CN113832028A - 一种全自动细胞培养系统及培养方法 - Google Patents
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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- C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
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- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
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- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/48—Automatic or computerized control
Abstract
本发明公开了一种全自动细胞培养系统及培养方法，全自动细胞培养系统包括：细胞前处理单元，对采集物或外周血进行处理，获得目标细胞；培养单元，用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；转染单元，用于对目标细胞进行转染；收集单元，用于收集扩增培养后的转染细胞；控制单元，用于接收、存储信息，并根据存储程序控制各单元的动作。本发明的全自动细胞培养系统可以全自动化完成整个细胞培养过程，占用空间少，集成化程度高，可以大大节约空间场地的占用和对人工、能源的需求，效率大大提高。
Description
技术领域
本发明属于免疫治疗领域，具体地说，涉及一种全自动细胞培养系统及培养方法。
背景技术
现代肿瘤治疗始于1809年12月，美国的Ephaim Mcdowell医生为Jane Crawford夫人手术切除了卵巢肿瘤。现代肿瘤放疗始于1895年伦琴发现了X射线，1898年居里夫妇成功分离出放射性元素镭，1902年第一例皮肤癌患者接受了放射治疗。现代意义上的化疗始自1942 年使用氮芥对恶性淋巴瘤的成功治疗。纵观西方医学200多年的肿瘤手术治疗史，100多年的肿瘤放射治疗史、近80年的肿瘤化疗史，三种传统的治疗方法逐渐走向极致，虽然取得了巨大成就，但距离人类完全战胜肿瘤还遥遥无期。
肿瘤的免疫治疗始于100多年前的一次意外的发现，美国纽约的Coley医生观察到一例链球菌感染的肉瘤患者在一次次的高热后，肉瘤逐渐消失。Coley医生想到可能是链球菌感染激活了患者内在的免疫系统，通过增强免疫力而最终治愈了肿瘤。他在此基础上发明了Coley 毒素用于治疗一些肿瘤患者，但由于相关毒副作用饱受争议而没有流传。直到上个世纪60年代，Burnet等人提出“肿瘤免疫监视学说”并随后被实验证实，自此肿瘤免疫学才逐步发展起来。近年来，随着抗体分子靶向药物的兴起，特别是CART疗法在急性淋巴细胞白血病中获得巨大成功，肿瘤的免疫治疗终于翻开了新的一页，并日益焕发出勃勃生机。肿瘤免疫治疗的历史比放疗和化疗还长，目前被认为是现代肿瘤治疗中继手术、放疗和化疗之后的第四种模式。
随着时代的发展和基因组学、肿瘤免疫学、人工智能和纳米技术等的进步，这些技术为人类攻克肿瘤整个顽疾奠定了必要的基础。其中，随着嵌合抗原受体T细胞(CART)技术的不断完善，血液肿瘤是摆在我们面前的一个即将被攻克的领域，换句话讲，即血液肿瘤(包括成人的各种血液肿瘤疾病)迎来了医学史上“百年未有之大变局”。当前，越来越多的疾病类型，如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌和一些自身免疫性疾病可以通过上述技术获得非常不错的临床疗效。传统的DC-CIK等技术在某些疾病类型中也具有一定程度的治疗效果，基于TCR-T、CAR-NK、通用性CART等技术也在蓬勃开展。另外，干细胞技术、诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPScells)、间质基质细胞和来自其它组织的干细胞技术具有治疗很多疾病的潜力，这些技术最终需要转化为临床治疗方案。上述来自于干细胞和体细胞的细胞治疗产品生产需要在GMP条件下完成，需要符合GMP药品生产质量管理规范，这些规范是为保证药品在规定的质量下持续生产的体系。GMP包含方方面面的要求，从厂房到地面、设备、人员和培训、卫生、空气和水的纯化、生产和文件等。其终极目标是通过防止污染和差错来保证药品生产质量，确保每一针、每一粒药都必须安全和有效。由于来源于单个人的样本进行的细胞治疗产品需要在单一的GMP房间中完成制备，因此相应的GMP生产车间动辄需要几百上千平米的厂房。作为生产的终端房间也需要一定的空间，GMP生产车间需要保持24小时的空气过滤和压力调整，从而对占地和能源具有很大的需求。
上述GMP产品的生产中，很多操作均形成了固化的实验流程，但需要大量的人工进行操作。由于人工操作中难免出现差错，且生产企业需要为申报相应的药品注册而准备大量的材料和实验数据，从而在一定程度上限制了上述技术的推广和整个产业的发展。
基于此，目前临床上亟需一种全自动化的检测和生产设备，可以将固化的检测和/或生产流程进行高度整合，从而在很大程度上部分或者全部替代人工，同时降低可能的安全风险，获得精准的检测结果和质量合格的细胞治疗产品。另外，由于场地、能源和申报等多个方面的限制，也需要对现有GMP生产条件进行高度集成设置，从而可以大大节约空间场地的占用和对能源的需求。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种全自动细胞培养系统及培养方法。本发明的全自动细胞培养系统可以全自动化完成多种细胞培养，集成化程度高，占用空间少，可以大大节约空间场地的占用和对人工、能源的需求，效率大大提高。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种全自动细胞培养系统，包括：
细胞前处理单元，对采集物或外周血进行处理，获得目标细胞；
培养单元，用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；
转染单元，用于对目标细胞进行转染；
收集单元，用于收集扩增培养后的转染细胞；
控制单元，用于接收、存储信息，并根据存储程序控制各单元的动作。
针对细胞培养中的具体步骤，本发明的全自动细胞培养系统包括但不限于完成以下步骤：将采集物或外周血中单个核细胞分离、目标细胞分选、病毒转染、细胞扩增、细胞收集和/或细胞冻存。细胞前处理单元用于对采集物或外周血进行处理，可以进行分离、分选等处理过程，制备待培养的目标细胞。培养单元用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；转染单元用于对目标细胞进行转染。收集单元用于收集扩增培养后的转染细胞，可以普通收集，也可以冻存收集处理。
