源生产聚羟基脂肪酸酯

通过发酵条件的优化，以葡萄糖为碳源时，聚羟基脂肪酸酯的产量由实施例3的0.08g/L提高到1.19g/L；以蔗糖为碳源时，聚羟基脂肪酸酯的产量由实施例4的1.66g/L提高到1.89g/L；以可溶性淀粉为碳源时，聚羟基脂肪酸酯的产量由实施例5的0.55g/L提高到1.65g/L；以淀粉为碳源时，聚羟基脂肪酸酯的产量由实施例6的0.95g/L提高到1.07g/L。

实施例10、以甘油和丙酸为混合碳源生产聚羟基脂肪酸酯

具体操作按照本发明实施例2，不同的是将实验组中的含有20g/L甘油的TYS20液体培养基替换为含有20g/L甘油和4g/L丙酸的TYS50液体培养基，其它操作均相同，检测聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)的积累。通过计算，以甘油和丙酸为碳源时，通过发酵培养可以得到聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)，细胞干重为8.55g/L，聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)产量为1.42g/L，占细胞干重的质量分数为16.61％，3-羟基戊酸单体含量为25.03mol％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种生产聚羟基脂肪酸酯的溶藻弧菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1541

<212> DNA

<213> 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

<400> 1

aggtgatcca gcgccaggtt cccctagcgc taccttgtta cgacttcacc ccagtcatga 60

accacaaagt ggtaagcgtc cccccgaagg ttaaactacc tacttctttt gcagcccact 120

cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt ggcattctga 180

tccacgatta ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggacta 240

cgacgcactt tttgggattc gctcactttc gcaagttggc cgccctctgt atgcgccatt 300

gtagcacgtg tgtagcccta ctcgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc 360

ctccggttta tcaccggcag tctccctgga gttcccgaca ttactcgctg gcaaacaagg 420

ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatttc acaacacgag ctgacgacag 480

ccatgcagca cctgtctcag agttcccgaa ggcaccaatc catctctgga aagttctctg 540

gatgtcaaga gtaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat gctccaccgc 600

ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg 660

tctacttaac gcgttagctc cgaaagccac ggctcaaggc cacaacctcc aagtagacat 720

cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgcatct 780

gagtgtcagt atctgtccag ggggccgcct tcgccaccgg tattccttca gatctctacg 840

catttcaccg ctacacctga aattctaccc ccctctacag tactctagtc tgccagtttc 900

aaatgctatt ccgaggttga gccccgggct ttcacatctg acttaacaaa ccacctgcat 960

gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg ctcgcaccct ccgtattacc gcggctgctg 1020

gcacggagtt agccggtgct tcttctgtcg ctaacgtcaa ataatgcagc tattaactac 1080

actaccttcc tcacgactga aagtgcttta caacccgaag gccttcttca cacacgcggc 1140

atggctgcat caggcttgcg cccattgtgc aatattcccc actgctgcct cccgtaggag 1200

tctggaccgt gtctcagttc cagtgtggct gatcatcctc tcagaccagc tagggatcgt 1260

tgccttggtg agcccttacc tcaccaacta gctaatccca cctaggcata tcctgacgcg 1320

agaggcccga aggtccccct ctttggcccg taggcatcat gcggtattag ccatcgtttc 1380

caatggttat cccccacatc agggcaattt cctaggcatt actcacccgt ccgccgctcg 1440

acgccgttat cgttccccga aggttcagat aactcgtttc cgctcgactt gcatgtgtta 1500

ggcctgccgc cagcgttcaa tctgagccat gatcaaactc t 1541

Claims

1.溶藻弧菌，其特征在于，为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，其菌株号为LHF01，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22977。

2.用于制备聚羟基脂肪酸酯的培养物，其特征在于，所述培养物含有权利要求1所述的溶藻弧菌。

3.权利要求1所述的溶藻弧菌或权利要求2所述的培养物在如下任一中的应用：

P1)生产聚羟基脂肪酸酯；

P2)制备用于生产聚羟基脂肪酸酯的产品。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述聚羟基脂肪酸酯包括聚-3-羟基丁酸酯和/或聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)。

5.制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物培养基中培养权利要求1所述的溶藻弧菌，收集培养物，得到聚羟基脂肪酸酯。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括收集溶藻弧菌菌体的步骤。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述微生物培养基包括溶质和溶剂，所述溶质及其含量为M1)或M2)，

所述M2)包括所述M1)和丙酸；

所述溶剂为人工海水，所述人工海水由溶质和溶剂组成，所述溶质包括氯化钠10-90g/L，氯化钾0.7g/L，氯化镁2.5g/L，硫酸镁3.3g/L，氯化钙1g/L和碳酸氢钠0.2g/L；所述溶剂为水。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述M1)中所述碳源及其含量为甘油20g/L、蔗糖20g/L、淀粉10g/L、可溶性淀粉20g/L或葡萄糖20g/L中的至少一种；

所述M2)中丙酸的含量为4g/L；

所述人工海水中的氯化钠为50g/L。

9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养温度为25℃-37℃。

10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物培养基的溶质为所述M1)，所述聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯；或，所述微生物培养基的溶质为所述M2)，所述聚羟基脂肪酸酯为聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)。