CN113817863A - 一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记、引物及应用，白菜类作物是一种常见的以叶片/叶球、花茎/花序等为主要食用部位的蔬菜作物，其中亮绿花茎的薹用白菜在我国蔬菜供应中占有重要地位。本发明分析了大白菜自交系‘06‑247’与‘He102’的基因组序列，发现了两者之间存在较多变异，开发了A09位点紧密连锁的InDel标记，利用该标记检测了‘06‑247’与‘He102’的衍生群体，明确了群体中各株系在该位点的基因型。该标记的开发有利于高效的筛选具有亮绿性状的后代，应用于亮绿白菜臺种质标记辅助选育工作，具有良好的效果。

Description

一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记、引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体为一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记，检测该分子标记的引物序列及在农作物选育方面的应用。

背景技术

大白菜(Brassica rapa L.ssp.Pekinensis)属于十字花科芸薹属蔬菜作物，在我国蔬菜生产和供应中占有重要地位。亮绿性状是一种表皮蜡质缺陷突变体，是花茎和叶片等组织的表皮缺乏蜡质所致。对于大白菜等叶用蔬菜作物特别是白菜薹品种，蜡粉是重要的商品性状，例如市场更青睐无蜡粉薹叶和亮绿花茎的薹用白菜。

目前，拟南芥等植物中蜡粉形成的生理生化和分子调控机制研究已经取得了一定进展。植物表皮蜡粉在表皮细胞内合成，其过程主要包括：脂肪酸在质体中从头合成C16和C18脂肪酸，随后转运到内质网上延伸为C20～C36的超长链脂肪酸，进一步通过醇合成途径和烷烃合成途径合成不同的蜡粉组分。CER1、CER2、CER3、MAH1、KCR1、RST1、WSD1、KCS和CYTB5等基因参与拟南芥蜡粉生物合成的不同途径(Zhao&Kunst，2016；Ni et al.，2018)。蜡粉合成后通过一系列转运蛋白经细胞膜和细胞壁外泌至角质层，主要有ACBP1、ABCG11、ABCG12、LTPG1、LTPG2和GNL1等基因参与(Kim，2012；Xue et al.，2014)。另外，WIN1/SHINE1、SHINE2、SHINE3、MYB30、MYB94、MYB96、DEWAX、WAR6/RDR6、HUB1等基因在转录水平、转录后水平或翻译水平调控蜡粉合成过程(Lee et al.，2016；Park et al.，2016)。

芸薹属作物无蜡粉亮绿性状遗传规律较为复杂，不同群体间差异较大，且由不同的基因控制。本研究以大白菜自交系‘06-247’(无蜡粉材料)和‘He102’(无蜡粉材料)为亲本，构建了一个蜡粉变化有关的重组自交系(RILs)群体。该重组自交系群体的双亲均为无蜡粉材料，其F2代无蜡粉/有蜡粉单株的分离比为9/7，表明控制群体蜡粉性状是两对显性基因，加性效应分析表明两个基因分别来自不同的亲本。通过对双亲进行重测序和150个RILs进行简化基因组测序，开发了大量的InDels标记，构建了高密度的遗传连锁图谱(Liuet al.，2019)，共鉴定到2个效应值较大的基因。其中一个基因与Zhang等(2013)定位的BrWAX1相同，即与拟南芥蜡粉合成基因CER2的同源基因Bra013809，位于A01染色体。本研究开发了与另一个效应值较大的基因(位于A09染色体)紧密连锁的InDel标记，该标记的应用不仅为大白菜亮绿性状另一关键基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育亮绿大白菜新品种提供了高效途径。

发明内容

为了解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种与大白菜亮绿性状基因CER2突变相关的InDel标记、引物及应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明第一方面，提供一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记，所述InDel标记如SEQID NO:3和SEQID NO:4所示。

本发明第二方面，提供一种与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物，所述检测引物如下：

正向引物：CrCATTTTTGAACAAGGAGTAAACC；

反向引物：CTTATCAATCAATAAAACGCCTCTG。

进一步地，所述引物用于PCR扩增。

本发明第三方面，第一方面所述与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记和/或第二方面所述与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物在农作物选育方面的应用。

进一步地，所述应用包括通过所述检测引物或分子标记筛选大白菜显性亲本材料。

进一步地，所述应用包括将所述检测引物用于制备检测试剂盒。

进一步地，所述应用包括将亮绿性状作为供体材料对其他十字花科芸薹属作物进行新品种选育。

进一步地，所述新品种选育包括筛选显性亮绿大白菜作为亲本材料与其他芸薹属作物进行杂交。

本发明第四方面，提供一种大白菜显性亮绿品种选育方法，所述选育方法包括采用第二方面所述扩增引物对亮绿性状进行检测，筛选获得显性纯合个体作为亲本进行育种。

以上一个或多个技术方案的有益效果如下：

本发明分析了亲本‘06-247’和‘He102’的A09位点上下游的核酸序列，开发了大白菜亮绿性状关键基因紧密连锁的InDel标记，利用该标记检测重组自交系群体中的不同株系，明确了这些株系在该位点的基因型，通过相应的分子标记对该功能基因表达情况进行检测。该InDel标记可以对群体自交后代进行标记辅助选择，大大加速亮绿大白菜新品种的育种效率。

附图说明

图1是本发明实施例1中‘He102’相比‘06-247’在A09位点侧翼发生插入突变的示意图；

图2是本发明实施例1中InDel标记的开发电泳条带图；

其中，M:50bp ladder DNA分子量标准；P1：‘06-247’扩增产物；P2：‘He102’扩增产物。

图3是本发明实施例1中利用InDel标记对大白菜重组自交系部分群体检测的电泳条带图；

其中，1-60为重组自交系部分单株，M:50bp ladder DNA分子量标准；P1：‘06-247’扩增产物；P2：‘He102’扩增产物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、突变株的获得