本发明的全自动细胞培养系统将完成以上所有过程的装置整合到一套封闭的管道系统中，连接外界储仓(储袋)的管道通过带有0.22um的滤膜与外界空气相通，可以避免细胞制备过程中污染的风险，也有利于出厂前使用环氧乙烷等对整个管道系统进行消毒处理。本发明的全自动细胞培养系统可以全自动化完成整个细胞培养过程，占用空间少，集成化程度高，可以大大节约空间场地的占用和对人工、能源的需求，效率大大提高。
本发明的全自动细胞培养系统可以用于培养CART细胞、NK细胞、DC细胞、DC-CIK细胞、CARNK细胞、巨噬细胞、间质基质细胞、iPS细胞、干细胞等各种细胞，满足进行临床细胞治疗的需求，也可以用于其他目的需求的细胞培养。
较为具体的，全自动细胞培养系统培养的细胞可以为干细胞，也可以为体细胞，前者包括胚胎干细胞、造血干细胞等各种组织来源的干细胞、诱导多能干细胞(Inducedpluripotent stem cells,iPS cells)等各种人体或者非人体来源的干细胞，后者包含各种T细胞、B细胞、 NK细胞、巨噬细胞
NKT、间质基质细胞、肝细胞、胰腺上皮细胞、各种腺体细胞、骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、各种上皮细胞、肌细胞、脂肪(干)细胞、各种内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞等。非自体来源的细胞还包括各种细胞株、基因工程细胞、非人源细胞(如各种哺乳动物细胞、昆虫细胞、疟原虫、各种细菌)等。
进一步的方案，所述细胞前处理单元包括第一分离装置和原料输送管路；所述第一分离装置具有第一分离腔，所述第一分离腔通过第一管路与原料输送管路连通。
优选的，所述的原料输送管路一端与第一管路连通，另一端为盲端，可配置为连接原料储仓；更优选的，另一端为连接过滤器的盲端。
原料输送管路用于供给处理细胞所用的各种试剂，对于不同的细胞，所用的试剂并不相同，因此，将原料输送管路的自由端设置为盲端，用于连接不同的原料，能够保证整个系统的正常、安全运行。
原料输送管路的另一端配置为连接过滤器的盲端的连接方式适用于无颗粒物的培养基、洗涤液等，不适用于血液成分和磁珠等孔径大于0.22um的液体流通。连接器顶端是橡胶材质的钟形接口，有利于带有穿刺针的外界管道连接。
优选的，所述第一管路上设有第一泵送装置，用于将原料输送管路中的原料输送至第一分离腔中。
进一步的方案，所述第一分离装置包括圆柱型的壳体，壳体内设有可上下运动的活塞，活塞内部中空并形成第一腔室，活塞朝向壳体底部的一端设有微孔滤膜，所述微孔滤膜下方的壳体内部空间形成第一分离腔；
优选的，所述的第一分离装置的壳体的外部套设有第一环形磁铁，所述第一环形磁铁可沿壳体上下运动，用于吸附磁珠。
进一步的方案，所述培养单元包括细胞培养装置和培养基输送管路，所述细胞培养装置包括细胞培养仓，所述细胞培养仓通过第二管路与第一分离腔连通，所述培养基输送管路一端为盲端，可配置为连通培养基储仓，另一端分别与细胞培养仓、第二管路连通；
优选的，所述第二管路上设有可双向输送的第二泵送装置，所述第二泵送装置将第一分离装置中的液体泵出，或将液体泵入第一分离装置。
本发明中，细胞培养仓设置为阶梯状结构，确保在细胞体积小的情况下和细胞体积增大的情况下，细胞都可以进行培养。
细胞培养装置中设有搅拌装置，搅拌装置采用多层桨叶结构，电机驱动下桨叶缓慢转动，通过顺时针和逆时针交替转动，可以在细胞培养仓中形成湍流，有利于待培养的细胞获得充分的营养和氧气。多层桨叶结构从低到高依次增加桨叶的面积，从而可以带动越来越多的培养基运动，使得细胞培养仓中细胞可以充分混匀。
另外，细胞培养仓中设有混合空气开口(95％的空气，5％的二氧化碳)，也有用于检测葡萄糖、乳酸和/或PH监测装置。细胞培养仓上还有取样管道，可以进行实时采样。本发明的全自动细胞培养系统可以通过监测培养基中葡萄糖、乳酸和/或PH值的变化进行自动化补液等操作，不仅可以大大节约人工，更为重要的是可以依据监测数值变化和现有培养基体积来动态计算补液量，使得待培养的细胞时刻处于最适合的细胞生长密度范围。
细胞培养仓通过十字卡口紧扣到底座上，该底座上带有加热盘，通过与细胞培养仓密切接触，可以对细胞培养仓进行加热，确保细胞培养仓中的温度保持在36.5-37.5℃之间。
进一步的方案，所述转染单元包括转染原料输送管路，所述转染原料输送管路一端与培养单元连通；另一端为盲端，可配置为连通转染原料储仓；
优选的，包括多条转染原料输送管路，多条转染原料输送管路的一端分别连通不同的转染原料储仓，另一端与第三管路连通，所述第三管路与细胞培养仓连通，第三管路上设有第三泵送装置。
进一步的方案，所述收集单元包括第二分离装置、生理盐水输送管路和收集管路；所述第二分离装置具有第二分离腔，所述第二分离腔通过第四管路与培养单元连通，通过第五管路与生理盐水输送管路、收集管路连通；
优选的，所述第四管路上设有第四泵送装置，第五管路上设有第五泵送装置；
优选的，所述第二分离装置包括壳体，壳体内设有可上下运动的活塞，活塞内部中空并形成第二腔室，活塞朝向壳体底部的一端设有微孔滤膜，所述微孔滤膜下方的壳体内部空间形成第二分离腔；
优选的，所述的第二分离装置的壳体的外部套设有第二环形磁铁，所述第二环形磁铁可沿壳体上下运动；
优选的，所述第五管路上设有第三环形磁铁。
进一步的方案，还包括废液回收单元，所述废液回收单元包括废液回收管路，所述第一分离装置的第一腔室中设有第一排出管路，第一排出管路的一端与微孔滤膜之间具有间距，另一端与废液回收管路连通；所述第二分离装置的第二腔室中设有第二排出管路，第二排出管路的一端与微孔滤膜之间具有间距，另一端与废液回收管路连通；
优选的，废液回收管路包括第一回收管路和第二回收管路，第一回收管路一端配置为连通废液回收仓，另一端与第二管路连接，第一排出管路一端也与第二管路连接，第二泵送装置位于两个连接点之间的第二管路上；
第二回收管路一端配置为连通废液回收仓，另一端与第四管路连接，第二排出管路也与第四管路连接，第四泵送装置设置在两个连接点之间的第四管路上。
进一步的方案，全自动细胞培养系统中的所有管路上均设有控制管路开启/关闭的控制阀，所述控制单元与控制阀、泵送装置电连接，控制其开启和关闭。
本发明中，全自动细胞培养系统采用独特的分离装置、微孔滤膜、泵送装置和控制阀，可以实现对目标细胞的自动化洗涤与浓缩。
第一分离装置和第二分离装置是进行细胞洗涤和体积浓缩的关键部件，第一分离装置的第一分离腔中的血制品经过裂解红细胞后体积较大，在机械臂的牵引下，第一分离装置的活塞向下运动，由于活塞是中空的，活塞顶部覆盖有机械或者丝质微孔滤膜，可以对超过微孔孔径的细胞起到阻碍和截留作用。裂解液中的红细胞碎片和小于微孔孔径的颗粒物质(包括未裂解完全的有核红细胞和成熟红细胞)可以透过，进入活塞中的第一腔室内。活塞降落到接近管底时，微孔滤膜上的管道可以将过滤后的裂解液在蠕动泵的作用下吸到废液袋中。然后活塞在机械臂牵引下缓慢上移，清洗液(培养基)可以在蠕动泵的作用下缓缓流入第一分离腔中，从而稀释未滤过的细胞悬液。随后多次控制活塞上下运动，可以对第一分离腔中的细胞起到洗涤和浓缩作用。
微孔滤膜采用金属或者非金属筛网或者丝网，网孔大小1um-10um左右，一般取固定的均匀网孔(比如3um或者5um)，可以对流动液体中大于上述网孔直径的细胞起到截留作用。本发明中，在第一分离装置和第二分离装置的活塞朝向底部的一端覆盖均匀孔径大小的微孔滤膜，通过机械手或者其它装置控制活塞上下运动，可以对第一分离腔或第二分离腔中的细胞起到过滤作用，不会对其中的细胞产生损伤。根据所需过滤细胞的多少，微孔滤膜的直径可以低至4mm，也可以高至120mm或者更高，从而可以满足对不同细胞数量过滤的需求。
微孔滤膜依据需要分离的细胞类型大小进行设计，一般而言对于淋巴细胞，5um的滤膜可以很好的过滤。为防止微孔滤膜局部孔径不标准，可以设计成双层滤膜，在通透压力不太大的情况下，双层滤膜更为可靠。
泵送装置，也就是泵，为蠕动泵，可以驱动管道中的液体定向流动，可以顺时针或者逆时针方向转动，在控制下改变泵送方向，从而可以集成管路，节省成本和占用空间。
各个管路上均设有控制阀，控制阀为电控制的开关，通过挤压管道起到开放和关闭管道中的液体流动作用。在控制单元的控制下，不同管路上的控制阀开启或者闭合，可以达到不同的输送目的。
进一步的，本发明的全自动细胞培养系统采用全封闭的管道系统，通过0.22um滤膜和外界联通。该系统还可以被放置到一个生物安全柜中，或者将设备与生物安全柜进行整合，体积上满足整合设备所需的空间要求，生物安全柜的上部、底部或者侧面包含风机，通过调整过滤空气的压力和风向，形成符合GMP洁净要求的细胞培养全自动化洁净实验室。
本发明的全自动细胞培养系统满足国家对GMP实验室和车间的要求。GMP生产质量管理规范是为保证药品在规定的质量下持续生产的体系，是为把药品生产过程中的不合格的危险降低到最小而订立的。GMP包含方方面面的要求，从厂房到地面、设备、人员和培训、卫生、空气和水的纯化、生产和文件等。其终极目标是通过防止污染和差错来保证药品生产质量，确保每一针、每一粒药都必须安全和有效。
本发明的全自动细胞培养系统将复杂和重复的人工操作整合到一个系统中，不仅可以达到自动化的要求，更重要的是将原本需要几百平方米的实验室浓缩到极小的空间内，在满足 GMP要求的基础上，还可以大大的节约场地和能源需求。国家对GMP中产品生产的要求是单个人来源的样本需要在独立的单间GMP房间中进行，这样势必造成GMP车间需要同时设置为数众多的GMP房间，并保证24小时的持续空气过滤。比如一个20平方米的GMP房间需要对60-80立方米的房间进行持续的空气过滤和压力维持，势必需要消耗很多能源。本发明通过将GMP房间浓缩到几升或者仅1立方米左右的空间中，可以节约大量空间，同时还可以大大节约各种缓冲间、走廊等所需的对空气过滤和压力调节的需求，从而可以大大的降低对能源的需求。
本发明的全自动细胞培养系统可以申请GMP实验室的器械资质，方便使用者进行后续的实验，避免重复的申报，后者需要耗费大量的人力和物力。同时在软件设计时制定各种中间检测质控，自动化生成相应的文件，方便国家各类监管机构进行集中和分散检查。
本发明的全自动细胞培养系统通过自动化软件控制，可以完成管道系统的质控、经联网实现远程启动和关闭必要的操作步骤。自动化软件可以对整个系统进行全面质检和控制，驱动泵、阀门和活塞的精确运动。通过控制某些泵、阀门和活塞的联动，可以实现对采集物或外周血中单个核细胞分离、目标细胞分选、病毒转染、细胞扩增、细胞收集和细胞冻存等操作，上述每一个操作可以是整个软件体系中的一部分，也可以成为独立的体系，单独驱动设备进行某类操作。
进一步的，通过自动化软件控制，借助于有线或者无线网络(4G、5G等)，可以远程对设备进行精确的控制，如远程启动或者关闭某项操作，远程日志传输和程序审查，以及对机器采集的数据进行智能化处理等。
本发明的第二目的是提供一种如上所述的全自动细胞培养系统的培养方法，包括以下步骤：
(1)控制单元控制细胞前处理单元对采集物或外周血进行分离、分选，获得目标细胞；
(2)将目标细胞输送至培养单元，对获得的目标细胞进行扩增培养；
(3)控制单元控制转染单元对目标细胞进行转染，并控制培养单元再次进行扩增培养；
(4)控制单元控制收集单元收集扩增培养后的转染细胞。
进一步的方案，包括：
(1)血袋中的血液通过第一管路流入第一分离腔，裂解液袋中的裂解液通过第一管路流入第一分离腔中，裂解细胞；
(2)裂解完成后，培养基储仓中的培养基流入第一分离腔中，第一分离装置的活塞下降至距离底部一定距离停止，部分液体经微孔滤膜进入第一腔室，将第一腔室中的液体泵送至废液回收仓，活塞上升；重复上述步骤，清洗三次；
(3)CD3磁珠袋中的CD3磁珠通过第一管路流入第一分离腔，维持T时间后，第一环形磁铁向上运动至离底部m距离时停止，吸附CD3磁珠，微孔滤膜下未与磁珠结合的液体输送至废液回收仓；第一环形磁铁下降至第一分离腔底部以下；
(4)培养基储仓中的培养基流入第一分离腔中，得到的液体输送至细胞培养仓中进行扩增培养，取样检测；
(5)转染原料储仓中的蛋白、病毒按照设定时间依次经过第三管路进入细胞培养仓中，进行转染后，继续培养，补加培养基和CD3磁珠；
(6)细胞增殖到一定程度后，将细胞培养仓中的细胞泵送至第二分离腔中，第二分离装置的活塞下降至距离底部n，第二环形磁铁上升至距离底部h处吸附磁珠；第二腔室中的液体输送至废液回收仓；活塞再上升至壳体内最高处；向第二分离腔中输入生理盐水，活塞再下降，重复上述步骤洗涤3次后，活塞升至最高处；输入生理盐水，将细胞液输送至收集管路，得到培养的细胞。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
针对细胞培养中的具体步骤，本发明的全自动细胞培养系统包括但不限于完成以下步骤：将采集物或外周血中单个核细胞分离、目标细胞分选、病毒转染、细胞扩增、细胞收集和/或细胞冻存。细胞前处理单元用于对采集物或外周血进行处理，可以进行分离、分选等处理过程，制备待培养的目标细胞。培养单元用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；转染单元用于对目标细胞进行转染。收集单元用于收集扩增培养后的转染细胞，可以普通收集，也可以冻存收集处理。
本发明的全自动细胞培养系统将完成以上所有过程的装置整合到一套封闭的管道系统中，连接外界储仓(储袋)的管道通过带有0.22um的滤膜与外界空气相通，可以避免细胞制备过程中污染的风险，也有利于出厂前使用环氧乙烷等对整个管道系统进行消毒处理。