大白菜自交系‘06-247’(无蜡粉材料)和‘He102’(无蜡粉材料)是山东省农业科学院大白菜课题组的育种材料，多年的田间性状调查于山东省农业科学院核心实验基地(济南)进行。

2、DNA提取

用TPS试剂提取、自动研磨仪研磨。TPS试剂配方：100mmol/L Tris-HCl，1mol/LKCl，10mmol/LEDTA，pH 8.0，高压灭菌。剪取2～3cm²的幼嫩叶片置于2mL的离心管中，加入800μL TPS试剂，再加2～3粒灭菌的钢珠(直径5mm)，于自动研磨仪上5000r/min，震荡10s，65℃恒温箱保温30～60min，冷却后4℃、12000r/min离心10min；上清转移至新的离心管中，加入等体积氯仿颠倒混匀以去除杂蛋白，随后的操作同CTAB法提取DNA。DNA沉淀用100μL、10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)溶解后，-20℃保存备用。

3、引物设计

根据双亲重测序结果，比较亲本‘He102’相比‘06-247’在在A09位点侧翼区段的插入/缺失变异，如图1所示：‘He102’相比‘06-247’在A09位点侧翼发生了发生了1处7bp的缺失突变；

用Primer Premier 5.0软件在差异位点两侧保守区设计引物；正反向引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示：

检测引物如下：

SEQ ID NO:1：CATAGGATTGAACAAATCCAGAAAC

SEQ ID NO:2：CTGATTCTTGATGAACACTGACAAT。

4、PCR扩增及检测

PCR扩增采用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的2×Taq PCR Green Mix(PER007-1/PER007-2)。

PCR反应体系的配制：2×PCR mix 10μl,10pmol/L的正反向引物各1μl、20-50μg/L模板DNA 1μl、ddH₂O 7μl，总体积20μl。

PCR反应条件为94℃、5min，94℃、20sec，59℃、20sec，72℃、10sec，30次循环，最终72℃延伸5min。PCR扩增产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后银染显色，智能手机拍照。电泳结果如图3所示。‘06-247’扩增产物片段大小129bp，序列如SEQ IDNO:3所示，‘He102’扩增产物片段大小为136bp，序列如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:3

CACATTTTTGAACAAGGAGTAAACCTCCTGAAGGTCCGAACTATCTGCGTAATCACAAGAAATCGAAAAAGAGATAAATAACAAGATATCGATAGAATGTCGCTCAGAGGCGTTTTATTGATTGATAAG

SEQ ID NO:4

CACATTTTTGAACAAGGAGTAAACCTAACTTTCCCTGAAGGTCCGAACTATCTGCGTAATCACAAGAAATCGAAAAAGAGATAAATAACAAGATATCGATAGAATGTCGCTCAGAGGCGTTTTATTGATTGATAAG

5、重组自交系群体构建及重组自交系验证

以06-247为母本、He102为父本，盛花期母本人工挑蕾去雄、取父本花粉授粉后套袋使结荚，收获F1种子。所得F1代于蕾期人工辅助授粉使自交结实收获F2种子。自F2代开始单粒传至F7代，每个F7株系分别育5株苗，用Tris碱和氯化钾盐(potassium chloridesalt,TPS)试剂于自动研磨仪上提取DNA，用筛选到的InDels标记进行检测，记录杂合位点及相关单株编号，用于后续研究。利用InDel标记对大白菜重组自交系部分群体检测的电泳条带图，参照图3所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东省农业科学院

<120> 一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记、引物及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

crcatttttg aacaaggagt aaacc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttatcaatc aataaaacgc ctctg 25

<210> 3

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacatttttg aacaaggagt aaacctcctg aaggtccgaa ctatctgcgt aatcacaaga 60

aatcgaaaaa gagataaata acaagatatc gatagaatgt cgctcagagg cgttttattg 120

attgataag 129

<210> 4

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacatttttg aacaaggagt aaacctaact ttccctgaag gtccgaacta tctgcgtaat 60

cacaagaaat cgaaaaagag ataaataaca agatatcgat agaatgtcgc tcagaggcgt 120

tttattgatt gataag 136

Claims (9)

1.一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记，其特征在于，所述InDel标记如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

2.一种与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物，其特征在于，所述检测引物如下：

正向引物：CrCATTTTTGAACAAGGAGTAAACC；

反向引物：CTTATCAATCAATAAAACGCCTCTG。

3.根据权利要求2所述的一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记的检测引物，其特征在于，所述引物用于PCR扩增。

4.权利要求1所述与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记和/或权利要求2所述与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物在农作物选育方面的应用。

5.如权利要求4所述在农作物选育方面的应用，其特征在于，所述应用包括通过所述检测引物或分子标记筛选大白菜显性亲本材料。

6.如权利要求4所述在农作物选育方面的应用，其特征在于，所述应用包括将所述检测引物用于制备检测试剂盒。

7.如权利要求4所述在农作物选育方面的应用，其特征在于，所述应用包括将亮绿性状作为供体材料对其他十字花科芸薹属作物进行新品种选育。

8.如权利要求7所述在农作物选育方面的应用，其特征在于，所述新品种选育包括筛选显性亮绿大白菜作为亲本材料与其他芸薹属作物进行杂交。

9.一种大白菜显性亮绿品种选育方法，其特征在于，所述选育方法包括采用权利要求3所述扩增引物对亮绿性状基因型进行检测，筛选获得显性纯合个体作为亲本进行育种。

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