本发明的全自动细胞培养系统可以全自动化完成整个细胞培养过程，占用空间少，集成化程度高，可以大大节约空间场地的占用和对人工、能源的需求，效率大大提高。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是本发明的全自动细胞培养系统的结构示意图；
图2是本发明不同状态下的第一分离装置/第二分离装置的示意图；对细胞具有洗涤和浓缩作用；
图3是本发明的微孔滤膜的结构示意图；
图4是本发明细胞培养装置的结构示意图；
图5是本发明细胞培养装置中的搅拌结构的示意图；
图6是本发明带有滤膜的连接器的示意图；
图中：101第一分离装置，102第一分离腔，103第一腔室，104第一环形磁铁，105原料输送管路，106第一管路，107第一泵送装置，108过滤器；
120活塞，121微孔滤膜，
201细胞培养装置，202细胞培养仓，203培养基输送管路，204第二管路，205第二泵送装置；206葡萄糖/乳酸监测电极，207取样管道，208二氧化碳监测电极，209空气和二氧化碳接入开口，210搅拌装置，211桨叶，212轴；
301转染原料输送管路，302第三管路，303第三泵送装置；
401第二分离装置，402第二分离腔，403第二腔室，404第二环形磁铁，405生理盐水输送管路，406收集管路，407第四管路，408第五管路，409第四泵送装置，410第五泵送装置，411第三环形磁铁；
501第一排出管路，502第二排出管路，503第一回收管路，504第二回收管路。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
具体实施方式中，参考图1-6，本发明提供一种全自动细胞培养系统，包括：
细胞前处理单元，对采集物或外周血进行处理，获得目标细胞；
培养单元，用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；
转染单元，用于对目标细胞进行转染；
收集单元，用于收集扩增培养后的转染细胞；
控制单元，用于接收、存储信息，并根据存储程序控制各单元的动作。
针对细胞培养中的具体步骤，全自动细胞培养系统包括但不限于完成以下步骤：将采集物或外周血中单个核细胞分离、目标细胞分选、病毒转染、细胞扩增、细胞收集和/或细胞冻存。细胞前处理单元用于对采集物或外周血进行处理，可以进行分离、分选等处理过程，制备待培养的目标细胞。培养单元用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；转染单元用于对目标细胞进行转染。收集单元用于收集扩增培养后的转染细胞，可以普通收集，也可以冻存收集处理。
该全自动细胞培养系统将完成以上所有过程的装置整合到一套封闭的管道系统中，连接外界储仓(储袋)的管道通过带有0.22um的滤膜与外界空气相通，可以避免细胞制备过程中污染的风险，也有利于出厂前使用环氧乙烷等对整个管道系统进行消毒处理。本发明的全自动细胞培养系统可以全自动化完成整个细胞培养过程，占用空间少，集成化程度高，可以大大节约空间场地的占用和对人工、能源的需求，效率大大提高。
本发明的全自动细胞培养系统可以用于培养CART细胞、NK细胞、DC细胞、DC-CIK细胞、CARNK细胞、巨噬细胞、间质基质细胞、iPS细胞、干细胞等各种细胞，满足进行临床细胞治疗的需求，也可以用于其他目的需求的细胞培养。
较为具体的，全自动细胞培养系统培养的细胞可以为干细胞，也可以为体细胞，前者包括胚胎干细胞、造血干细胞等各种组织来源的干细胞、诱导多能干细胞(Inducedpluripotent stem cells,iPS cells)等各种人体或者非人体来源的干细胞，后者包含各种T细胞、B细胞、 NK细胞、巨噬细胞
NKT、间质基质细胞、肝细胞、胰腺上皮细胞、各种腺体细胞、骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、各种上皮细胞、肌细胞、脂肪(干)细胞、各种内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞等。非自体来源的细胞还包括各种细胞株、基因工程细胞、非人源细胞(如各种哺乳动物细胞、昆虫细胞、疟原虫、各种细菌)等。
进一步的方案，所述细胞前处理单元包括第一分离装置101和原料输送管路105；所述第一分离装置101具有第一分离腔102，所述第一分离腔102通过第一管路106与原料输送管路105连通。
所述第一分离装置101包括壳体，壳体内设有可上下运动的活塞120，活塞120内部中空并形成第一腔室103，活塞120朝向壳体底部的一端设有微孔滤膜121，所述微孔滤膜121 下方的壳体内部空间形成第一分离腔102；所述的第一分离装置101的壳体的外部套设有第一环形磁铁104，所述第一环形磁铁104可沿壳体上下运动。
所述的原料输送管路105一端与第一管路106连通，另一端为盲端，可配置为连接不同的原料储仓；更优选的，另一端为连接过滤器108的盲端。过滤器108的结构示意图参考图 6，起到过滤作用的可以为0.22um滤膜。
所述第一管路106上设有第一泵送装置107，用于将原料输送管路105中的原料输送至第一分离腔102中。第一泵送装置107设置在第一管路106上靠近第一分离装置101的位置，能够泵送所有原料输送管路105中的物料。
原料输送管路105可以包括多条，原料输送管路105用于供给处理细胞所用的各种试剂，对于不同的细胞，所用的试剂并不相同，因此，将原料输送管路105的自由端设置为盲端，用于连接不同的原料，能够保证整个系统的正常、安全运行。
原料输送管路105的另一端配置为连接过滤器108的盲端的连接方式适用于无颗粒物的培养基、洗涤液等，过滤器108为0.22um的滤膜，不适用于血液成分和磁珠等孔径大于0.22um 的液体流通。连接器顶端是橡胶材质的钟形接口，有利于带有穿刺针的外界管道连接。
例如，参考图1中所示，原料输送管路105包括3条，盲端分别连接一次性血袋、裂解液袋、CD3磁珠袋。连接裂解液袋的原料输送管路105上连接过滤器108，连接一次性血袋、CD3磁珠袋的原料输送管路105上不连接过滤器108。3条原料输送管路105上设置控制阀，控制按照设定程序输送不同的原料。
进一步的方案，所述培养单元包括细胞培养装置201和培养基输送管路203，所述细胞培养装置201包括细胞培养仓202，所述细胞培养仓202通过第二管路204与第一分离装置 101的第一分离腔102连通，所述培养基输送管路203一端为盲端，可配置为连通培养基储仓，另一端分别与细胞培养仓202、第二管路204连通。所述第二管路204上设有可双向输送的第二泵送装置205，所述第二泵送装置205可以将第一分离腔102中的液体泵出，或将液体泵入第一分离装置101。具体的，第二泵送装置205可以将第一分离腔102中的液体泵送进入细胞培养仓202中，也可以将培养基储仓中的培养基泵送进入第一分离腔102中。
参考图5，细胞培养装置201中设有搅拌装置210，搅拌装置210包括轴212和设置在轴 212上的多层桨叶211，电机驱动轴212，带动桨叶211缓慢转动，通过顺时针和逆时针交替转动，可以在细胞培养仓202中形成湍流，有利于待培养的细胞获得充分的营养和氧气。多层桨叶211结构从低到高依次增加桨叶211的面积，从而可以带动越来越多的培养基运动，使得细胞培养仓202中细胞可以充分混匀。
另外，参考图4，本发明中，细胞培养仓202设置为阶梯状结构，确保在细胞体积小的情况下和细胞体积增大的情况下，细胞都可以进行培养。
细胞培养仓202中设有混合空气开口，也就是空气和二氧化碳接入开口209(95％的空气， 5％的二氧化碳)，也有葡萄糖/乳酸监测电极206、二氧化碳监测电极208。细胞培养仓202 上还有取样管道207，可以进行实时采样。本发明的全自动细胞培养系统可以通过监测培养基中葡萄糖、乳酸和/或PH值的变化进行自动化补液等操作，不仅可以大大节约人工，更为重要的是可以依据监测数值变化和现有培养基体积来动态计算补液量，使得待培养的细胞时刻处于最适合的细胞生长密度范围。
细胞培养仓202通过十字卡口紧扣到底座上，该底座上带有加热盘，通过与细胞培养仓 202密切接触，可以对细胞培养仓202进行加热，确保细胞培养仓202中的温度保持在36.5-37.5℃之间。
进一步的方案，所述转染单元包括转染原料输送管路301原料输送管路105，所述转染原料输送管路301原料输送管路105一端与培养单元连通；另一端为盲端，可配置为连通转染原料储仓；
优选的，包括多条转染原料输送管路301原料输送管路105，多条转染原料输送管路301 原料输送管路105的一端分别连通不同的转染原料储仓，另一端与第三管路302连通，所述第三管路302与细胞培养仓202连通，第三管路302上设有第三泵送装置303。如此，多种转染原料均可以通过第三泵送装置303输送至细胞培养仓202中。转染原料储仓可以包括病毒、蛋白、CD3/28磁珠袋等等，也可以为其他需要的原料储袋。
需要说明的是，本发明中，各种储仓，例如原料储仓、培养基储仓、转染原料储仓等等都为可拆卸的，可随时更换。在需要的时候，将适宜的储仓连接到系统管道中。
进一步的方案，所述收集单元包括第二分离装置401、生理盐水输送管路405和收集管路406；所述第二分离装置401具有第二分离腔402，所述第二分离腔402通过第四管路407 与细胞培养仓202连通，通过第五管路408与生理盐水输送管路405、收集管路406连通；
优选的，所述第四管路407上设有第四泵送装置409，第五管路408上设有第五泵送装置410；
第二分离装置401与第一分离装置101结构相同，具体的，所述第二分离装置401包括圆柱型的壳体，壳体内设有可上下运动的活塞120，活塞120内部中空并形成第二腔室403，活塞120朝向壳体底部的一端设有微孔滤膜121，所述微孔滤膜121下方的壳体内部空间形成第二分离腔402；
优选的，所述的第二分离装置401的壳体的外部套设有第二环形磁铁404，所述第二环形磁铁404可沿壳体上下运动；用于吸附磁珠。
优选的，所述第五管路408上设有第三环形磁铁411，用于吸附磁珠，避免磁珠进入收集单元。
进一步的方案，还包括废液回收单元，所述废液回收单元包括废液回收管路，所述第一分离装置101的第一腔室103中设有第一排出管路501，第一排出管路501的一端与微孔滤膜121之间具有间距，另一端与废液回收管路连通；所述第二分离装置401的第二腔室403中设有第二排出管路502，第二排出管路502的一端与微孔滤膜121之间具有间距，另一端与废液回收管路连通；
优选的，废液回收管路包括第一回收管路503和第二回收管路504，第一回收管路503 一端配置为连通废液回收仓，另一端与第二管路204连接，第一排出管路501一端与第二管路204连接。第一回收管路503与第二管路204的连接点为a点，第一排出管路501一端与第二管路204连接为b点，第二泵送装置205位于a点和b点这两个连接点之间的第二管路204上；如此，第二泵送装置205还可以将第一腔室103中的废液泵送至废液回收仓中，可以节省管路，节省泵送装置，简化结构。
第二回收管路504一端配置为连通废液回收仓，另一端与第四管路407连接，第二排出管路502的一端与第四管路407连接，第二回收管路504与第四管路407的连接点为c点，第二排出管路502一端与第四管路407连接点为d点，第四泵送装置409设置在c和d两个连接点之间的第四管路407上。如此，第四泵送装置409还可以将第二腔室403中的废液泵送至废液回收仓中，可以节省管路，节省泵送装置，简化结构。
需要指出的是，本发明的全自动细胞培养系统中的所有管路上均设有控制管路开启/关闭的控制阀，所述控制单元与控制阀、泵送装置电连接，控制其开启和关闭。如此，控制单元能够控制各条管路的开闭和泵送装置的开闭，并通过控制不同位置的控制阀和泵送装置的状态，自动完成各个细胞培养步骤，实现细胞培养的全自动化。
本发明中，全自动细胞培养系统采用独特的分离装置、微孔滤膜121、泵送装置和控制阀，可以实现对目标细胞的自动化洗涤与浓缩。
第一分离装置101和第二分离装置401是进行细胞洗涤和体积浓缩的关键部件，第一分离装置101的第一分离腔102中的血制品经过裂解红细胞后体积较大，在机械臂的牵引下，第一分离装置101的活塞120向下运动，由于活塞120是中空的，活塞120顶部覆盖有机械或者丝质微孔滤膜121，可以对超过微孔孔径的细胞起到阻碍和截留作用。裂解液中的红细胞碎片和小于微孔孔径的颗粒物质(包括未裂解完全的有核红细胞和成熟红细胞)可以透过，进入活塞120中的第一腔室103内。活塞120降落到接近管底时，微孔滤膜121上的管道可以将过滤后的裂解液在蠕动泵的作用下吸到废液袋中。然后活塞120在机械臂牵引下缓慢上移，清洗液(培养基)可以在蠕动泵的作用下缓缓流入第一分离腔102中，从而稀释未滤过的细胞悬液。随后多次控制活塞120上下运动，可以对第一分离腔102中的细胞起到洗涤和浓缩作用。
参考图2，以第一分离装置101为例展示活塞120运动的不同状态，对于对细胞起到洗涤和浓缩作用。工作过程具体如下：活塞120向上运动至最高位置，向微孔滤膜121下的第一分离腔102中输满液体(a)，然后活塞120向下运动，部分液体通过微孔滤膜121向上进入第一腔室103中(b)；活塞120继续向下运动至接近底部(c)；第一腔室103中的液体经过第一排出管路501排出(d)；随后活塞120向上运动至最高处(e)；然后再向第一分离腔102中输满洗涤液(f)，按照a-e的过程重复执行，如f-j，如此，达到洗涤和浓缩第一分离腔102中细胞的目的。
参考图3，微孔滤膜121采用金属或者非金属筛网或者丝网，网孔大小1um-10um左右，一般取固定的均匀网孔(比如3um或者5um)，可以对流动液体中大于上述网孔直径的细胞起到截留作用。本发明中，在第一分离装置101和第二分离装置401的活塞120朝向底部的一端覆盖均匀孔径大小的微孔滤膜121，通过机械手或者其它装置控制活塞120上下运动，可以对第一分离腔102或第二分离腔402中的细胞起到过滤作用，不会对其中的细胞产生损伤。根据所需过滤细胞的多少，微孔滤膜121的直径可以低至4mm，也可以高至120mm或者更高，从而可以满足对不同细胞数量过滤的需求。
微孔滤膜121依据需要分离的细胞类型大小进行设计，一般而言对于淋巴细胞，5um的滤膜可以很好的过滤。为防止微孔滤膜121局部孔径不标准，可以设计成双层滤膜，在通透压力不太大的情况下，双层滤膜更为可靠。
泵送装置，包括第一至第五泵送装置410，为蠕动泵，可以驱动管道中的液体定向流动，可以顺时针或者逆时针方向转动，在控制单元的控制下通过不同的旋转方向改变泵送方向，从而可以集成管路，节省成本和占用空间。
各个管路上均设有控制阀，控制阀为电控制的开关，通过挤压管道起到开放和关闭管道中的液体流动作用。在控制单元的控制下，不同管路上的控制阀开启或者闭合，可以达到不同的输送目的。
另外，本发明以CRAT细胞的全自动培养过程为例，全自动细胞培养系统的结构如图1 所示，其中，阀门即前述的控制阀，泵即前述的泵送装置，泵A～E分别为第一至第五泵送装置；具体全自动培养步骤如下：
1.一次性采血袋、裂解液袋、CD3磁珠袋、废液袋、培养基袋、蛋白袋、病毒袋、CD3/28 磁珠袋、生理盐水袋、CART细胞袋等均可以在需要时安装连接到系统管道上，也可以从系统管道的末端取下。管道的连接端为带有滤器(0.22um)的盲端，便于后续各种袋子的连接；
2.打开电脑软件(最好有触屏液晶显示，通过动画提示各项操作)，软件自检并提示版本信息等，记录日志文件，并提示“开始”；
3.软件提示：安装管道，此时所有阀门均处于开启状态，手动安装好各处管道并进行位置调整，确切无误后点击下一步，并形成日志文件；
4.阀门测试：依次开关各处阀门(1～20号阀门)，显示器中显示每个阀门的开关状态，通过的颜色提示，并形成日志文件；
5.泵测试：依次转动不同的泵(A～E)，正转和倒转，并形成日志文件；
6.管道密闭性测试(同时也是对阀门和泵的二次测试)：所有阀门关闭，依次正向和负向转动泵，通过管道的压力感受器确定压力上升下降和维持压力，提示管道的密闭性没有问题，并形成日志文件；
7.使用前需要接管机将一次性采血袋(已经采集了所需的血液，最大处理的血量为第一分离装置101中活塞120全开的体积减去裂解液的体积，约100～200ml)与管道系统相连，同时将CD3磁珠袋也与管道系统相连接。而添加病毒、蛋白、CD3/28磁珠袋的四相管暂时不与管道系统相连；
8.废液袋(3L)本身连接在管道系统中，通过刺入式注射塑料针将裂解液袋(1个接头)和培养基袋(2L)与管道系统相连接。由于裂解液和培养基等均为液体且其中没有大于0.22um的颗粒，因此管道上安装0.22um的滤膜，防止细菌侵入；
9.在液晶面板上录入相应的各种信息参数，记录到日志文件中；
10.所有20个阀门全部处于关闭状态，进行二次阀门状态检测，并形成日志文件；
11.第一分离装置101和第二分离装置401状态检测，活塞120均被拉伸至最高处，并形成日志文件；
12.阀门1和3开启，泵A顺时针旋转(具体时间根据手动输入的患者参数中采血量进行调整)，使得采血袋中的血液流入到第一分离装置101中，泵A停止旋转蠕动。第一分离装置101和第二分离装置401中均带有0.22um滤膜气阀，便于释放其中的压力，同时确保出厂前环氧乙烷灭菌的效果；
13.上述步骤后采血袋中可能剩有非常少量血液，使用封口机将采血袋从阀门1上部离断，并送细菌培养；
14.裂解步骤：阀门1和3关闭(此时所有阀门均处于关闭状态)，然后阀门2和3打开，泵 A顺时针旋转(具体时间根据血量进行调整)，使得裂解液流入到第一分离装置101中，对采集的外周血进行裂解红细胞操作。泵A停止旋转后，阀门2和3关闭；
15.裂解8分钟后，阀门8和5先后开放，泵B逆时针旋转(泵静止状态下管道是不通的，从而防止液体在势能作用下自由流动)，具体使用的液体量根据流速来计算，使得第一分离装置101的第一分离腔102中液体充满，然后泵B停止旋转，阀门8和5关闭；
16.第一分离装置101的活塞120(底部为圆形底)在机械臂作用下水平缓缓下降，至距离底部2mm处停止；
17.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜121 2mm处，随着活塞120运动而运动。阀门6和7打开，泵B顺时针旋转，将微孔滤膜121 上方第一腔室103中的液体全部吸到废液袋中，然后泵B停止旋转，阀门6和7关闭；
18.第一分离装置101在机械臂作用下水平缓缓上升至最高处，至距离顶部2cm处停止；
19.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜121 2mm处，随着活塞120运动而运动。阀门5和8打开，泵B逆时针旋转，将微孔滤膜121 下部充满，然后泵B停止旋转，阀门5和8关闭；
20.第一分离装置101在机械臂作用下水平缓缓下降，至距离底部2mm处停止；
21.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜1212cm 处，随着活塞120运动而运动。阀门6和7打开，泵B顺时针旋转，将微孔滤膜121上的液体全部吸到废液袋中，然后泵B停止旋转，阀门6和7关闭；
22.第一分离装置101在机械臂作用下水平缓缓上升至最高处，至距离顶部2cm处停止；
23.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜121 2mm处，随着活塞120运动而运动。阀门5和8打开，泵B逆时针旋转，将微孔滤膜121 下部充满，然后泵B停止旋转，阀门5和8关闭；
24.第一分离装置101在机械臂作用下水平缓缓下降，至距离底部2mm处停止；
25.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜121 2mm处，随着活塞120运动而运动。阀门6和7打开，泵B顺时针旋转，将微孔滤膜121 上的液体全部吸到废液袋中，然后泵B停止旋转，阀门6和7关闭；
26.第一分离装置101在机械臂作用下水平缓缓上升至最高处，至距离顶部2cm处停止；
27.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜 1212mm处，随着活塞120运动而运动。阀门5和8打开，泵B逆时针旋转，将微孔滤膜121下部充满，然后泵B停止旋转，阀门5和8关闭；
28.第一分离装置101在机械臂作用下水平缓缓下降，至距离底部2mm处停止；
29.第一分离装置101的活塞120中，第一排出管路501的末端始终位于距离微孔滤膜 1212mm处，随着活塞120运动而运动。阀门6和7打开，泵B顺时针旋转，将微孔滤膜121上的液体全部吸到废液袋中，然后泵B停止旋转，阀门6和7关闭；
30.上述18～21、22～25和26～29为清洗步骤，使得第一分离装置101中的细胞被充分洗涤，去除红细胞碎片、血红蛋白和裂解液的残留，三次洗涤使得上述残留99.9％被清除；
31.CD3磁珠袋用手充分摇匀(磁珠放到5ml培养基中，含有100ul CD3磁珠和100ulCD3/28 磁珠，CD3磁珠袋如果可以机械振荡摇匀更好)，阀门4打开，泵A顺时针旋转，CD3 磁珠流入到第一分离装置101的第一分离腔102中，泵A停止旋转，阀门4关闭；
32.30分钟后，第一环形磁铁104在机械臂作用下上升到第一分离装置101底部向上5mm处后停止；
33.磁铁吸附2分钟后，阀门5和7打开，泵B顺时针旋转，将微孔滤膜121下未予磁珠结合的液体全部吸到废液袋中，然后泵B停止旋转，阀门5和7关闭；
34.第一环形磁铁104在机械臂作用下，下降到第一分离装置101底部向下远处后停止；
35.阀门5和8打开，泵B逆时针旋转，向微孔滤膜121下部充10ml新鲜培养基，然后泵B 停止旋转，阀门5和8关闭；
36.阀门5和14开放，泵B顺时针旋转，使得第一分离腔102中的细胞被吸入到细胞培养装置201中的底层细胞培养仓202中，然后阀门5和14关闭，泵B停止旋转；
37.阀门8和5开放，泵B逆时针旋转，将大约5ml新鲜培养基注入到第一分离装置101中，然后阀门8和5关闭，泵B停止旋转；
38.阀门5和14开放，泵B顺时针旋转，使得第一分离装置101中的残留细胞被吸入到细胞培养装置201中的底层细胞培养仓202中，然后阀门5和14关闭，泵B停止旋转；
39.底层细胞培养仓202中继续培养48小时；
40.取样器取1ml细胞，外送检测(显微镜观察、去除磁珠和计数，确定细胞培养仓202中的T细胞总数，决定后续蛋白、病毒的使用量)；
41.接管机将蛋白、病毒等四个袋子连接到管道系统中；
42.阀门9开放，泵C顺时针旋转(可以根据细胞体积决定旋转时间)，蛋白被泵入到细胞培养仓202中，然后阀门9关闭，泵C停止旋转；
43.30分钟后，阀门10开放，泵C顺时针旋转(可以根据细胞体积决定旋转时间)，病毒被泵入到细胞培养仓202中，然后阀门10关闭，泵C停止旋转；
44.上述两部由泵C的控制蛋白和病毒用量(比如：2*10^7/20ml，每100万细胞泵入1ml病毒)，因此蛋白和病毒需要过量到相同水平，去除每次制备的繁琐工作；
45.每4小时依次培养基中乳酸和葡萄糖测定，根据测定数值自动计算添加的培养基用量(具体公式需要测试，确保细胞密度不低于8*10^5/ml)，同时每日补充CD3/28磁珠(阀门 11控制开关)，具体补充量依赖于细胞数量；
46.阀门12为后备阀门，便于其它试剂接入；
47.细胞扩增中取样进行转染效率和细胞杀伤毒性的检测；
48.细胞培养为运送培养模式，培养容器可以旋转或者有旋转叶片驱动液体流动形成轻微的湍流，从而使得细胞可以充分接触氧气和养分，细胞之间的通讯信号联系更为容易；
49.细胞增殖到一定程度后，根据转染效率(可以录入到软件中，据此可以每日直观看到CART 细胞的数量变化)；
50.细胞收集：手工或者远程触发细胞收集步骤，阀门15和18开放，泵D顺时针旋转，将细胞培养仓202中的细胞泵入到第二分离装置401的第二分离腔402中，然后阀门15和18关闭，泵D停止旋转；
51.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下降低到距离管底1cm处停止运动；
52.第二环形磁铁404在机械臂的作用下上升到距离第二分离腔402的管底2cm处；
53.阀门17和16开放，泵D逆时针旋转，第二分离装置401中的微孔滤膜121上方第二腔室403中的液体被吸到废液袋中，然后阀门17和16关闭，泵D停止旋转；
54.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下上升到距离管口最高位置处；
55.阀门19开放，泵E逆时针旋转，将500ml生理盐水注入到第二分离腔402中，然后阀门19关闭，泵E停止旋转；
56.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下降低到距离管底2cm处停止运动；
57.阀门17和16开放，泵D逆时针旋转，第二分离装置401中的微孔滤膜121上方第二腔室403中的液体被吸到废液袋中，然后阀门17和16关闭，泵D停止旋转；
58.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下上升到距离管口最高位置处；
59.阀门19开放，泵E逆时针旋转，将500ml生理盐水注入到第二分离腔402中，然后阀门19关闭，泵E停止旋转；
60.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下降低到距离管底2cm处停止运动；
61.阀门17和16开放，泵D逆时针旋转，第二分离装置401中的微孔滤膜121上方的第二腔室403中的液体被吸到废液袋中，然后阀门17和16关闭，泵D停止旋转；
62.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下上升到距离管口最高位置处；
63.阀门19开放，泵E逆时针旋转，将500ml生理盐水注入到第二分离腔402中，然后阀门 19关闭，泵E停止旋转；
64.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下降低到距离管底2cm处停止运动；
65.阀门17和16开放，泵D逆时针旋转，第二分离装置401中的微孔滤膜121上方的第二腔室403中的液体被吸到废液袋中，然后阀门17和16关闭，泵D停止旋转；
66.上述50～53、54～57、58～61、62～65为洗涤步骤，反复清洗3次，可以去除99.9％的杂质成分；
67.第二分离装置401中活塞120在机械臂作用下上升到距离管口最高位置处；
68.阀门19开放，泵E逆时针旋转，将100ml生理盐水注入到第二分离腔402中，然后阀门 19关闭，泵E停止旋转；
69.阀门20开放，泵E顺时针旋转，将第二分离腔402中的细胞缓慢转入CART细胞袋中，中间有第三环形磁铁411进行二次磁珠去除，阀门20关系，泵E停止旋转；
70.封口机将CART袋从管道系统中取下，用于病人回输；
71.留置多余备份样品，可以回收需要的CART细胞后(比如50ml，可以手动决定留置多少，然后系统暂停；取下CART袋后接管机连接冻存袋，相同步骤将剩余细胞回收到冻存袋中，详细记录冻存细胞信息；
72.拆除所有一次性管道和分离装置，导出数据。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种全自动细胞培养系统，其特征在于，包括：
细胞前处理单元，对采集物或外周血进行处理，获得目标细胞；
培养单元，用于对获得的目标细胞进行扩增培养以及对转染后的目标细胞再次扩增培养；
转染单元，用于对目标细胞进行转染；
收集单元，用于收集扩增培养后的转染细胞；
控制单元，用于接收、存储信息，并根据存储程序控制各单元的动作。
2.根据权利要求1所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，所述细胞前处理单元包括第一分离装置和原料输送管路；所述第一分离装置具有第一分离腔，所述第一分离腔通过第一管路与原料输送管路连通；
优选的，所述的原料输送管路一端与第一管路连通，另一端为盲端，可配置为连接原料储仓；更优选的，另一端为连接过滤器的盲端；
优选的，所述第一管路上设有第一泵送装置，用于将原料输送管路中的原料输送至第一分离腔中。
3.根据权利要求2所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，所述第一分离装置包括壳体，壳体内设有可上下运动的活塞，活塞内部中空并形成第一腔室，活塞朝向壳体底部的一端设有微孔滤膜，所述微孔滤膜下方的壳体内部空间形成第一分离腔；
优选的，所述的第一分离装置的壳体的外部套设有第一环形磁铁，所述第一环形磁铁可沿壳体上下运动。
4.根据权利要求2或3所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，所述培养单元包括细胞培养装置和培养基输送管路，所述细胞培养装置包括细胞培养仓，所述细胞培养仓通过第二管路与第一分离腔连通，所述培养基输送管路一端为盲端，可配置为连通培养基储仓，另一端分别与细胞培养仓、第二管路连通；
优选的，所述第二管路上设有第二泵送装置，所述第二泵送装置将第一分离装置中的液体泵出，或将液体泵入第一分离装置。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，所述转染单元包括转染原料输送管路，所述转染原料输送管路一端与培养单元连通，另一端为盲端，可配置为连通转染原料储仓；
优选的，包括多条转染原料输送管路，多条转染原料输送管路的一端分别连通不同的转染原料储仓，另一端与第三管路连通，所述第三管路与细胞培养仓连通，第三管路上设有第三泵送装置。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，所述收集单元包括第二分离装置、生理盐水输送管路和收集管路；所述第二分离装置具有第二分离腔，所述第二分离腔通过第四管路与培养单元连通，通过第五管路与生理盐水输送管路、收集管路连通；
优选的，所述第四管路上设有第四泵送装置，第五管路上设有第五泵送装置；
优选的，所述第二分离装置包括壳体，壳体内设有可上下运动的活塞，活塞内部中空并形成第二腔室，活塞朝向壳体底部的一端设有微孔滤膜，所述微孔滤膜下方的壳体内部空间形成第二分离腔；
优选的，所述的第二分离装置的壳体的外部套设有第二环形磁铁，所述第二环形磁铁可沿壳体上下运动；
优选的，所述第五管路上设有第三环形磁铁。
7.根据权利要求6所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，还包括废液回收单元，所述废液回收单元包括废液回收管路，所述第一分离装置的第一腔室中设有第一排出管路，第一排出管路的一端与微孔滤膜之间具有间距，另一端与废液回收管路连通；所述第二分离装置的第二腔室中设有第二排出管路，第二排出管路的一端与微孔滤膜之间具有间距，另一端与废液回收管路连通；
优选的，废液回收管路包括第一回收管路和第二回收管路，第一回收管路一端配置为连通废液回收仓，另一端与第二管路连接，第一排出管路也与第二管路连接，第二泵送装置位于两个连接点之间的第二管路上；第二回收管路一端配置为连通废液回收仓，另一端与第四管路连接，第二排出管路也与第四管路连接，第四泵送装置设置在两个连接点之间的第四管路上。
8.根据权利要求1-9任意一项所述的一种全自动细胞培养系统，其特征在于，全自动细胞培养系统中的所有管路上均设有控制管路开启/关闭的控制阀，所述控制单元与控制阀、泵送装置电连接，控制其开启和关闭。
9.一种如权利要求1-8任意一项所述的全自动细胞培养系统的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)控制单元控制细胞前处理单元对采集物或外周血进行分离、分选，获得目标细胞；
(2)将目标细胞输送至培养单元，对获得的目标细胞进行扩增培养；
(3)控制单元控制转染单元对目标细胞进行转染，并控制培养单元再次进行扩增培养；
(4)控制单元控制收集单元收集扩增培养后的转染细胞。
10.根据权利要求9所述的全自动细胞培养系统的培养方法，其特征在于，包括：
(1)血袋中的血液通过第一管路流入第一分离腔，裂解液袋中的裂解液通过第一管路流入第一分离腔中，裂解细胞；
(2)裂解完成后，培养基储仓中的培养基流入第一分离腔中，第一分离装置的活塞下降至距离底部一定距离停止，部分液体经微孔滤膜进入第一腔室，将第一腔室中的液体泵送至废液回收仓，活塞上升；重复上述步骤，清洗三次；
(3)CD3磁珠袋中的CD3磁珠通过第一管路流入第一分离腔，维持T时间后，第一环形磁铁向上运动至离底部m距离时停止，吸附CD3磁珠，微孔滤膜下未与磁珠结合的液体输送至废液回收仓；第一环形磁铁下降至第一分离腔底部以下；
(4)培养基储仓中的培养基流入第一分离腔中，得到的液体输送至细胞培养仓中进行扩增培养，取样检测；
(5)转染原料储仓中的蛋白、病毒按照设定时间依次经过第三管路进入细胞培养仓中，进行转染后，继续培养；
(6)细胞增殖到一定程度后，将细胞培养仓中的细胞泵送至第二分离腔中，第二分离装置的活塞下降至距离底部n，第二环形磁铁上升至距离底部h处吸附磁珠；第二腔室中的液体输送至废液回收仓；活塞再上升至壳体内最高处；向第二分离腔中输入生理盐水，活塞再下降，重复上述步骤洗涤3次后，活塞升至最高处；输入生理盐水，将细胞液输送至收集管路，得到培养的细胞。
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| CN117089458A (zh) * | 2023-10-19 | 2023-11-21 | 南京溯远基因科技有限公司 | 一种自动化细胞培养、基因编辑、细胞分选和分装的装置及方法 |
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